0〇A (12) 特許協力条約に基づいて公開された国際出願 (19;pdf

〇
A
0
(12) 特許協力条約に基づいて公開された国際出願
(19)
世界知的所有権機関
国際事務局
(43) 国際公開曰
2011 年 4 月 28 日（
28.04.2011)
(51)
国際特許分類：
G01N 33/566 (2006.01)
7/
7 (2006.01)
C07K 14/435 (2006.01)
(72)
(7 5 )
C12N 15/09 (2006.01)
G01N 33/15 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01)
(21)
国際出願番号：
(22)
国際出願日：
(25)
国際出願の言語：
日本語
(26)
国際公開の言語：
日本語
(30)
優先権データ：
特願
(71)
PCT/JP20 10/068272
2010
2009-241290
200
年
年
10
10
月
18
曰（18. 10.2010)
月 20 曰（20. 10.2009)
JP
出願人（
米国を除く全ての指定国について）
：国
立大学法人東工業大学 (Tokyo Institute of Tech
nology) [JP/JP]; T 1528550 東京都目黒区大岡山 2
2 Tokyo (JP). 藤本製薬株式含社 (Fujimoto Pharmaceutical
Corporation)
[JP/JP]; T 5808503
1 丁目 3 番 4 0 号 Osaka
大阪府松原巿西大塚
(JP)-
発明者；および
発明者 / 出願人（
米国に？いてのみ )：半田宏
(HAND ん Hirosh り[JP/JP]; 〒2268503 神奈川県横浜
巿緑区長津田町 4 2 5 9
国立大学法人東京
工業大学内 Kanagawa (JP). 安藤秀樹 (ANDO,
Hideki) [JP/JP]; 〒2268503 神奈川県椟浜巿緑区長
津田町 4 2 5 9
国立大学法人東京工業大学
内 Kanagawa (JP). 伊藤
拓水（
ITOH,
Takumi)
[JP/JP]; 〒2268503 神奈川県横浜巿緑区長津田町
国立大学法人東京工業大学内 Kana
4 2 5 9
健太郎（
gawa ( JP) . 堀田
HOTTA,
Kentaro) [JP/JP] ；
〒2268503 神奈川県横浜巿緑区長津田町 4 2 5
国立大学法人東《工業大学内 Kanagawa
9
(JP)-
(74)
代理人：
野村健一，外 (NOMURA, Kenichi et aL);
〒2210835 神奈川県横浜巿神奈川区鶴屋町 3 丁
目 3 0 番の 1 農機会館 4 階 Kanagawa (JP).
(81)
指定国（
表示のない限り、全ての種類の国内保
護が可肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO,
CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
続葉有]
(54) Title:
(54)
SCREENING
METHOD
UTILIZING
THALIDOMIDE-TARGETING
FACTOR
発明の名称：
サリドマイド標的因子を利用したスクリーニング方法
[図
纖 .
嚼
(57) Abstract:
Disclosed i s a means for developing a compound which has n o teratogenicity while retaining a useful activity.
Specifically disclosed i s a method for screening for a non-teratogenic substance, which i s characterized by comprising: bringing
each of test substances into contact with cerebron or a fragment thereof; evaluating the bindability of the test substances to cere
bron or the fragment thereof; and selecting a test substance that does not bind t o cereblon or the fragment thereof or a test sub-
要約：有用な作用を保持しつつ、催奇性を除去した化合物を開発する手段を提供することを目的と
して、被験物質をセレブロンもしくはその断片と接触させ、被験物質のセレブロンもしくはその断片に
対する結合性を評価し、セレブロンもしくはその断片と結合しない被験物質、又はセレブロンもしくは
その断片との結合性がサリドマイドょリも低い被験物質を選択することを特徴とする非催奇性物質のス
クリーニング方法を提供する。
(57)
GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS,
JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW,
MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PE, PG, PH,
PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,
SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,
VC, VN, ZA, ZM, ZW.
(84)
指定国（
表示のない限り、全ての種類の広域保
言
蒦が可肯 ) : ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユーラシア
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ョ一ロッ/ く
(AL,
GB,
NL,
(BF,
NE,
AT, BE, BG,
GR, HR, HU,
NO, PL, PT,
BJ, CF, CG,
SN, TD, TG).
CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR,
IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT,
RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI
CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR,
添付公開書類：
一
一
国際調査報告（
条約第 2 1 条(3))
明細書の別個の部分として表した配列リスト
(規則 5.2(a))
明
発明の名称
細
書
：
サリドマイド標的因子を利用したスクリーニング方法
技術分野
[0001
]
本発明は、サリドマイド標的因子であるセレブロン
（cereb l o n ：GRBN と略
記することがある。）またはその断片を利用した非催奇性物質、例えば、医
薬、医薬品添加物、食品、食品添加物、特に、非催奇性サリドマイド誘導体
のスクリーニング方法及びサリドマイドのアンタゴニス卜のスクリーニング
方法に関する。また、本発明は、サリドマイドとの結合性は低いが、ュビキ
チンリガ一ゼ複合体の構成因子としての機能は保持する変異型 GRBN 、それを
コードする核酸、及びその核酸を導入し、発現させた非ヒト動物に関する。
背景技術
[0002]
1 950 年代後半から 6 0 年代始めにかけて、サリドマイドは鎮静剤として 4 0 を
超える国で販売され、またそれはしばしば妊娠中の女性のつわり防止のため
に処方された。サリドマイドに催奇性があるということが顕著化され、その
使用が停止されるまでに死産を含めると数千〜 1 万人を超える奇形（形態形成
障害）が生じたと推定されている
（引用文献 1-3)
。妊娠中 3-8 週目の女性が
サリドマイドを服用すると、胎児にサリドマイド胎芽病と呼ばれる四肢、耳
、心臓、そして消化器官における形態形成障害を引き起こす
。中でも四肢
（引用文献 1-3)
耳の頻度は著しい。フォコメリア（phocome l i a ) として知られ
る四肢の異常は、腕や足が短くなることに特徵づけられ、また耳の異常につ
いては無耳症や小耳症、難聴に代表される。その原因解明において相当な努
力がなされているにもかかわらず、この発生異常についてわかっていること
はわずかである。これまでの研究によりサリドマイドが酸化ストレス誘導や
血管新生阻害効果を持っていることがわかっており、それは催奇性の原因と
してありうるものである
（引用文献 4-5)
。しかしながら、いくつかの重要な
問いが残されている。すなわち、いかなる分子が直接の標的であり、そして
どのようにしてその標的因子は催奇性を担うのかである。
ところで、ヒトの軽度精神遅延の原因候補因子として GRBN というタンパク
[0003]
質が知られている（非特許文献 1 、引用文献 1 1 )
i n 1 (DDB1 ) というタンパク質と結合することも報告され
d DNA B i n d i n g prote
ているが
。このタンパク質は、 Damage
（非特許文献 2 、引用文献 12 )
、サリドマイドとの関連性については
何の報告もない。
先行技術文献
非特許文献
[0004]
非特許文献 1 ：丄
y,
Neuro
l ogy
63,
.
Hi
927
非特許文献 2 ：S . Angers
i ns,
J.
(2004)
et
Puc i l owska,
R.
Nature
590
Q.
Lombard
i , J.
P.
Roone
.
a に,
443,
(2006)
.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005]
近年になり、サリドマイドは多発性骨髄腫や痛みを伴うハンセン病の一種
であるらい性結節性紅斑の治療において使用されることが多くなつている（
引用文献 2 , 3 , 6, 7)
。その詳細なメカニズムは不明ながら、サリドマイド
はこれら疾患に対して良好な効果を発揮することが分かっている。しかしな
がら、催奇性が依然としてあることから、サリドマイド使用は厳格な統制の
下でしか行えない（引用文献 8 )
。サリドマイドの催奇性除去は、この有用な
効果をより広範に応用させていく上で極めて望まれているのである。
[0006]
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、サリドマ
ィドの有用な薬理作用を保持しつつ、催奇性のないサリドマイドの代替薬を
開発する手段を提供することを目的の一つとする。
課題を解決するための手段
[0007]
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、サリドマイ
ドが GRBN に結合し、 GRBN を構成因子とするュビキチンリガーゼ複合体の活性
を阻害することによって催奇性が生じることを見出した。上述したように、 G
RBN が
ヒ卜の軽度精神遅延の原因候補因子であることや GRBN が DDB1 と結合する
ことは既に知られていたが、サリドマイドとの関連性については全く知られ
ていなかった。従って、本願出願時において、 GRBN がサリドマイドの催奇性
における標的因子であることは、全く予測できなかったことである。
[0008]
以上の知見から、サリドマイド誘導体をセレブロンと接触させ、セレブ口
ンとの結合性を調べることによりそのサリドマイド誘導体の催奇性を予見す
ることができる。
この新知見をさらに発展させれば、サリドマイド誘導体に限らず、すべて
の被験物質において GRBN との結合性を調べればその物質のサリドマイド様の
催奇性の有無を予見することができる。
また、本発明者は、ヒト由来 GRBN の N末端から339 〜442 番目のアミノ酸残基
がサリドマイドの結合領域であること、および N末端から384 番目のチロシン
及び 386 番目のトリブトファンをァラニンに置換したヒト由来の GRBN は、ュビ
キチンリガ一ゼ複合体の構成因子としての機能を保持しつつ、サリドマイド
との結合性が低下することも見出した。
[0009]
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
[001 0]
即ち、本発明は、以下の〔1 〕〜〔1 1 〕を提供するものである。
〔1 〕被験物質をセレブロンもしくはその断片と接触させ、被験物質のセレ
ブロンもしくはその断片に対する結合性を評価し、セレブロンもしくはその
断片と結合しない被験物質、又はセレブロンもしくはその断片との結合性が
サリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特徴とする非催奇性物質
のスクリーニング方法。
〔2 〕被験物質が医薬であることを特徴とする〔1 〕に記載の非催奇性物質
のスクリーニング方法。
〔3 〕被験物質が、一般式（1 )
[ 化 1]
で表されるサリドマイド誘導体であることを特徴とする〔1 〕又は〔2 〕に
記載の非催奇性物質のスクリーニング方法；
ただし、式（1 ) 中、 X が R
(A ) 、X が R
5
で、 Y が R
6
5
_ R
_ R
8
7
で、 Y が R
6
_ R
8
である場合を化合物
である場合を化合物（B ) 及び X が R
5
で
、 Y が R 8 である場合を化合物（C ) とし、
また、 R 、 R 2 、 R 3 および R 4 は _ H ；— O H ；= 0 ；直鎖および分枝アル
カン、アルケン、アルキン；環式アルカン、アルケンおよびアルキン；環式
ならびに非環式アルカン、アルケンおよびアルキンの組み合わせ；アルコ一
ル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、または環式、非環式と組
