FLAG®テクニカルマニュアル　1. FLAG概要 3XFLAG発現システムの特徴 3xFLAGシステムは3つのタンデムFLAGエピトープ、22個のアミノ酸を融合したオリジナルシステムです（図３）。 3xFLAGを含む融合タンパク質の検出は他のシステムに比べ約10～ 200倍にまで増幅されます。オリジナルFLAG タグ同様、 3xFLAGは親水性でエントロキナーゼ切断サイトを有し、比較的小さいタグです。そのため、タンパク質の機能を変化させてしまったり、他のエピトープを阻害してしまったり、可溶性を減少させるような危険性を最小限にします。低レベル発現のような場合、 3xFLAGは理想的です。CMVベクターで、一過性発現、安定発現のどちらにも3xFLAG 融合タンパク質が用いられます。図1. FLAGタグ（マーカーペプチド）と3xFLAGタグのアミノ酸配列 N末端FLAGタグ（アミノ酸8個）と3xFLAGタグ（アミノ酸22個）は、タグのC末端にあるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys配列の下流でエンテロキナーゼにより切断されます。高感度検出 ■ 超高感度：他のどんなタグシステムに比べ20-200倍の感度 ■ 検出感度：≦10 fmol (≦100 fmol, FLAG) ■ 哺乳動物細胞の低発現レベル遺伝子に最適 ■ FLAGの配列を3 回タンデムリピート ■ 免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫細胞化学での検出を増強図2. FLAGと3xFLAGのウェスタンブロットニトロセルロースメンブレンに転写した3xFLAG-BAP* およびFLAG-BAP*のウェスタンブロット。1 次抗体にAnti-FLAG M2モノクローナル抗体、2次抗体にHRP標識Anti-Mouse IgGを使用。ECL™化学発光基質で検出した。 *BAP:Bacterial Alkaline Phosphatase 図3. 3ｘFLAG の感度比較各タグをGST のC末端にクローニング。精製した融合タンパク質を1µg から0.01ng まで希釈して分析。ウェスタンブロットでの各タグの検出限界を、それぞれの1 次抗体（推奨濃度に希釈）、2 次抗体としてHRP 標識Anti-Mouse IgG 、ECL 化学発光基質を用いて検出。特異性の高い抗体 ■ FLAG タグと3xFLAG タグの配列には、認識性と結合性がそれぞれに異なる高特異性のANTI-FLAG モノクローナル抗体（M1、M2、M5）、ポリクローナル抗体、複合体の結合部位が含まれています ■ ANTI-FLAG 抗体は、ほとんどの哺乳動物細胞および細菌細胞のライセートで交差反応をほとんど、またはまったく示しません図4. FLAG 融合タンパク質のAnti-FLAG M2 抗体による検出 Lane1: FLAG-BAP* コントロールタンパク質 Lane2: COS