み合わせたエーテル部分、あるいは環式
ァミノ；_ M O n または一 0 — M O n
非環式部分の組み合わせ；ァザ；
[ 式中、 M = N そして n = 2 ；M = S
そして n = 2 または 3 ；あるいは M = P そして n =
_ 3 である]
；そして
ハロゲンから選択することができ；R 5 、 R 6、 R 7および R 8 はそれぞれ独立して
式（2 )
[ 化 2]
Z
I
- C- R
1 o
または _ 0 _
Z
I
_ N —R
(2 )
( 式中、 Z は任意であり、そして上記 R の定義と同じである）
から選択され；そして R 10 は上記
の定義と同じであるか、または（Z がない
場合には） R 10 は = 0 であり；
R 9 は式（3 ) 、（4 ) 、 ( 5 ) 、 ( 6 ) または（7 )
[ 化 3]
R
R l2
(3 )
R
4
R l3
[ 化 4]
[ 化 5]
R
R
l6
—
(5 )
4
R l5
[ 化 6]
(6 )
- R
R l5
R l
—
式中、各々の R
R l6
_ R 17 は（
独立して）上記 R 5の定義と同じであり
[ 化 7]
R
8
I
- CI
R 2 0
( 7
式中、 R
H,
2
)
18
、R
- C H
,
19
および R 20 は独立して
- C O O H,
n C O N H
- C O N H
2
,
- C H
2
)
n - C O O H,
-
(C H
2
から選択され、 n = 1 _ 4 を有する部分である。
〔4 〕セレブロンの断片が、配列番号 7 に示すアミノ酸配列において、その N
末端から339 〜442 番目のァミノ酸配列を有し、それ以外のァミノ酸配列にお
いて 1 又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失および
又は付加がなされたァ
ミノ酸配列を有するものであることを特徴とする〔1 〕〜〔3 〕のいずれか
に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔5 〕セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とする
〔1 〕〜〔4 〕のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔6 〕サリドマイド誘導体が、サリドマイド又は既知のサリドマイド誘導体
のもつ薬理作用を持つものであることを特徴とする〔3 〕に記載の非催奇性
物質のスクリーニング方法。
〔7 〕被験物質をセレブロン又はその断片と接触させ、被験物質とセレブ口
ン又はその断片の結合性を調べ、セレブロン又はその断片と結合する被験物
質を選択する工程、及び前記工程で選択された被験物質の中から、 i ) 催奇性
、又は i i ) セレブロンを含むュビキチンリガーゼ複合体の活性阻害作用を軽減
する物質を選択する工程とを含むことを特徴とする催奇性物質のアンタゴニ
ストのスクリーニング方法。
〔8 〕セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とする
〔7 〕に記載の催奇性物質のアンタゴニス卜のスクリーニング方法。
〔9 〕以下の
（a)
及び
又は (b) のァミノ酸置換を有することを特徴とする変
異型セレブロン；
(a) ヒト由来のセレブロンにおける N末端から384 番目のチロシン若しくはこれ
に相当するアミノ酸がァラニンに置換されたもの
(b) ヒト由来のセレブロンにおける N末端から386 番目のトリブトファン若しく
はこれに相当するアミノ酸がァラニンに置換されたもの。
〔1 0 〕〔9 〕に記載の変異型セレブロンをコードすることを特徴とする核
酸。
〔1 1 〕〔1 0 〕に記載の核酸を遺伝子として導入し、発現させたことを特
徵とするサリドマイド催奇性耐性非ヒト動物。
発明の効果
[001
本発明のスクリーニング方法によって得られる非催奇性物質は、サリドマ
ィド様の催奇性の有無を予見することができ、非催奇性サリドマイド誘導体
は、サリドマイドの代替薬として有用である。また、本発明のスクリ一ニン
グ方法によって得られるサリドマイドのアンタゴニストは、サリドマイドに
よる催奇性リスクを軽減する働きがある。
[001 2]
本発明の変異型 GRBN をコードする核酸を遺伝子として導入し、発現させた
動物は、サリドマイドの催奇性に耐性を示すので、サリドマイド薬理効果の
評価などに有用である。
図面の簡単な説明
[001 3]
[ 図 1] GRBN 及び DDB1 に対するサリドマイド（
tha i ) の結合性に関する図。（
A) サ
リドマイド固定化ビ一ズ (+) あるいはコント口一ルビ一ズ (- ）を用い、 HeLa 細
胞抽出液からサリドマイド結合タンパクを精製した。サリドマイド固定化ビ
— ズに結合したタンパクはサリドマイドの添加により溶出される。溶出され
たタンパクは電気泳動後、銀染色を行った（
上図）。星印 (*) は非特異的に結
合したタンパクである。結合したタンパクはタンデム質量分析、ウェスタン
プロットにより、 GRBN と DDB1 と同定された。 0 . 3mM のサリドマイドをビーズと
混合する前の抽出液に加えておくことで、溶出される GRBN と DDB1 は減少した
。（
B) 精製した組み換えタンパク質である GRBN-FLAG および DDB1 -V5-H i s にサリ
ドマイド固定化ビーズを混合した。サリドマイド固定化ビーズに結合するタ
ンパクが GRBN あるいは DDB1 かをウェスタンプロッティングにより解析した結
果、ビーズに結合したタンパクは GRBN であった。（
G) GRBN-FLAG 、 DDB1-V5-H i s
を同時にもしくは単独で Sf9 細胞に発現させ、 FLAG 抗体を用いて免疫精製した
。精製されたタンパク質を電気泳動後、クマシ一 (Goomass i e) で染色したとこ
ろ、 DDB1 が検出された。
[ 図 2] GRBN 、 DDB 1 、及び Gu l l i n 4A (Gu l 4A) による E3 複合体形成に関する図。 (
A) FH-GRBN および DDB1-V5-H i s を HeLa 細胞に共発現させ、免疫染色した。 DAP I
は 4' 6- d i ami d i no- 2- pheny l i ndo l e である。 GRBN 、 DDB1 は主に核に共局在して
おり、細胞質でも検出された。（
B) FH-GRBN を安定的に発現する 293T 細胞また
はコントロール細胞 (mock) 抽出液を FLAG 抗体により免疫沈降し、ウェスタン
ブロッテイングを行ったところ、 GRBN 複合体として DDB1 、 Gu l 4A 、 Roc1 が共沈
した。（
G)
図の量の FH-GRBN と DDB2 発現べクタ一を 293T 細胞に共導入した。 I n
put 、および FLAG 抗体にて GRBN と共沈した分子をウェスタンブロッテイング
により解析した（I B) 。 DDB2 を強発現させることにより、 GRBN と共沈する DDB1
量は低下した。（
D) FH-GRBN を安定的に発現する 293T 細胞に、 Gu l 4A s i RNA もし
くはコントロール s i RNA を導入し、 MG1 32 を加えた。 Rl PAbuffer で細胞を溶解
し、 FLAG 抗体にて免疫沈降後、 Ubqu i t i n (Ub) 抗体でウェスタンプロットを行
つた。 MG1 32 処理による GRBN の自己ュビキチン化は Gu l 4A s i RNA により抑制さ
れた。（
E) FH-GRBN (WT 、野生型）もしくは DDB1 との結合能を欠くGRBN 変異体（
△ Mi d、 GRBN の 187 から260 番目のアミノ酸を欠損させた変異体）を安定的に発
現する 293T 細胞に MG 132 を加え Dと同様の操作を行った。 △ Mi d の発現細胞では
MG1
32 処理による GRBN 変異体の自己ュビキチン化は抑制された。
[ 図 3] サリドマイドによる GRBN 機能の阻害に関する図。（
A) GRBN ( 野生型）な
らびに GRBN 変異体の図。星印はァラニン置換を示す。（
B) GST-GRBN 野生型ある
いは変異体タンパクにサリドマイド固定化ビーズを混合し、結合した GRBN 変
異体類を銀染色で検出した。野生型ならびに GRBN の G末端側 104 ァミノ残基を
発現する変異体が結合した。融合タンパク質の全長のものを ar rowhead で示し
た。（
G) FH-GRBN 野生型あるいは変異体類を過剰発現する 293T 細胞抽出液にサ
リドマイド固定化ビーズを混合し、結合した GRBN 変異体類をウェスタンプロ
ッティングで検出した。野生型に比べ GRBN Y384A 、W386A 変異体はサリドマイ
ド固定化ビーズへの結合が弱く、 2 点変異体 (YW/AA) ではさらに結合が低下し
た。（
D) GRBN-V5-H i s ( 野生型）および変異体 FH-GRBN YW/AA を HeLa 細胞に共導
入し、免疫染色した。 DAP I は 4
l i ndo l e である。野生
'6- d i ami d i no- 2 - pheyny
型ならびに変異体 GRBN YW/AA の細胞内局在に違いはなかった。
（E)
FH-GRBN
YW
/AA を発現する 293T 細胞抽出液を FLAG 抗体にて免疫沈降後、ウェスタンプロッ
トを行ったところ、 DDB1 、 Gu l 4 A 、 Roc1 が YW/AA 変異 GRBN と共沈した。
( 野生型）もしくは FH-GRBN
) FH-CRBN
2 E に示した工程を行った。
（G)
（F
及びG
YW/AA を発現させた 293T 細胞において図
においては回収の 4 時間前にサリドマイドを処
理した。 MG1 3 2 による GRBN の自己ュビキチン化はサリドマイドの前処置により
抑制されたが、 YW/AA 変異 GRBN ではサリドマイドによる抑制は見られなかった
[ 図 4 ] サリドマイド処理および GRBN 複合体の抑制によるゼブラフィッシュにお
ける発生異常に関する図。
（A
及び B) ゼブラフィッシュ胚を図の濃度のサリド
マイドに薬浴させた状態で発達させた。サリドマイドの処置により、胸鰭、
耳胞の発達が阻害された。 ( Gから F) zcrbn
AMO
(zcrbn
ant
i sense
o l i gonuc
l eot i de) を単独もしくは zcrbn
。 zcrbn
AMO により、胸鰭、耳胞の発達は阻害されたが、 zcrbn
することで緩和できた。
（G
morpho
l i no
mRNA とともに 1 細胞期の胚に注入した
mRNA を共導入
から I ) zcu l 4 a AMO を単独もしくは zcu l 4 a mRNA とと
もに 1 細胞期の胚に注入した。 zcu l 4 a AMO により胸鰭、耳胞の発達は阻害され
たが、 zcu l 4 a mRNA を共導入することで緩和できた。
（A
定しアルシアンブルーで染色した。上図は胚の背側図
下図は胸鰭の拡大図である。胸鰭は arrowhead
おける耳胞の拡大図である。 ( D及び G)
owth
zat
factor
8a) な
びに shh
48hpf
及び G) 7 5 hpf の胚を固
（do r s a I V i ew)
で示した。
（B,
である。
E 及び H) 30hpf
の胚に対しfgf 8 a ( f i brob
(son i c hedgehog)
に
l ast
gr
プロ一フで i n s i t u hybr
id i
i o n を行った。ヒレ芽（f i n bud) の拡大図を示した。 zGrbn
、 zGu l 4 a の発現
抑制によりfgf 8 a の発現低下がみられ、それぞれの mRNA をともに導入すること
で緩和された。 shh 発現にはほぼ影響はなかった。
（F
及び I)
30hpf
胞のサイズを未処理の検体に対する比としてグラフに表した。 ***p
n i nj ,
非注入
における耳
〈 0 . 001
,
未処理）。
[ 図 5 ] 変異型 GRBN の発現によるサリドマイド催奇性抑制に関する図。 1 細胞期
u
の胚に zcrbn mRNA ( 野生型）もしくは zcrbn YW/AA の mRNA を注入し、サリドマ
ィドに薬浴させた。（
A) 27hpf における耳胞の拡大写真。（
B) 30hpf におけ耳胞
のサイズを未処理の検体に対する比でグラフに示したもの。 * p〈 0 . 05, **p<0.
0 1 。 zcrbn
YW/AA を過剰発現した胚では、サリドマイドは耳胞の発達に影響
を及ぼさなかった。（
G及びり) 48hpf における胚を f gf 8 あるいは shh プローブで i
n s i t u hybr i d i zat i on を行った。図にはヒレ芽の拡大写真を示している。 un i
nj , 未処理。 zcrbn YW/AA を発現させた胚では、サリドマイドによる fgf8a 発
現の減少が緩和した。
[ 図 6] サリドマイドの F G ビーズへの固定化方法の模式図。（
A及び B) サリドマイ
ドおよびその誘導体である FR259625 の構造。（
G) サリドマイド固定化反応の流
れ。
[ 図 7] 様々な細胞種からのサリドマイド結合因子の精製に関する図。図に示し
たような細胞種の抽出液にサリドマイド固定化ビーズを添加し反応させた。
サリドマイドにより溶出された画分の DDB1 ならびに GRBN をウェスタンブロッ
ティングで検出した。競合阻害は 0 . 3mM のサリドマイドを、ビーズと結合させ
る前の抽出液に加えている。様々な細胞種において、サリドマイド結合タン
パクとして GRBN ならびに DDB 1が検出できた。
[ 図 8]
DDB1
の GRBN に対する結合性に関する図。 FH-GRBN を安定的に発現する 293
T細胞株もしくはコントロール細胞 (mock) 抽出液を FLAG 抗体により免疫沈降を
行い、 SDS-PAGE および銀染色を行った。 DDB1 は GRBN と共沈した。
[ 図 9] I n v i tro での GRBN のュビキチン化に関する図。 FH-GRBN を安定的に発現
する 293T 細胞株から精製した FH-GRBN 複合体は GST- ュビキチン、 Uba l (E1 に相
当）、 UbcH5b (E2 に相当）、 ATP 存在下もしくは非存在下で自己ュビキチン化反
応を行った。反応溶液は図に示した抗体を用いウェスタンブロッテイングを
行った。 Mock はコントロール細胞からFLAG 精製された画分である。 GRBN 複合
体存在下で自己ュビキチン化が見られた。
[ 図 10]
DDB1
のノックダウンと GRBN タンパク量との関係を示す図。 DDB1 s i RNA
もしくはコントロールの s i RNA を導入した 293T 細胞から得た抽出液とサリドマ
イド固定化ビーズを混合し、 i n put 中の DDB1 あるいは
_act
i n 、およびビー
ズに結合した GRBN をウェスタンブロッテイングで解析した。 DDB1 の発現低下
に伴ってサリドマイドに結合する GRBN も減少した。
[ 図 1 1 ] GRBN 欠損変異体とュビキチン複合体形成を示す図。
および GRBN 欠損変異体の図。
（B)
293T 細胞に FH-GRBN
（A)
(野生型）
GRBN
(野生型）およびその欠
損変異体を発現させ、 FLAG 抗体において免疫沈降した。 GRBN およびその変異
体、ならびに結合した内因性 DDB1 をウェスタンブロッテイングにより解析し
た。その結果、 GRBN の 18 7 から 260 番目のアミノ酸欠損により DDB1 との結合が
消失することが判明した。
（G)
GRBN および 18 7 から 260 番目のアミノ酸を欠損さ
せた変異体 A M i d を 293T 細胞に発現させた。 FLAG 抗体で免疫沈降後、 GRBN ある
いは A M i d に結合した DDB1 ならびに Gu l 4 A をウェスタンプロッティングにより
解析した。 A M i d は DDB1 、 Gu l 4 a との複合体形成能が消失していた。
[ 図 12 ] GRBN の進化的保存性に関する図。 5 種より GRBN オルソログのアミノ酸を
比較したもの。枠で囲まれたアミノ酸は、 5 種類すべてで保存されているアミ
ノ酸である。 Arrow
は欠損実験で判明したサリドマイド結合領域であり、星印
はサリドマイド結合に極めて重要なアミノ酸を表す (Y384 と W386) 。図 3 参照。
[ 図 13 ] ゼブラフィッシュ胚における zcrbn
および zcu l 4 a の発現を示す図。 48hp
f 胚における zcrbn
および zcu l 4 a の発現をホールマウント i n s i t u hybr
o n にて検証した。
（A)
zcrbn
arrowhead
鰭における zcrbn
hyme,
pm
て弱い。
（B)
における耳胞での zcrbn
（G)
48hpf
発現。
胚での胸
発現の拡大図である。発現は前位の間充織（prox i ma l mesenc
遊走『
ま充織
zcu l 4 a の発現について。 48hpf
脳、胸鰭において高く発現している。
である。中脳
48hpf
にて）背側図であり、前部が頭部である。
こ！
¾ レべゾレでめり、
（D)
i
は頭部血管、胸鰭、そして脳において高発現であ
る。側面図であり、左が前部である。
(0V,
i d i zat
（E)
i gratorymesenchyme,
mm
こおしゝ
胚で zcu l 4 a は前脳、中脳そして後
対照として 48hpf
胚での fgf8
の発現
後脳境界部、および後脳において発現している。スケールバ
— は 0 . 2mm である。
[ 図 14 ] zGrbn の生化学的解析結果に関する図。
（A)
FH-zGrbn
を発現させた 293T
細胞抽出液にサリドマイド固定化ビーズを混合し反応させた。結合タンパク
質をサリドマイドで溶出し、ウェスタンブロッテイングにより解析した。 zGr
bn はサリドマイドに結合した。（
B) FH-zGrbn を発現させた 293T 細胞抽出液を FL
A G抗体
で免疫沈降を行い、 DDB1 の結合をウェスタンブロッテイングにより検
証した。ヒトの内在性 DDB1 が結合することが分かった。（
G) FLAG-zGrbn
(野生
型）もしくは FLAG-zGrbn YW/AA を発現させた 293T 細胞抽出液にサリドマイド
固定化ビーズを混合した。 i nput およびサリドマイドによる溶出画分について
様々な量でウェスタンブロットを行った。 zGrbn YW/AA に対するサリドマイド
の結合は明らかに弱かった。
[ 図 15] サリドマイド催奇性の分子メカニズムを模式的に表した図。正常時で
は GRBN は E3 ュビキチンリガ一ゼ複合体のサブュニットとして機能し、未知の
基質をュビキチン化することによって四肢や耳胞の形成といった様々な発生
プロセスを制御する（
上図）。サリドマイドが GRBN と結合すると、 E3 としての
機能が阻害される（
下図）。基質の異常な蓄積が短い四肢や小さな耳胞の形成
など、様々な発生異常をもたらす。部分的には fgf8 の発現の低下が関与する
[ 図 16] フタルイミドと GRBN 及び DDB1 との結合に関する図。 293T 細胞抽出液を
サリドマイド固定化ビーズと混合した。ビーズに結合した因子をサリドマイ
ドもしくは、等量のフタルイミドで溶出し、溶出画分中の GRBN 及び DDB1 をゥ
エスタンプロッティングで解析した。
[ 図 17] GRBN との結合性を調べたサリドマイド誘導体の構造式を示す図。
[ 図 18] サリドマイド誘導体と GRBN との結合に関する図。図中の Veh i c l e は DMS0
を示す。 HEK293T 細胞抽出液にサリドマイド固定化ビーズを混和して、洗浄後
、サリドマイド誘導体により結合タンパクを溶出した。溶出画分中の GRBN は
ウェスタンプロットを行った。図中の Veh i c l e は DMS0 を示す。 SDS_Bo i l は洗浄
後のビーズを 2%SDS を含むバッファ一中で 98. 5 °C に加熱し、サリドマイド固定
化ビーズに結合した GRBN を解離させた画分である。 GRBN はサリドマイド、グ
ルタルイミドにより溶出したが、フタルイミド、 5_Hydroxy_
(2, 6_d i i sopropy
I pheny I ) - 1H- i so i ndo I e- 1, 3- d i one (5HPP-33) の添加では溶出しなかった。
[ 図 19] サリドマイド又は 5HPP-33 処理後の多発性骨髄腫細胞 Kms1 2の細胞数を
示す図。 KMS-1 2細胞に最終濃度が 100 〃Mになるようにサリドマイドあるいは 5
HPP-33 を添加した。 37°C 、 5%G02 に設定したインキュベータ一内で 48 時間培養
した。細胞数の測定のため、生細胞数測定試薬 SF ( ナカライテスク）を添加
し、さらに 2 時間培養後、波長 450 n mで吸光度を測定した。 5HPP-33 は KMS-1 2
に対して強い増殖抑制を示した。
発明を実施するための形態
[001 4]
[001 5 ]
以下、本発明を詳細に説明する。
( 1 ) 非催奇性物質のスクリーニング方法
本発明の非催奇性物質のスクリーニング方法は、被験物質を GRBN もしくは
その断片と接触させ、被験物質の GRBN もしくはその断片に対する結合性を評
価し、 GRBN もしくはその断片と結合しない被験物質、又は GRBN もしくはその
断片との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特徴と
するものである。
GRBN 等
との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質の選択は、例えば、
被験物質の代わりにサリドマイドを用いた対照実験を行い、被験物質の結合
性とサイリドマイドの結合性とを比較することにより行うことができる。
[001 6]
GRBN は、サ
リドマイドの催奇性の標的因子であると考えられる。従って、
これと結合しない物質ゃサリドマイドよりも結合性の低い物質は、サリドマ
ィドの有する催奇性を持たないか、又は催奇性が軽減されていると考えられ
る。
[001 7]
被験物質は特に限定されないが、ヒト又は他の動物に投与、摂食させる物
質が好ましく、例えば、医薬、医薬品添加物、食品、食品添加物、又はこれ
らに含まれる化学物質などが挙げられる。
医薬の中では、サリドマイド誘導体が重要である。
サリドマイド誘導体としては、例えば次の一般式（1 ) で示される化合物が
あげられる。
一般式（1 )
[ 化 8]
R
4
ただし、式
A ) 、X が R
Y がR
8
（1
5
) 中、 X が R
で、 Y が R
6
5
_ R
_ R
8
7
で、 Y が R
6
_ R
8
である場合を化合物（
である場合を化合物（B ) 及び X が R
である場合を化合物（C )
5
で、
とし、
また、 R 、 R 2 、 R 3 および R 4 は _ H ；— O H ；= 0 ；直鎖および分枝アル
カン、アルケン、アルキン；環式アルカン、アルケンおよびアルキン；環式
ならびに非環式アルカン、アルケンおよびアルキンの組み合わせ；アルコ一
ル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、または環式、非環式と組
み合わせたエーテル部分、あるいは環式
ァミノ；_ M O n または一 0 — M O n
非環式部分の組み合わせ；ァザ；
[ 式中、 M = N そして n = 2 ；M = S
そして n = 2 または 3 ；あるいは M = P そして n =
_ 3 である]
；そして
ハロゲンから選択することができ；R 5 、 R 6、 R 7および R 8 はそれぞれ独立して
式（2 )
[ 化 9]
Z
I
- C- R
1
または _ 0 _
Z
I
- N-R
(2 )
1
( 式中、 Z は任意であり、そして上記 R の定義と同じである）
から選択され；そして R 10 は上記
の定義と同じであるか、または（Z がない
場合には） R 10 は = 0 であり；
R 9 は式（3 ) 、（4 ) 、 ( 5 ) 、 ( 6 ) または（7 )
[ 化 10 ]
R
R l2
(3 )
R
4
R l3
[ 化 1 1]
[ 化 12 ]
R
R
l6
—
(5 )
4
R l5
[ 化 13 ]
( 6 )
- R
R l5
R l
—
式中、各々の R
R l6
_ R
17
は（
独立して）上記 R 5 の定義と同じであり
[ 化 14 ]
R
8
I
- C I
R 2 0
( 7
式中、 R
H ,
)
-
18
、 R
C H
3
19
, -
n C O N H
および R
C O O H ,
8]
-
独立して
C O N H
2
,
_
1 _
l e-1
, 3-d
2
)
n -
C O O H ,
-
( C H
2
4 を有する部分である。
サリドマイド誘導体の中で、 5-Hydroxyndo
C H
2
から選択され、 n =
[001
20 は
i one
(5HPP-33)
(2,
6-d
i i sopropy
I pheny
I) -
H- i s o i
はヒト骨髄腫細胞の増殖抑制などの薬理作用を
有しているがセレブロンとの結合性はかなり低いことが確かめられた。
サリドマイド誘導体は、サリドマイドゃ既知のサリドマイド誘導体の持つ
薬理作用を持つものが好ましい。
サリドマイドの薬理作用としては、（i ) bFGF により誘導される血管新生の抑
制、（i i ) LPS 刺激したヒト単球からの TNF-
ひ産生の抑制、ヒト骨髄腫細胞等の
腫瘍細胞とヒト骨髄ストローマ細胞との共培養により亢進する I L-6 産生の抑
制、（i i i ) 多発性骨髄腫患者の末梢血中のナチュラルキラー細胞数の増加、 T
細胞受容体刺激後の I L-2 及び I NF-
産生の亢進、および I L- 2 依存的に T 細胞
の増殖の促進、（i v ) ヒト骨髄腫細胞などの腫瘍細胞に対してアポトーシス誘
導と細胞増殖の抑制などが確認されている。
そして、サリドマイドの疾病に対する予防、治療効果としては、鎮静作用
、ハンセン病治療作用
（具体的には、らい性結節性紅斑の治療作用）、移植
病治療作用、多発性骨髄腫治療作用、固形がん治療作用、全身性エリテマト
一デス治療作用、多発性硬化症治療作用、ベーチェット病治療作用、炎症性
腸疾患
（クローン病や潰瘍性大腸炎）治療作用などを例示できる。既知のサ
リドマイド誘導体の薬理作用としては、レナリドマイド（Lena l i domi
発性骨髄腫治療作用、骨髄腫異形成症候群
(Poma
l i domi
de)
（MDS)
de)
の多
治療作用、ポマリドマイド
の多発性骨髄腫治療作用、骨髄線維症の治療作用などを例示
できる。
[001
9]
GRBN は既知のタンパク質であり、それをコー
ドする遺伝子
（GRBN 遺伝子）
の塩基配列もデータベース上に公開されている。例えば、ヒト由来の GRBN 遺
伝子の塩基配列、マウス由来の GRBN 遺伝子の塩基配列、ラット由来の GRBN 遺
伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来の GRBN 遺伝子の塩基配列は、そ
れぞれ Gene I D: 5 1 185 、 Gene I D: 58799 、 Gene I D: 297498 、及び Gene I D: 44549
1で Entre
Gene に登録されている。使用する GRBN や GRBN 遺伝子は天然のもので
あってもよいが、天然の GRBN のアミノ酸配列において 1 若しくは数個のアミ
ノ酸欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性を持つュビ
キチンリガーゼ複合体を形成できる変異型の GRBN やそれをコードする遺伝子
を使用してもよい。
[0020]
本発明者は、ヒト由来の GRBN におけるサリドマイド結合領域を特定してい
る。従って、 GRBN の代わりにサリドマイド結合領域を含む GRBN の断片を使用
しても、結合性の評価は可能である。サリドマイド結合領域としては、ヒト
由来の GRBN の G末端側の 104 アミノ酸領域を例示できる。ヒト以外の生物由来
の GRBN においては、この G末端側の 104 アミノ酸領域に相当する領域（
即ち、
アミノ酸の同一性に基づいて整列させた際に、ヒト由来の GRBN の G末端側の 10
4 アミノ酸領域と一致する領域）をサリドマイド結合領域とすることができる
[0021 ]
GRBN の断片
としては、配列番号 7 に示すヒト由来 GRBN のアミノ酸配列にお
いて、その N末端から 3 3 9 〜 4 4 2 番のアミノ酸配列を有し、それ以外のァ
ミノ酸配列において 1 又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失および
又は付
加がなされたアミノ酸配列を有するもの、および当該ヒト由来 GRBN の断片に
相当する各種生物由来の GRBN の断片などが挙げられる。また、 GRBN やその断
片は、他のタンパク質を付加して融合タンパク質としてもよい。
[0022]
本発明において使用する GRBN 又はその断片は、上記の各種生物由来の GRBN
や変異型の GRBN 又はそれらの断片のいずれでもよいが、本発明は、ヒトに対
して催奇性を持たないサリドマイド誘導体を得ることを目的としているので
、ヒト由来の GRBN 又はその断片を使用するのが好ましい。
[0023]
GRBN やその断片は、担体
RBN やその断片
に固定しておくことが好ましい。担体としては、 G
を固定できるものであれば特に限定されないが、粒子状のもの
が好ましく、また、磁性を有するものが好ましい。好ましい担体の例として
は、有機ポリマー皮膜を有する磁性ナノビーズを挙げることができる。有機
ポリマー皮膜を有する磁性ナノビーズの粒径は特に限定されないが、 1-500nm
が好ましく、 20-300nm
がより好ましい。有機ポリマ一としては、 GMA 、 GMA と
スチレンの共重合体、（
ポリ）メタクリル酸、
（ポリ）アクリル酸などを挙げ
ることができる。有機ポリマー皮膜を有する磁性ナノビーズの具体例として
は、 S G ビーズ（kawaguch i ら Nuc l e i c Ac i d s Research
G ビーズ
（N
i s h i o ら、 Co l l o i d s and
169) 、 Dynabeads,
Adembeads,
Surfaces
989,
B : B i o i interfaces
17 : 6229-6240)
2008,
、F
6 4 : 1 62—
nanomag なと ¾：
挙げることができる。
GRBN に対するサリドマイド誘導体の結合性評価は、常法によって行うこと
[0024]
ができ、例えば、 B I Acore による表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリ
_
[0025]
( I TG) などにより結合性を評価できる。
本発明のスクリーニング方法は、被験物質と GRBN 又はその断片との結合性
を評価できれば特に限定はされないが、例えば以下の方法のように実施する
ことができる。
[0026]
(A) F G ビーズを用いたスクリーニング方法
まずサリドマイドを固定化した F G ビーズを作製する。その固定化ビーズを G
RBN が発現する細胞抽出液、もしくは組み換えタンパク質と混合し、 1 時間以
上、回転機にて 5rpm 、 4 °C で混和状態を続ける。そしてバッファ一で洗浄を行
つた後、例えば、被験物質としてサリドマイド誘導体を混合したバッファー
をビーズに通すことにより、 GRBN の溶出が生じるかどうかを確認する。検出
方法としては、ウェスタンブロッテイング、ドットブロッテイング、 GBB 染色
、銀染色などが挙げられる。その際には、サリドマイドゃ、非結合が確認済
みのフタルイミドが対照実験のサンプルとして用いられる。また、多摩川精
機株式会社の F G ビーズスクリーニング装置 Target
Ang l e r シリーズなどを用い
ることにより大量のサンプルの解析が可能である。
[0027]
(B) B I Acore
を用いたスクリ一ニング
まずァミノ基もしくは力ルポキシル基などの官能基をつけた GRBN を B I Acore
基盤チップに固定させる。そしてその固定化チップを装着させた B I Acore3000
など BIAcore 計測装置（
GE Hea は hcare) において、様々な誘導体を流入させ、
その解離定数を計測する。サリドマイドゃフタルイミドが対照実験として用
いられる。
[0028]
(G) 等温滴定カロリメトリ一を用いたスクリーニング
サリドマイド誘導体を含む溶液を試料セル中の GRBN を含む溶液へ数十回（
たとえば 18 回）にわたつて滴下する。各濃度の発生熱量をセル中における誘
導体と GRBN のモル比に対してプロッ卜することにより相互作用の結合等温線
が得られる。この結合等温線から解離定数を算出する。サリドマイドゃフタ
ルイミドが対照実験として用いられる。
[0029]
( 2 ) 催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法
本発明の催奇性物質のアンタゴニス卜のスクリーニング方法は、被験物質
を GRBN 又はその断片を混合などで接触させ、被験物質が GRBN 又はその断片と
結合するか否かを評価し、 GRBN 又はその断片と結合する被験物質を選択する
工程、及び前記工程で選択された被験物質の中から、 i ) 催奇性、又は i i ) GRBN
を含むュビキチンリガーゼ複合体の活性阻害作用を軽減する物質を選択する
工程とを含むことを特徴とするものである。
[0030]
上記方法で得られるサリドマイドなどの催奇性物質のアンタゴニストは、
催奇性物質の GRBN への結合を阻害する。従って、サリドマイドやその誘導体
などの催奇性物質を服用する際に、このアンタゴニストを併用することによ
り、催奇性のリスクを軽減することができる。
[0031 ]
前半の工程、即ち、被験物質を GRBN 又はその断片と接触させ、被験物質が G
RBN 又
はその断片と結合するか否かを評価し、 GRBN 又はその断片と結合する被
験物質を選択する工程は、（1 ) のスクリーニング方法と同様に行うことが
できる。
[0032]
前半の工程で選択された物質が、ァゴニストではなく、アンタゴニストで
あれば、その物質は、サリドマイドなどの催奇性物質の持つ作用を軽減する
働きを持つはずである。従って、催奇性又は GRBN を含むュビキチンリガ一ゼ
複合体の活性阻害作用を軽減するか否かを評価することにより、催奇性物質
のアンタゴニストを選択することができる。
[0033]
サリドマイドの持つ作用としては、従来から知られている催奇性のほか、
今回本発明者によって明らかにされたュビキチンリガーゼ複合体の活性阻害
作用を挙げることができる。
[0034]
サリドマイドの持つ作用を軽減するか否かは、被験物質の存在下と非存在
下でのサリドマイドの作用を比較することにより確認できる。
[0035]
本発明の催奇性物質のアンタゴニス卜のスクリーニング方法は特に限定は
されないが、例えば、以下のように実施することが出来る。
[0036]
まず GRBN との結合の有無を確認する。結合の有無を確認する方法は、
（1
) のスクリーニング方法と同様である。ここで有意に結合することが示され
たアンタゴニスト候補について以下の方法でスクリ一ニングする。
[0037]
(A) I n v i tro
系によるュビキチン化に対する影響
FH-GRBN を発現する 293T 細胞において、アンタゴニスト候補およびサリドマ
ィドを加える。そしてその細胞抽出液におけるュビキチン化タンパク量をゥ
エスタンブロッテイングで決定する。その際に、アンタゴニストを加えるこ
とで、サリドマイド単独の場合よりュビキチン化タンパク量の減少が抑制さ
れれば、それはアンタゴニストである。
[0038]
(B) ゼブラフィッシュを用いたスクリ一ニング
ゼブラフィッシュ胚から卵殻を除去したものに対し、サリドマイドとアン
タゴニスト候補を薬浴させる。耳胞およびヒレ形成に対して、サリドマイド
単独と比べ異常が緩和されていれば、アンタゴニス卜といえる。
[0039]
( 3 )
変異型 GRBN
本発明の変異型 GRBN は、以下の
（a)
及び
又は
（b)
のァミノ酸置換を有する
ことを特徴とするものである。
[0040]
(a) ヒト由来の GRBN における N末端から 384 番目のチロシン若しくはこれに相当
するアミノ酸をァラニンに置換する。
(b) ヒト由来の GRBN における N末端から 386 番目のトリブトファン若しくはこれ
に相当するアミノ酸をァラニンに置換する。
本発明において「ヒト由来の GRBN における N末端から384 番目のチロシンに相
当するアミノ酸」とは、図 12 に示すように、アミノ酸の同一性に基づいて整
列させた際に、ヒト由来の GRBN の N末端から384 番目のチロシンと一致するァ
ミノ酸を意味する。図 12 に示すように、マウス由来の GRBN では N末端から361
番目のチロシン、ゼブラフィッシュ由来の GRBN では N末端から374 番目のチロ
シン、キイ口ショウジヨウバエ由来の GRBN では N末端から5 1 7番目のチロシン
、シロイヌナズナ由来の GRBN では 504 番目のチロシンが、これに該当する。同
様に、本発明において「ヒト由来の GRBN における N末端から386 番目のトリプ
トフアンに相当するアミノ酸」とは、アミノ酸の同一性に基づいて整列させ
た際に、ヒト由来の GRBN の N末端から386 番目のトリブトファンと一致するァ
ミノ酸を意味する。図 12 に示すように、マウス由来の GRBN では N末端から363
番目のトリブトファン、ゼブラフィッシュ由来の GRBN では N末端から376 番目
のトリブトファン、キイ口ショウジヨウバエ由来の GRBN では N末端から5 1 9番
目のトリブトファン、シロイヌナズナ由来の GRBN では 506 番目のトリブトファ
ンが、これに該当する。
[0041 ]
変異型 GRBN をコードする核酸の動物への導入及び発現は、常法に従って行
うことができる。例えば、変異型 GRBN をコードする DNA を含む発現べクタ一を
構築し、それを動物の受精卵などに導入することなどによって行うことがで
きる。核酸を導入する動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定され
ず、例えば、ゼブラフィッシュ、ニヮトリ、マウス、ゥサギなどを用いるこ
とができる。
[0042]
本発明の変異型 GRBN は、ュビキチンリガ一ゼ活性を保持するが、サリドマ
イドと結合しない。このため、この変異型 GRBN をコードする核酸を導入し、
発現させた動物は、サリドマイドによる催奇性に対して耐性を持つようにな
る。
[0043]
変異型 GRBN をコードする核酸を導入、発現させた動物は、例えば、催奇性
以外の薬理作用解析などの用途に利用することができる。変異型 GRBN を導入
したゥサギゃニヮトリは催奇性耐性になるために、サリドマイドやその誘導
体を投与した際に薬理作用を示すとすれば、それはすべて催奇性と独立した
作用である。よって、催奇性のメカニズムと独立したサリドマイド作用を解
析する上で、この変異 GRBN を導入した動物は極めて有用である。
実施例
[0044]
〔実施例 1 〕サリドマイドの GRBN 及び DDB1 への結合性
サリドマイド結合因子を精製するために、本発明者は磁性微粒子である F G
ビーズを用いたァフィ二ティ精製を行った（引用文献 9) 。力ルポキシル基が
付加されたサリドマイド誘導体である FR259625 を F G ビーズに共有結合により
固定化し（図 6) 、ヒトHeLa 細胞の抽出液と混合し、インキュベートした。そ
の後、洗浄を行い、結合因子を遊離サリドマイドを用いることで選択的溶出
を行った。そして溶出画分を SDS-PAGE および銀染色で解析した結果、 127kDa
と 55kDa の二つのタンパク質が特異的に溶出されることがわかった（図 1A,
La
ne 3) 。ビーズと混合する前にあらかじめ遊離サリドマイドを抽出液に加え
ておくと、ァフィ二ティ精製により得られるこれらタンパク質の収量が著し
く減少した（図 1A,
Lane 4) 。つまり、これらのタンパク質はサリドマイド
に特異的に結合することが示されたのである。これら 127kDa および 55kDa のタ
ンパク質は質量分析計により解析され、それぞれ DDB1 及び GRBN であることを
突き止めた（
表 1 ) 。これらタンパク質はウェスタンプロッティング（i mmunob l
ott i ng) によっても確認され（図 1A ) 、さらに様々な細胞の抽出液からも精製さ
れることが分かった（図 7 ) 。サリドマイドとの相互作用が直接的かどうか
を調べるために、本発明者はこれらの組み換えタンパク質を精製した。サリ
ドマイド固定化ビーズに GRBN-FLAG のみが結合し、 DDB1-V5-H i s は結合しなか
つた（図 1 B) 。よって、 DDB1 は GRBN を介してサリドマイドに間接的に結合し
ているのでないかと考えた。結果としてサリドマイドは GRBN に直接結合して
おり（
図 1G) 、 DDB1 は GRBN との相互作用を介してサリドマイドと結合している
という結論が得られた。
[0045]
ほ 1]
cercbron
VAACLPIDDVLE
(CRBN)
TFAVLAYSNVQER
ffLYSLYDAETLMDR
damaged DNA binding
protein
1 (DDB1)
GESKDLLFILTAK
ETDDTLVLSFGQTR
LICYQEVSQCFGVLSSR
SVLLL 腿匿 GNFEEIAR
IEVQDTSGGTTALRPSASTQALSSSVSSSK
〔実施例 2 〕 CRBN,
DDB1
、及び Gu l 4A による E3 複合体の形成
ヒ卜の GRBN 遺伝子は元々は常染色体性劣性軽度精神遅滞の原因候補因子と
して報告されており（引用文献 11) 、 442 個のアミノ酸からなるタンパク質を
コードしている。このタンパク質は進化的に良く保存されており、植物から
ヒ卜まで存在する。近年のプロテオミクス解析によりGRBN は DDB1 と結合する
ことは報告されていたが（引用文献 12) 、機能的な関わり合いは明らかにさ
れておらず、 GRBN の生物的機能はほとんどわかっていない。
まず本発明者は GRBN 機能へのサリドマイドの効果を調べるために、生化学
的な解析を行った。最初に FH-GRBN を安定的に発現させた 293T 細胞株を作製し
、その細胞抽出液からFLAG 抗体にて免疫ァフィニティ精製を行うことによりG
RBN 結合
タンパク質を明らかにすることにした。精製物に対し銀染色を行った
ところ GRBN は DDB1 とほぼ 1 ：
1のモル比で結合していることが明らかになった（
図 8) 。免疫染色（
図 2A) によると GRBN と DDB1 は主に核において存在していた。
この結果は、核においてこれらが重要な機能を担っていることを示唆するも
のである。 DDB1 は Gu l 4 (Gu l 4A もしくは Gu l 4B) 、 Regu l ator
of
Gu
l l in
(Ro
c 1 ) そして基質レセプターとともに E3 ュビキチンリガーゼを形成することが
報告されている（引用文献 13、 4) 。基本的に、 E3 ュビキチンリガーゼの機
能とは、ュビキチン結合酵素 (E2) と特異的に相互作用することにより基質に
ポリュビキチン鎖を付加するというものである（引用文献 15 , 16) 。 Gu l 4 は足
場タンパク質として働き、 Roc1 は R I NG f i nger doma i n を持っており、 E2 と相
互作用することが可能である。基質レセプターとしては、 DDB2,
CSA,
SV5-V,
GDT2 そして AhR が知られており、基質に直接結合してュビキチン化を仲介す
る ( 引用文献 13 , 7-20)
。
本発明者は GRBN が E3 複合体の他の構成因子と相互作用するか検証し、 DDB1 、 C
u l 4A及び Roc1 が FH-GRBN と複合体を形成することを明らかにした（図 2B) 。も
しGRBN が新規の基質レセプターであるならば、 DDB1 への結合に対して、 GRBN
は DDB2 といった他の基質レセプターと競い合うことが期待される。実際、 DDB
2 の発現量を増やしていくにつれて、 GRBN と共沈する DDB1 の量は減少した（図
20
。つまりGRBN は DDB1_Gu l 4_Roc1 E3 ュビキチンリガ一ゼの基質結合サブュ
ニットであるかもしれないという結果が得られたのである。
[0047]
そして、本発明者は実際に GRBN 複合体に E3 ュビキチンリガーゼ活性がある
かどうかを検証することにした。基質レセプタ一および Gu l 4 は i n v i tro で自
己ュビキチン化されることが知られている。 GST タグ付きュビキチン、 Una l (
E1)
、 Uba l 2 (E2) そして GRBN 複合体を用いることにより i n v i tro でュビキチン
化アツセィを行った結果、確かに GRBN 複合体によるュビキチン化活性は検出
された（
図 9) 。次に本発明者は GRBN が生細胞内でもュビキチン化されているか
どうかを検証するため、 FH-GRBN を発現させた 293T 細胞にプロテアソ一ム阻害
剤である MG1 32 を処置した。 GRBN の自己ュビキチン化は MG1 32 存在下で検出さ
れ、またそのュビキチン化は Gu 14A を s i RNA により発現抑制することにより減
少することが分かった（
図 2D) 。対照的に DDB1 の s i RNA では GRBN の発現量が減少
したことから（
図 10) 、 DDB1 発現抑制による GRBN の自己ュビキチン化への影響
を解析することができなかった。しかしながら、それは DDB1 が GRBN に機能的
に関わつていることを示唆するものである。
[0048]
次に、 GRBN の機能発現における DDB1 の役割を明らかにするために、本発明
者は DDB1 との結合能を欠くGRBN 変異体を作製した。欠損変異体を用いた解析
によりGRBN における 187-260 番目のアミノ酸領域を欠損させた変異体は DDB1 と
結合しないことが判明した（図 11、 A Mi d) 。 A Mi d を発現する 293T 細胞にお
いて、 MG1 32 の処理による自己ュビキチン化は野生型 GRBN を発現させた場合と
比べ著しく低下していた。以上の結果より、 GRBN は機能的に E3 ュビキチンリ
ガーゼのサブユニットであり、 Gu l 4A 、 DDB1 依存的な自己ュビキチン化を受け
ることが示唆された。
[0049]
〔実施例 3 〕サリドマイドによる GRBN 機能の阻害
GRBN- サリドマイド間の結合とその機能的重要性の基盤を明らかにするため
に、本発明者はサリドマイド非結合性でありながらE3 複合体形成能を有する G
RBN 点変異体
を得たいと考えた。まず N末端側欠損変異体と G末端側欠損変異体
を作製し、サリドマイド結合領域を調べた結果、 G末の 104 アミノ酸領域であ
ることが判明した（図 3A及び B) 。シロイヌナズナからヒトに至るまでの多数
の GRBN ホモ口グの相同性解析からG末端側が極めて保存されていることが分か
つた（図 12) 。進化的によく保存されたアミノ酸がサリドマイドとの結合に
重要なのではないかと考え、いくつかの点変異体を作製した。そして二つの
アミノ酸、 Y384 あるいは W386 をァラニンに置換した変異体はサリドマイド結
合能が低下することが分かった（
図 3G) 。さらに、 Y384A/W386A (GRBN YW/AA
と呼ぶ二残基同時に置換した変異体）は極めてサリドマイドとの結合能が低い
ことが分かった（
図 3 G) 。本発明者はこの GRBN YW/AA が活性を保持しているの
か調べた。細胞内局在は野生型とこの変異体で差異は見られなかった。本発
明者はこの GRBN YW/AA においても DDB1 、 Gu l 4A 、 Roc1 が免疫沈降により精製さ
れ、 MG1 32 存在下において自己ュビキチン化されることを見出した（
図 3 E及び F
) 。つまりGRBN YW/AA は野生型 GRBN と同様に E3 複合体を形成し、機能も保持し
ていることが分かった。
[0050]
かくして本発明者は、 GRBN を含む E3 複合体においてュビキチン化をサリド
マイドが阻害するかどうかを検証した。 293T 細胞に FH-GRBN あるいは FH-GRBN
YW/AA を安定的に発現させ、 MG1 32 および薬理学的に妥当な量のサリドマイド（
10 , 30, 100
M)
で処置した。野生型 GRBN の自己ュビキチン化はサリドマイドに
より強力に阻害されたが、 GRBN YW/AA の自己ュビキチン化はサリドマイドに
より阻害されなかった（
図 3G) 。よって、サリドマイドは GRBN と結合すること
によりその E3 機能を阻害することが示唆された。
[0051 ]
〔実施例 4 〕生体内におけるサリドマイドの標的としての GRBN
次に本発明者は動物モデルを用いてサリドマイド催奇性における GRBN の役
割を検証することにした。サリドマイドはマウスにおいては催奇性を呈しな
いが、ゥサギゃニヮトリにおいては発揮する
ては、本発明者はゼブラフィッシュ
（Dan i o
（引用文献 1-3)
rer
io)
。本研究におい
を以下に示す理由でモデ
ルとして採用した。（i ) 発生が早くまた体が透明なことから観察が容易（i i ) 遺
伝子抑制が比較的容易
において適している
（引用文献 2 1 )
（引用文献 22)
( i i i) ゼブラフィッシュは薬理毒性科学
。従来、サリドマイドがゼブラフイツシ
ュにおいても催奇性を示すかどうかは知られていなかった力、近年になりサ
リドマイドはゼブラフィッシュにおいて血管新生阻害を引き起こすことが分
かったので
（引用文献 23)
、本発明者はゼブラフィッシュにおいてもサリド
マイドが催奇性を示すと考えた。
[0052]
ゼブラフィッシュ発生におけるサリドマイドの影響を明らかにするために
、卵殻を除いた胚を様々な濃度のサリドマイドを含んだ培地に移した。サリ
ドマイドは 2 hpf
(hours
post
fert
i I i z a i t i on,
受精後時間）に加え、 3 日間
、発生プロセスを観察した。サリドマイドに薬浴した胚においては胸鰭およ
び耳胞の発生が阻害されていることが分かった
（図 4 A 及び B)
。しかし他の
部位においては特に異常を検出することはできなかった。より特異的には 75h
p f における Endoske
l eta l d i s c の胸鰭形成が阻害されており（
図 4A) 、 30hpf
おける耳胞のサイズが減少していた
リドマイドに薬浴させた 48hpf
（図 4B)
に
。胸鰭発生の遅延についてはサ
の胚においても検出することができた
（図 5 G及
びり）。近年の研究によると、硬骨魚（te l eost 、ゼブラフィッシュを含む）に
おける胸鰭と耳胞の発生は、四足動物（tetrapod)
における四肢と耳の発生と
同様の分子メカニズムを共有することが報告されている
（引用文献 24-26)
。
このようにして、サリドマイドにより誘導されたゼブラフィッシュにおける
発生異常は、妊娠初期の女性がサリドマイドを服用したことにより生じる発
生異常と極めて類似しており、サリドマイド催奇性は脊椎動物において種間
を超えて保存されていることが示唆された。
ゼブラフィッシュにおいても GRBN のオルソログ（
相当するもの）があり、 z
[0053]
c rbn
と呼ぶ。この遺伝子産物はヒトにおける GRBN と 70% 程度の保存性がある。
本発明者はまず、 z c rbn
mRNA の発現パ
ターンを解析し、 48hpf
において z c rbn
が脳、頭部血管、耳、そして胸鰭において発現していることを明らかにした
( 図 13 ) 。 zGrbn はサリドマイドにもヒ卜の DDB1 にも結合した（
図 14 ) 。つま
りゼブラフィッシュにおいてもヒト細胞系における解析結果は有効であると
考えられる。次に、ゼブラフィッシュ初期発生における zGrbn の影響を解析し
た。サリドマイドと同様に、 z c rbn アンチセンスモルフォリノオリゴ (AM0) を
注入した胚においてはヒレ及び耳の発生に異常が見られ（
図 4G-F ) 、サリドマ
ィドで処置した場合と表現系が類似した。たとえば 27hpf
0
においては z c rbn
AM
を注入した胚においては野生型と比べ耳胞のサイズは 40% も低下していた（
図
。そしてこの結果は z c rbn の mRNA を AM0 と共に導入することにより打ち消さ
4F)
れた（
図 4G-F) 。
[0054]
これらの結果より、サリドマイドによる催奇作用は zGrbn の機能を阻害する
ことによって引き起こされたのではないかという可能性が極めて濃厚になつ
た。では、もしそうであればサリドマイドと結合しないが機能は保持された z
Grbn
を発現させることによって、その催奇性は緩和されるはずである。この
アイディアを検証するために、本発明者は Y374 および W376 をァラニンに置換
した変異体（ヒトにおける YW/AA つまりY384A/W386A
。 zGrbn
YW/AA
に相当する）を作製した
はサリドマイドに対する結合能が極めて低い。サリドマイド非
存在下、野生型 zGrbn および zGrbn
YW/AA
を過剰発現させた個体においてヒレ
及び耳胞の発生に無処置の個体と差異が見られなかった。図 4 B で示したよう
に、 400
Mのサ
リドマイド処置により、耳胞のサイズは有意に減少した（コ
ントロールと比べ 64.
5 %。図 5 A 及び B)
。野生型 zGrbn を過剰発現させた胚にお
いてもサリドマイドにより、耳胞のサイズがコントロールと比べ 66% 程度に減
少した。しかしながら、重要なことに zGrbn
YW/AA
を過剰発現させた胚におい
てはサリドマイドの処置は耳胞のサイズに影響を及ぼさなかった
。サリドマイドによるヒレの縮退も、 zGrbn
（p=0. 347)
YW/AA の過剰発現により打ち消さ
れた。これらの結果は、サリドマイドが GRBN と結合し、その機能を阻害する
ことにより催奇性を引き起こしたことを示すものである。
〔実施例 5 〕サリドマイド催奇性の分子メカニズム
[0055]
サリドマイドと GRBN の関連性については判明したので、本発明者は GRBN を
含むュビキチンリガーゼ複合体が催奇性に関わるのかどうかを、 zGu 14 A を発
現抑制することで、検証した。 zcu l 4 a mRNA は脳やヒレで強く発現している（
図 1 3 ) 。予想通り、 zcu l 4 a AM0 により耳胞及びヒレの異常が生じた（図 4G- I ) 。
において zGu l 4 a を発現抑制した胚では耳胞サイズが著しく減少しており
27hpf
( コントロールサイズの 40%)
、 zcu l 4 a の mRNA 導入により部分的にも救済
（re
された。救済が部分的だったのは、 zcu l 4 a AM0 の効き目が強すぎたた
scue)
めかもしれない。これらのことより、少なくとも、ュビキチンリガ一ゼ複合
体が耳とヒレの発生に必要でぁリ、サリドマイドの標的であることが示唆さ
れた。
以上の結果から、 GRBN を含む E3 複合体により一定のタンパク質がュビキチ
[0056]
ン化されることは耳やヒレの発生において重要であることがわかり、またサ
リドマイドによる発生異常は GRBN を含む E3 複合体の機能不全が関係している
ことが示唆された。 GRBN およびサリドマイドの下流シグナル伝達の手がかり
を得るために、ヒレの発生のカギとなる良く知られた分子を解析することに
した。ソニックヘッジホッグ（Son i c hedgehog,
of
p o l a r i z i n g act
i v i ty)
i dge)
は四肢
ヒレにおける AER
に発現する因子であり、遠近軸にそった四肢
ある。サリドマイドを投与した 48hpf
くは消失したが
（図 5G)
された。 zGrbn
の胚においては fgf8a
(ap i c a l
zone
発現の低下は、 zGrbn
ectoderma
ヒレの伸長に必須で
の発現が低下もし
、 shh の発現に変化は見られなかった
てサリドマイドによる fgf8a
escued)
は極活性領域（ZPA,
に発現する因子であり、四肢 ' ヒレの前後軸を規
定する（引用文献 27) 。また Fgf8
I
Shh)
（図 5D)
。加え
YW/AA の導入により救済
（r
および zGu l 4 A に対する AM0 を導入した胚においても fgf
8a 発現が低下したが、 shh 発現は差異が見られなかった。よって、 FGF8 産生を
阻害する因子がサリドマイドゃ GRBN を含む E3 複合体の下流の標的かもしれな
い。
[0057]
〔実施例 6 〕 GRBN 及び DDB1 に対するフタルイミドの結合性
既知の非催奇性サリドマイド誘導体であるフタルイミドの GRBN 及び DDB1 に
対する結合性を以下のようにして調べた。
[0058]
293T 細胞抽出液をサリドマイド固定化ビーズと混合した後、洗浄を行った
。サリドマイド又はフタルイミドを用いてサリドマイドに結合した因子を溶
出させた。溶出画分中の GRBN および DDB1 をウェスタンブロッテイングで解析
した。サリドマイドの溶出画分からは GRBN 及び DDB1 が検出されたが、フタル
ィミド（
Phtha l ) の溶出画分からはこれらのタンパク質は検出されなかった（図
16) 。
[0059]
〔実施例 7 〕
サリドマイド誘導体と GRBN の結合の検討
293T 細胞抽出液をサリドマイド固定化ビーズと混合し、 2 時間反応させた。
その後、 0 . 5%NP-40 l ys i s buffer
(Tr i s-HCI pH8,
50
mM
NaCI , 0 . 5%NP_40) で 3 回洗浄し、 0 . -
mM のサ
リドマ
ィド、フタルイミド、グルタルイミド、もしくは 5HPP-33 ( 各化合物の構造式
を図 1 7 に示す。）を含む 0 . 5 % NP-40 l ys i s buffer で 1時間混合することで G
RBN の溶
出を行った。得られた溶出画分は、 SDS-PAGE の後、 GRBN 抗体に対する
ウェスタンブロッテイングを行い、解析した。この結果を図 1 8 に示す。
[0060]
図に示すように、フタルイミド又は 5HPP-33 を含む buffer を用いた場合には
、 GRBN はほとんど溶出されなかった。このことから、フタルイミド及び 5HPP33 は GRBN に対する結合性が低いと考えられる。
[0061 ]
〔実施例 8 〕
多発性骨髄腫細胞に対する増殖抑制試験
サリドマイド及び 5HPP-33 の多発性骨髄腫細胞 Kms1 2 に対する増殖抑制作用
を調べた。
多発性骨髄腫細胞 Kms1 2 の培養には RPM I Med i u m
640
( 0 % FBS)
を用いた
。各薬剤処理を行う場合には Kms1 2 を 1 ml あたり2 x 105細胞に調整し、
ml
e
ppendorf
tube に 2 ml ずつ分注した。添加する薬剤（
サリドマイドもしくは 5HP
P-33) はジメチルスルホキシド（DMS0) を溶媒として最終濃度の 1000 倍濃度の
ストツク溶液を作製し、 2 ml の細胞懸濁液に対し2 パ I のストツク溶液を加え
、穩ゃかかつ十分に転倒混和させた。処理後、 96 we l l p l ate に 1we l l あたり
00 ； I 分注したものを 37°C , 5%G0 2のインキュベータ一で 48 時間培養した。処
理後 48 時間での細胞数の測定には生細胞数測定試薬 SF (naca l a i tesque) を 1 w
e l l あたり10 ； l 加え 37°C ,
5%G0 2のインキュベータ一で 2 時間培養した。細胞
数に比例する 450 n m吸光度の測定には Gl oMax- M
t i + Detect i on System (prom
ega) を用いた。検量線の作製には 1 ml あたり1 x 10 , 3 x 1 05,
x 105細胞の Km
s 1 2 を用いた。溶媒処置時の細胞数を 100 とし、薬物添加時の細胞数を相対値
で表した。 48 時間培養後の細胞数の相対値を図 1 9 に示す。
[0062]
図に示すように、 5HPP-33 は、多発性骨髄腫細胞 Kms1 2 に対して強い増殖抑
制作用を示した。実施例 7 に示すように、 5HPP-33 の GRBN に対する結合性は低
し、。従って、 5HPP-33 の増殖抑制作用は、 GRBN との結合と無関係なものである
と考えられる。
[0063]
〔考察〕
GRBN の機能が DDB1-Gu
l 4A-Roc1 E3 ュビキチンリガ一ゼ複合体における基質
レセプタ一であることは支持される。 GRBN と良く知られた基質レセプターで
ある DDB2 は DDB1 と競合的に結合する。第二に、 GRBN は他の基質レセプターと
同様に自己ュビキチン化される。 DDB2 を含む多くの基質レセプタ一が WDXR 構
造 (mot i f ) を有する（引用文献 11, 19) 。一方で、少数のいくつかの基質レセ
プタ一にはそれが欠けている（引用文献 13 , 18) 。 GRBN には明確な WDXR モチ一
フが見当たらないことから、どうも後者のタイプのようである。上記の考え
を支持する結果として、 GRBN および Gu l 4A のゼブラフィッシュによる発現抑制
が似たような結果をもたらしたことが挙げられる。ただし、 GRBN の発現抑制
に比し、 Gu l 4A の発現抑制は形質に及ぼす影響がより深刻であった。この観察
結果はそれほど驚くにはあたらない。なぜならば、 GRBN を有する DDB1-Gu l 4A
ュビキチンリガーゼはほんの少量にしか存在せず、 GRBN は DDB1-Gu 14A のほん
の少数の複合体にしか影響を与えられない一方で、 Gu l 4A の抑制はすべての複
合体に影響を与えることになるからである。
[0064]
サリドマイドの作用メカニズムは多面的かつ多角的であって完全にはわか
つていない。サリドマイドの免疫調節作用や血管新生阻害作用が、らい性結
節性紅斑、多発性骨髄腫に対する治療効果あるいは催奇性に関与していると
考えられている（引用文献 2、3) 。また、サリドマイドが、 TNF_a l pha や VEGF
などの複数のサイトカインの産生を抑制すること（引用文献 30 、 3 1 ) 、及び
アポトーシス誘導、活性酸素種（
R0S) 産生などの作用があること（
引用文献
3、4、32) が報告されている。これらデータが蓄積しているにもかかわらず
、サリドマイドの直接の標的は不明であった。ここで本発明者は GRBN がサリ
ドマイドの催奇性の主要な標的因子であるといういくつかの証拠を得た。第
— に、サリドマイドは直接的に GRBN に結合し、 GRBN の自己ュビキチン化を阻
害する。これは形成しているュビキチンリガーゼの阻害が原因であり、他の
ュビキチンリガーゼにおいても類似した現象が見られる（引用文献 33) 。第
二に、サリドマイドによるゼブラフィッシュの発生異常は、 GRBN を発現抑制
した場合と類似しており、サリドマイド非結合の GRBN 変異体を過剰発現させ
ることにより緩和されるということである。第三として、四肢
ヒレの伸長
に必須な FGF8 がサリドマイドおよび GRBN 複合体の下流にある標的であるとい
うことである（図 4 D、 4 G、50
。これらの結果は過去の報告とも矛盾なく一
致しており、サリドマイドによる fgf8 の発現抑制はゥサギを用いた実験です
でに示されている（引用文献 34) 。また、発生中のニヮトリの肢芽において
、サリドマイドは BMP (bone morphogenet i c prote i n) の発現を上昇させ、ァ
ポト一シスを引き起こすことが報告されている（引用文献 32) 。マウス BMP は
AER において FGF8 の発現を抑制し、アポトーシスを引き起こすことが報告され
ている（引用文献 35) 。つまりGRBN は、これまでに不明であったサリドマイ
ドとこれらの発生制御因子の間の隔たりを埋めることのできる因子である。
[0065]
上記実施例の結果はサリドマイドが引き起こす催奇性は GRBN の結合および
それに伴うュビキチンリガーゼ活性の阻害により引き起こされることを示唆
している
（図 1 5 )
。本発明者はサリドマイドおよび GRBN により引き起こされ
るュビキチン依存性のタンパク質分解の制御が、 BMP や FGF8 経路や正常な発生
メカニズムの異常をもたらしたと推測される。他の発生因子も影響を受けて
いるかもしれない。しかしながら、まだ沢山の問いが残されている。たとえ
ば、 GRBN を含む E3 複合体の標的基質は何か、どのようにしてサリドマイドは G
RBN のュビキチン化を阻害するのかなどの問題に取り組むことが必要であろう
[0066]
〔実験手法と材料〕
)
(
薬剤
サリドマイド（Tocr i s Cookson)
の最終濃度が 400mM になるようにジメチル
スルホキシド（DMS0) を加え、 6 5 °C に加熱して溶解し、直ちに使用した。 MG1 3 2
は最終濃度 1 0mM になるように DMS0 を加えて溶かした。実験においては陰性対
照
[0067]
（コントロール）として同等量の DMS0 を用いた。
( 2 )
サリドマイド固定化ビーズの作製
サリドマイド固定化ビーズの作製に関する図を図 6 に示した。磁性 F G ビーズ
引用文献 1 0 ) に対して 1 0mM の 1- hydroxybenzotr
(5mg,
(3-d
i methy
I tha
I -am i nopropy
l i domi d e der
i vat
I ) -carbod
i i
i azo l e ,
i d e HG I , そして 2mM の FR259625
溶媒である N , N_d i methy
i ve)
-ethy
0mM
l formami
de
l -3-
(carboxy
(DMF) 中
で 4 時間室温で反応させることにより、サリドマイドを固定化した。また F G ビ
ーズにおける未反応のアミノ基は 20% の無水酢酸が含まれた DMF 中反応させる
ことにより保護した。完成したビーズは 4 °C で保存した。
[0068]
( 3 )
サリドマイド固定化ビーズを用いたァフィ二ティ精製
サリドマイド固定化ビーズ
l y s i s buffer
(50mM
Tr i s
HCI
を行った。細胞抽出液は HeLa,
Y,
(0. 5mg)
pH8,
Jutkat,
は 0 . 5%NP_40
50mM
NaCI ,
THP-1 ,
0 . 5 % NP-40)
U266,
HUVEC,
により平衡化
LP1 0 1 ,
293T 由来と多岐にわたるが、それらの抽出法は文献の通りである
献 36)
SH-SY5
（引用文
。これらの抽出液にビーズを混合し、 2 時間反応させた。 0 . 5 % ΝΡ -40
y s i s buffer
でビーズを 3 回洗浄した後、 1mM サリドマイドによって溶出した
I
。いくつかの実験では、 0 . 3mM のサリドマイドをビーズとの混合前に抽出液に
加えた。フタルイミドが結合するか否かについては、遊離サリドマイド1mM で
溶出する過程で、代わりに 1mM のフタルイミドで溶出した。
[0069]
プラスミド
( 4 )
GRBN や DDB2 cDNA は RT-PGR により HeLa
tota
RNA から得た。 GRBN の変異体は
l
標準的な PGR 法により作製した。 DDB1 cDNA については Matsunaga
を受けた。 zGrbn そして zGu l 4 a cDNA は 24hpf
t al
pcDNA6/V5-H
trogen)
,
is
pFASTBACI
( In
i trogen)
,
pFastBad
( In
i trogen)
,
pLent
て PGEX6P- 1 (GE Hea は hcare)
DNA3.
( 5 )
i6
( In
i trogen)
i trogen)
, pLent
,
pCS2
i6
(+) ,
( In
i
そし
に FLAG-HA 配列を導入したものである。
抗体
FLAG
(M2,
DDB1
(Abeam) そして Rod
S i ma ) ,
HA
(3F1 0 ,
を抗原としてゥサギから作製したものである。
Roche)
(Zymed)
,
V5
(V5-1 0 ,
S i ma ) ,
GST
( S i ma ) ,
は購入した。 Gu l 4 A および DDB2 は譲渡された
ものであり、それぞれ Raychaudhur
( 6 )
( In
1-F
。 pcDNA3. 1-FH-N は pcDNA3. 1 の派生物であり、 c
GRBN 抗体はヒトGRBN (65-76)
[0071 ]
におけるゼブラフィッシュ胚の t o
RNA より RT-PGR で得た。本研究では以下のベクタ一を用いた。 pcDNA3.
H-N,
[0070]
博士から提供
け専士、 Matsunaga
博士のご厚意による。
サリドマイド固定化ビーズを用いた試験管内結合試験
組み換え GRBN-FLAG および DDB1_V5_H i s タンパク質は昆虫 Sf9 細胞において Ba
c-to-bac
( I n v i trogen)
バキュロウィルスシステムによって発現させ、それぞ
れ抗 FLAG M2 ァガロースビーズ
（S
i gma) 、 N i _NTA ァガロースビーズ
より精製した。精製した GRBN-FLAG
and/or
DDB1_V5_H
（Q
i agen)
に
i s にサリドマイド固定
化ビーズを混合し、結合タンパク質を SDS s a m l e buffer
で溶出した。 GRBN 欠
損変異体解析においては、 GST 融合 GRBN およびその変異体を大腸菌である BL21
で発現させ、グルタチオンセファロ一スビーズ
RBN 変異体は L i pofectam
i n e 2000 ( I n v i trogen)
（GE
h e は hcare)
を用いて 293T 細胞に導入し過剰
発現させた。そのあとの結合試験は上述と同じである。
[0072]
( 7 )
免疫共沈降
で精製した。 G
GRBN
と DDB1 の間の相互作用を解析するために、 GRBN-FLAG および DDB1-V5-H i
s を Sf9 細胞内に共発現させた。細胞抽出液に抗 FLAG ァガロースビーズを混合
し、結合因子を FLAG ペプチドで選択的に溶出した。 GRBN 複合体を精製するた
め GRBN およびその変異体を発現する 293T 細胞を作製し、上述の方法で FLAG 免
疫精製を行った。
[0073]
( 8 ) 免疫染色
HA タグゃ V5 タグ融合
を用いた GRBN や DDB1 を過剰発現する HeLa 細胞を固定し
た後、抗 HA 抗体や V5 抗体と混合させ、 A l exa F l uor 594 もしくは 488 ( I nv i tro
gen) 標識二次抗体と反応させた。
[0074]
( 9 ) 試験管内ュビキチン化試験
ュビキチン化試験は引用文献 37 を参考にして行った。 FH-GRBN 複合体（
200 η
g) 、 Uba
(500ng, Bi omo l ) 、 UbcH5b (500ng, Bi omo l ) 、 GST- Ub i qu i t i n (4000n
g , Ca l b i ochem) , 4mM ATP を 30 °C で 2 時間、 15 パ I スケールで反応させた。反応
は、 SDS を加え、 98 °C で 5分間加熱して停止させた。
[0075]
(
0 ) 生細胞における自己ュビキチン化
この試験は引用文献 38 を参考にして行った。 FH-GRBN もしくはその変異体を
安定的に発現させた 293T 細胞に 0
Mの MG1 32 もしくは DMS0 単独 (veh i c I e) を加
え、 3 時間反応させた。細胞は 25
Mの MG1 32 および 10mM の N-ethy l ma l e i mi de を
含む R I PA バッファーで溶解した。 FH-GRBN を上述の方法で免疫沈降し、解析し
た。各濃度のサリドマイドは、 MG1 32 を処理する 1 時間前に加えた。
[0076]
(1
) RNAi
以下に示すような Stea は h RNAi o l i gonuc l eot i de ( l nv i trogen) を使用した
[0077]
：
DDB1
#
DDB1
#2 :
5' -CAUACCUUGAUAAUGGUGUUGUGUU-3'
(配列番号 1 )
5' -CAGUAAUGAACAAGGCUCCUAUGUA-3'
(配列番号 2 )
Cu l 4A
#1:
5' -GCAAAGCAUGUGGAUUCAAAGUUAA-3'
(配列番号 3 )
Cu l 4A
#2 :
5' -GAAUCUCUGAUAGACAGAGACUAUA-3 '
(配列番号 4 )
センス鎖のみ示した。コントロールとしては Stea は h RNAi negat i e contro l
of
l ow GC content
( l n v i trogen)
を用しゝた。 L i pofectami
n e RNAi MAX を用しゝて
293T 細胞に 40nM のォリゴヌクレオチドを導入し 7 2 時間後に細胞を回収した。
[0078]
( 1 2 )
ゼブラフィッシュ
魚は 28. 5 °C において 14 時間可視光明期、 10 時間暗期のサイクルで飼育した
胚は自然交配で得ている（引用文献 35)
[0079]
。アルシアンブルー染色やマイク
口インジェクション、 i n s i t u ハイブリダィゼ一シヨンは以下の項に示してい
る。ゼブラフィッシュにおける GRBN および Gu l 4 A (zcrbn
and
zcu l 4a)
はゼブ
ラフィッシュ命名法委員会のガイドに従った。
[0080]
(
3 )
ゼブラフィッシュのサリドマイド処理
サリドマイドは DMS0 に溶かした。そしてあらかじめ 6 5 °C に加熱しておいた E
3培地に 400
Mになるように加えた。ゼブラフィッシュ胚は脱卵殻し、以下に
示すようにサリドマイドに薬浴させた。 2hpf において胚を 2mg/ml のプロテア
ーゼタイプ 14 ( S i gma) に 3 分間反応させ、 5 回培地で洗浄した。その過程で脱卵
殻されるが、直ちにサリドマイド含有培地に交換し、 3 日間観察した。サリ
ドマイド含有培地は 1 2 時間毎に交換した。
[0081 ]
( 1 4 )
アルシアンブルー染色
コンドロサイトの外部マトリックスは、アルシアンブル一で染色される（
引用文献 40)
。ゼブラフィッシュ胚は 3 . 7 %の中性ホルムアルデヒドにより一
晚固定した。翌日、 100% エタノールで洗浄後、 PBS で再水和させた。次いで、
0 . 05% トリプシンを含む飽和四ホウ酸ナトリゥム溶液にて 1-3 時間反応させた
。 3 %の過酸化水素と 1 %の K0H 溶液により魚の斑点を除去し、 70% グリセ口一ル
含有 PBS 溶液にて保存した。
[0082]
( 1 5 )
アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドおよび mRNA のマイク
口インジェクション
細胞期におけるマイクロインジェクションについては引用文献 39 に従つ
て行った。我々は窒素ガス圧力マイクロインジェクター
)
（I M 300,
Nar i s h i e
を注入に使用した。 Gap のついた mRNA は i n v i tro において mMESSAGE
mMACH I NE
i n v i tro
i p t i o n k i t (Amb i on) で作製した。
transcr
RNA は使用直前にヌクレア一ゼ除去水で 600ng/
[0083]
パ Iの濃度になるように調製
した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（Gene Too l s ) は以下のとおりである
[0084]
zCrbn
AM0 :
zCu l 4 A AM0 :
5'
-AGAGCTGTAGCTGGTTCCCCATTTC-3
5'
-CTGGTGCTGAACATCTTCTGCCATC-3'
これらのオリゴはヌクレア一ゼ除去水で 700
[0085]
(
(配列番号 6 )
Mの濃度に調製して使用した。
ホールマウントi n s i t u ハイブリダィゼ一シヨン
6 )
この実験は引用文献 4 1 に従って行った。 zcrbn
ブは5'
(配列番号 5 )
'
mRNA のアンチセンスプロ一
- コード領域の 5 13bp を用いた。 zcu l 4 a については 3 '
ド領域）の 590bp を用いた。 shh および fgf8
非コ一
UTR (3'
に対応するプローブはそれぞれ Kra
uss 博士および T h i sse 博士のご厚意による。プローブの浸透性を増すために、
胚は 0 . % Tween- 2 0 および 10mg/ml の prote
i nase
K を含んだ PBS において 2 分間
常温で反応させた。
[0086]
耳胞サイズ計測
( 1 7 )
48hpf
におけるゼブラフィッシュ胚に 1%メチルセルロースおよび 0 . 003% の 3 _
ami n o benzo
i c a c i d ethy
l
ester
( S i gmaj ¾：
用しゝて麻酔を她し、スライ卜グラ
スに乗せた。そして 10 個の個体を各サンプルからランダムに選び、耳胞を撮
影した。サイズは N I H i mage
J ソフトウェアを用いて計測し、コントロールの
耳胞のサイズと比較した。平均値および標準偏差を計算し、 p 値は Mann-Wh i t n
ey,
[0087]
U検定を用いて算出した。
〔引用文献一覧〕
引用文献 1 ：M .
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引用文献 2 ：M .
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2 16
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4 10
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Deve l opment
34,
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引用文献 37 :
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Gro i sman et
引用文献 3 8 ：F . Ohtake
引用文献 39 :
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引用文献 36 :
9
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58,
3
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(2008) .
産業上の利用可能性
本発明は、被験物質がサリドマイド様の催奇性を有するかどうかの判定に
利用することができ、サリドマイドの代替薬ゃサリドマイドの催奇性を抑制
する医薬などの開発に利用することができる。
請求の範囲
[ 請求項 1]
被験物質をセレブロンもしくはその断片と接触させ、被験物質のセ
レブロンもしくはその断片に対する結合性を評価し、セレブロンもし
< はその断片と結合しない被験物質、又はセレブロンもしくはその断
片との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特
徵とする非催奇性物質のスクリーニング方法。
[ 請求項 2]
被験物質が医薬であることを特徴とする請求項 1 に記載の非催奇性
物質のスクリーニング方法。
[ 請求項 3]
被験物質が、一般式（1 )
[ 化 1]
R
4
で表されるサリドマイド誘導体であることを特徴とする請求項 1 又は
2 に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法；
ただし、式（1 ) 中、 X が R
を化合物（A ) 、 X が R
) 及びX が R
5
5
で、 Y が R
_ R
7
で、 Y が R
で、 Y が R
6
_ R
8
5
8
6
_ R
8
である場合
である場合を化合物（B
である場合を化合物（C )
とし、
また、 R 、 R 2 、 R 3 および R 4 は一 H ；— O H ；= 0 ；直鎖および
分枝アルカン、アルケン、アルキン；環式アルカン、アルケンおよび
アルキン；環式ならびに非環式アルカン、アルケンおよびアルキンの
組み合わせ；アルコール、アルデヒド、ケトン、カルポン酸、エステ
ル、または環式、非環式と組み合わせたエーテル部分、あるいは環式
非環式部分の組み合わせ；ァザ；ァミノ；_ M O n または _ 0 _ M
O n
[ 式中、 M = N そして n = 2 ；M = S そして n = 2 または 3 ；あ
るいは M = P そして n =
_ 3 である]
；そしてハロゲンから選択す
ることができ；R 5 、 R 6、 R 7および R 8 はそれぞれ独立して式（2 )
[ 化 2]
Z
|
-
Z
|
C -
o -
または _ 0 _
(2 )
N - R
0
( 式中、 Z は任意であり、そして上記 R の定義と同じ
である）から選択され；そして R 10 は上記
の定義と同じである力、、
または（Z がない場合には） R 10 は = 0 であり；
R 9 は式（3 ) 、（4 ) 、（5 ) 、 ( 6 ) または（7 )
[ 化 3]
—
R
2
[ 化 4]
[ 化 5]
R l2
R l3
R
R i5
G —
[ 化 6]
- R ii
l5
R l
—
R l6
式中、各々の R
_ R
17
は（
独立して）上記 R 5の定義と同じであり、
[ 化 7]
I
R
2 0
式中、 R
H,
-
18
、R
- C H
(C H
2
)
,
19
および R 20 は独立して
- C O O H,
n C O N H
_ C O N H
2
,
- C H
2
)
n - C O O H,
2
から選択され、 n = 1 _ 4 を有する部分である。
[ 請求項 4]
セレブロンの断片が、配列番号 7 に示すアミノ酸配列において、そ
の N末端から339 〜442 番目のアミノ酸配列を有し、それ以外のァミノ
酸配列において 1 又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失および
又は
付加がなされたアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請
求項 1 〜 3 のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
[ 請求項 5]
セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とす
る請求項 1 〜 4 のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方
法。
[ 請求項 6]
サリドマイド誘導体が、サリドマイド又は既知のサリドマイド誘導
体のもつ薬理作用を持つものであることを特徴とする請求項 3 に記載
の非催奇性物質のスクリーニング方法。
[ 請求項 7]
被験物質をセレブロン又はその断片と接触させ、被験物質とセレブ
口ン又はその断片の結合性を調べ、セレブロン又はその断片と結合す
る被験物質を選択する工程、及び前記工程で選択された被験物質の中
から、 i ) 催奇性、又は i i ) セレブロンを含むュビキチンリガ一ゼ複合
体の活性阻性作用を軽減する物質を選択する工程とを含むことを特徴
とする催奇性物質のアンタゴニス卜のスクリーニング方法。
[請求項 8]
セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とす
る請求項 7 に記載の催奇性物質のアンタゴニス卜のスクリーニング方
法。
[ 請求項 9]
以下の
（a)
及び
又は (b) のァミノ酸置換を有することを特徴とする
変異型セレブロン；
(a) ヒト由来のセレブロンにおける N末端から384 番目のチロシン若し
< はこれに相当するアミノ酸がァラニンに置換されたもの
(b) ヒト由来のセレブロンにおける N末端から386 番目のトリプトファ
ン若しくはこれに相当するアミノ酸がァラニンに置換されたもの。
[ 請求項 10 ]
請求項 9 に記載の変異型セレブロンをコードすることを特徴とする
核酸。
[ 請求項 1 1]
請求項 1 0 に記載の核酸を遺伝子として導入し、発現させたことを
特徴とするサリドマイド催奇性耐性非ヒト動物。
INTERNATIONAL
A.
CLASSIFICATION
G01N33/5
C 1 2N1
I
PCT / JP2 0 1 0 / 0 6 8 2 7 2
OF SUBJECT MATTER
6 6 (2
5/09
International application No.
SEARCH REPORT
6 . 0 1 ) i ,
(2 0 0 6 . 0 1 )
,
A01
K 6 7/02
G01N33/1
7 (2 0 0 6 .
5 (2 0 0 6 .
1 ) i ,
1 )
,
C O 7X2 4 / 4 3
G01N33/5
(2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B.
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
G 0 1N3
3 / 5 6 6 ,
A 01K 67/ 02 7 ,
C07K1 4/ 43 5 ,
C 1 2N1
5 / 0 9 ,
G 0 1N3
3 / 15 ,
G 0 1N3 3 / 5 0
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Kokai
Shinan
Koho
Jitsuyo
1922
Shinan
Koho
- 1 996
Jitsuyo
1 971-2010
Shinan
Toroku
Jitsuyo
Toroku
Koho
1996 - 2010
Shinan
Koho
1994-2010
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
CA/
REGI
STRY
JST
Plus
/ JME DPlu
/MEDLINE
/EMBASE
/ B I OS
S (STN ) ,
s / J S T 7 5 8 0 ( JDreaml
l )
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
C.
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Category*
A
HOHBERGER
the
ret
channel
,
B .
ina
and
s ,
FEBS
e t
a l . ,
b i nds
Lett
Cerebl
t o
. ,
on
i s
v o l t age-
expre
s sed
gated
2 00 9 . 0 1 . 2 1 ,
chlo
Relevant to claim No.
i n
1- 11
r i de
Vo l . 5 83 ,
No .
,
p . 633 - 63 7
A
IMMERMAN
,
teratogeni
o f
the
Agent
E .
c
Guadel
s
That
. ,
mechani
oupe
Prod
Chemi
cal
sm
Con
s t ructure
o f
f .
act
ion
Proceedi
"Methods
Congenital
1- 11
and
. ,
Detect
ngs
Envi
De f e c t s " ,
ron
1 975 ,
p . 7 9- 88
A
S CHUMACHER,
H . J . ,
teratogeni
c
Guade
loupe
Agent
s
prope
Conf
That
Prod
Chemi
cal
r t i e s . ,
.
s tructure
Pro
"Methods
Dete
Congenital
c t
1- 11
and
ceedongs
o f
Envi
the
ron
De f e c t s " ,
1 975 ,
p . 65- 77
See patent family annex.
Further documents are listed in the continuation of Box C .
*
"A
Special categories of cited documents:
document defining the general state of the art which i s not considered
to be of particular relevance
"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying tiie invention
"E
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
"X"
L
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited t o establish the publication date of another citation or other
special reason (as specified)
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive
step when the document i s taken alone
"Y"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled in the art
"&"
document member of the same patent family
"O"
document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion or other means
"P"
t o the international filing date but later than
Date of the actual completion of the international search
2 7
D e cember
,
2 0 10
(2 7 . 1 2 . 1 0 )
Name and mailing address of the ISA/
Japane
s e
Patent
Date of mailing of the international search report
1 1
January
Authorized officer
Of f i c e
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)
Telephone No.
,
2 01 1
(1 1 . 0 1 . 1 1 )
INTERNATIONAL
SEARCH REPORT
International application No.
PCT / JP2 0 1 0 / 0 6 8 2 7 2
C (Continuation).
Category*
A
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
F I CKENT SCHER, K . e t a l . , Teratogeni
city
and
embryotoxi
city
o f thal i domide
and 3 - a z a thal i domi d e i n mi c e . , Pharmaco logy , 1 9 7 ,
Vol . 1 1 , No . , p . 1 93 - 1 9 8
-1 1
P, X
Takumi
I T〇 e t a l . , " T suini
Kaime i ！ Thal i domi d e
g a Oko s u Sai k i s e i n o Na z o Hyoteki
Bunshi
Cereblon
o T sukitometa
F G Beads " , Chemi s try ,
0 1 Augu s t 2 0 1 0 ( 0 1 . 0 8 . 2 0 1 0 ) , vol . 6 5 , n o . 8 ,
page s
7 t o 51
-1 1
P, X
Hideki
A DO e t a l . , " Thal i domi d e Sa i k i s e i ,
Hyote k i I nshi
n o Dote i " , Cel l t e chno logy , 2 2
Jul y 2 0 1 0 ( 2 2 . 0 7 . 2 0 1 0 ) , v o l . 2 9 , n o . 8 , page s 8 1 2
t o 813
-1 1
P, X
Aki r a MURAKA
, " Around
the functi
onal
food
5 )
Thal i domi d e n o Hyoteki
Bun shi " , Food Style
21,
0 1 Septembe r 2 0 1 0 ( 0 1 . 0 9 . 2 0 1 0 ) , v o l . 1 4 , n o . 9 ,
page s 6 6 t o 6 7
-1 1
P, X
A AWA ,
. , e t a l . , mRNA d i s tribut
ion o f the
thal i domi d e recepto
r , cerebl o n , i n adult
rat
brain , Bul l e t ino f the Japane s e Society
for
Neuro chemi s try , 2 0 1 0 . 0 8 . 0 1 , Vo l . 9 No . 2 / 3 ,
Page . 5 8 9
-1 1
P, X
I TO, T . e t a l . ,
dent i f i cati o n o f a Primary
Target
o f Thal i domi d e Teratogeni
c i t y , Science
2 0 1 0 . 0 3 . 1 2 , Vol . 3 2 7 , No . 5 9 7 1 , p . 1 3 4 5 - 1 3 5 0
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (My 2009)
-1 1
,
INTERNATIONAL
SEARCH
International
REPORT
application
No.
PCT / JP2 0 1 0 / 0 6 8 2 7 2
Box No. I I
This international
Observations
where certain claims were found unsearchable
(Continuation
search report has not been established in respect of certain claims under Article
of item 2 of first sheet)
17(2)(a) for the following
reasons:
Claims Nos.:
because they relate t o subject matter not required t o b e searched by this Authority,
namely:
Claims Nos.:
because they relate t o parts of the international application that do not comply with the prescribed requirements to such an
extent that n o meaningful international search can b e carried out, specifically:
Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. Ill
This International
Observations
where unity of invention
Searching Authority
The i nventi
9 d o not have
i nclude
the
found multiple
i s lacking
(Continuation
of item 3 of first sheet)
inventions i n this international
( I nvent
ion
1)
h e i nventi
o n s d e s cribed
i n c l aims
A s creeni
n g method
compri
s ing
a s tep
o f " bringi
contact
w i t h c e rebron
o r a fragment
the reo f and evaluat
o f the
t e s t sub stance
t o c e rebron
o r the
fragment
( cont
1. [ X ]
application,
as follows:
o n d e s cribed
i n c l aim
1 and
the
i nventi
o n d e s cribed
the
s ame o r corre
spondi
n g spe c i a l t e chni cal
feature
.
fol lowi n g two
group
s o f i nvent
ions
-
i n claim
The c l aims
1- 8 :
n g a t e s t sub stance
ing the b i nding
properti
thereo
f " .
inued
A s all required additional search fees were timely paid by the applicant, this international
t o
ext
r a
sheet
into
es
)
search report covers all searchable
claims.
2. □
A s all searchable claims could be searched without effort justifying
additional fees, this Authority
did not invite payment of
additional fees.
3. □
A s only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, tms international
only those claims for which fees were paid, specifically
4. □
N o required additional
search fees were timely paid by the applicant.
restricted t o the invention
Remark
on Protest
search report covers
claims Nos.:
Consequently, this international
search report
first mentioned in the claims; it i s covered by claims Nos.:
The additional
search fees were accompanied by the applicant's
protest and, where applicable, the
payment of a protest fee.
The additional
search fees were accompanied by the applicant's
fee was not paid within the time limit specified in the invitation.
]
Form PCT/ISA/210
(continuation
N o protest accompanied the payment of additional
of first sheet (2)) (July 2009)
search fees.
protest but the applicable protest
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
Cont inuati on of Bo
No
International application No.
PCT / JP2 010/ 068272
.I ェ
ェof conti nuat ion of f i r st sheet (2)
(I nventi on 2) The invent ions de scribed i n claims 9- 11 :
A vari ant- type cerebron having a speci f c ami no acid subs t i tuti on .
Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)
国際出願番号
国際調査報告
P 2 0
P C
6 8 2 7 2
発明の属する分野の分類（
国際特許分類（I P C ) )
A .
G01N33/566 (2006. 01) :
A01K67/027 (2006. 01) :
G01N33/15 (2006. 01) i ，G01N33/50 (2006. 01) i
B .
C07K14/435
(2006. 01) i
，C12N15/09
(2006. 01) ：
調査を行った分野
調査を行った最小限資料（
国際特許分類（I P C ) )
Int.Cl.
G01N33/566,
A01K67/027,
C07K14/435,
C12N15/09,
G01N33/15,
G01N33/50
最小限資料以外の資料で調査を行った分野に含まれるもの
日本国実用新案公報
日本国公開実用新案公報
日本国実用新案登録公報
日本国登録実用新案公報
2
1
o
9
国際調査で使用した電子デ、
-スの 9
名称、調査に使用した用語 )
o
6
（
デぃ
-ス
CA/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580
(JDreamII)
111
年
(STN)
関連すると認められる文献
C .
引用文献の
カテゴリー *
A
引用文献名
HOHBERGiiR, B.
binds
関連する
請求項の番号
及び一部の箇所が関連するときは、その関連する箇所の表示
et
al. ， Cereblon
t o voltage-gated
i s expressed
i n the
channels,
FEBS Lett.
chloride
retina
and
1 -
1 1
of
1 -
1 1
，
2009. 01. 2 1， Vol. 583 ， No. 4 ， p . 633-637
ZIMMERMAN, E. F. ，Chemical
action.
Environ
， Proceedings
Agents
That
of
Prod
structure
the
and teratogenic
Guadeloupe
Congenital
*
引用文献
ΓΑ 」特に関連のある文献ではなく、一般的技術水準を示す
もの
ΓΕ 」国際出願日前の出願または特許であるが、国際出願日
以後に公表されたもの
「L 」優先権主張に疑義を提起する文献又は他の文献の発行
日若しくは他の特別な理由を確立するために引用す
る文献（
理由を付す）
Γθ 」口頭による開示、使用、展示等に言及する文献
ΓΡ 」国際出願日前で、かつ優先権の主張の基礎となる出願
2 7 .
2 .
1975 ， p . 79-88
パテントファミリーに関する別紙を参照。
の日の後に公表された文献
Γτ 」国際出願日又は優先日後に公表された文献であって
出願と矛盾するものではなく、発明の原理又は理論
の理解のために引用するもの
特に関連のある文献であって、当該文献のみで発明
x
の新規性又は進歩性がないと考えられるもの
「Y 」特に関連のある文献であって、当該文献と他の 1 以
上の文献との、当業者にとって自明である組合せに
よって進歩性がないと考え
Γ& 」同一パテントフアミリー文献
2 0 1 0
国際調査機関の名称及びあて先
日本国特許庁（I S A
J Ρ)
郵便番号 1 0 0 — 8 9 1 5
東京都千代田区霞が関三丁目 4 番 3 号
l S A
Detect
国際調査報告の発送日
国際調査を完了した日
様式 P C T
Conf. "Methods
Defects",
c 欄の続きにも文献が列挙されているc
mechanism
2 1 0
2 0
2 J
特許庁審査官（
権限のある職員）
(第 2 ページ）（2 0 0 9 年 7 月）
白形
3 4 9 6
由美子
0 3 -
3 5 8 1 -
1 1 0
内線
3 2 5 2
国際出願番号
国際調査報告
C
(続き） .
0 6 8 2 7 2
関連すると認められる文献
引用文献の
カテゴリー *
A
P 2 0
P C
引用文献名
SCHUMAしriER, H. J . ， Cneraical
properties.
Detect
関連する
請求項の番号
及び一部の箇所が関連するときは、その関連する箇所の表示
， Proceedongs
Environ
Agents
structure
of
That
the
Prod
and
teratogenic
Guadeloupe
Conf.
Congenital
Defects",
1 -
1 1
1 -
1 1
1 -
1 1
1 -
1 1
1 -
1 1
1 -
1 1
1 -
1 1
〃 Methods
1975 ，
p . 65-77
FICKENTSCHER, K.
thalidomide
Vol.
PX
1 1，
et
al. ， Teratogenicity
and 3-aza-thalidoraide
and
erabryotoxicity
i n mice. ， Pharmacology,
of
1974 ，
o . 4 ， p . 193-198
伊藤拓水他，ついに解明！サリドマイドが起こす催奇性の謎標
的分子セレブロンを突き止めた FG ビ - ズ，化学，2010. 08. 0 1，Vol. 6 5
No. 8 , Page. 47- 5 1
PX
安藤秀樹
他，サリドマイド催奇性，標的因子の同定，細胞工学，
2010. 07. 2 2 ， Vol. 29 No. 8 ， Page. 812—813
PX
村上明，機能性食品科学の周辺 54) サリドマイドの標的分子， Food
Style
PX
2 1， 2010. 09. 01,
AIZAWA,
M. ， e t
receptor,
Vol.
14 No. 9 , Page. 66- 6 7
al. , raRNA distribution
cereblon,
i n adult
rat
of
the
thalidomide
神経化学， 0 10 . 08. 0 1，
brain,
Vol. 4 9 No. 2/3 ， Page. 589
PX
IT0, T. e t al. , Identification
Teratogenicity,
Science,
o f a Primary
2010. 03. 12,
Vol. 327,
p . 1345-1350
様式 P C T
I SA
2 1 0
Target
(第 2 ページの続き）（2 0 0 9 年 7 月）
o f Thalidomide
No. 5971,
国際出願番号
国際調査報告
第 Π欄
P C T /
J P 2 0 1 0/
0 6 8 2 7 2
請求の範囲の一部の調査ができないときの意見（
第 1 ページの 2 の続き）
法第 8条第 3項（P C T 17 条（
2) (a) ) の規定により、この国際調査報告は次の理由により請求の範囲の一部について作
成しなかった。
1
.
Γ"
請求項
は、この国際調査機関が調査をすることを要しない対象に係るものである。
つまり、
請求項
は、有意義な国際調査をすることができる程度まで所定の要件を満
ない国際出願の部分に係るものである。つまり、
3 .
第
請求項
従って記載されていない。
は、従属請求の範囲であって P C T 規則 6. 4 (a) の第 2 文及び第 3文の規定に
欄 —発明の単一性が欠如しているときの意見（
第 1 ページの 3 の続き）
次に述べるようにこの国際出願に二以上の発明があるとこの国際調査機関は認めた。
請求項 1 に係る発明、請求項 9 に係る発明は、同一の又は対応する特別な技術的特徴を有しな
レ、
。そして、請求の範囲には以下に示す 2 の発明群が含まれる。
(発明 1 ) 請求項 1
8 に係る発明
「
被験物質をセレブロンもしくはその断片と接触させ、被験物質のセレブロンもしくはその
断片に対する結合性を評価する選択する」工程を有するスクリーニング方法。
(発明 2 ) 請求項 9
1 1 に係る発明
特定のアミノ酸置換を有する変異型セレブロン。
1.
出願人が必要な追加調査手数料をすベて期間内に納付したので、この国際調査報告は、すべての調査可能な請求
項について作成した。
2 .
追加調査手数料を要求するまでもなく、すべての調査可能な請求項について調査することができたので、追加調
查手数料の納付を求めなかった。
3 .
出願人が必要な追加調査手数料を一部のみしか期間内に納付しなかったので、この国際調査報告は、手数料の納
付のあった次の請求項のみについて作成した。
4 .
出願人が必要な追加調査手数料を期間内に納付しなかったので、この国際調査報告は、請求の範囲の最初に記載
されている発明に係る次の請求項について作成した。
追加調査手数料の異議の申立てに関する注意
□
追加調査手数料及び、該当する場合には、異議申立手数料の納付と共に、出願人から異議申立てがあった。
追加調査手数料の納付と共に出願人から異議申立てがあつたが、異議申立手数料が納付命令書に示した期間
内に支払われなかった。
お
様式 P C T
追加調査手数料の納付はあったが、異議申立てはなかった。
I SA
2 1 0
(第 1 ページの続葉（2 ) )
( 2 0 0 9 年 7 月）

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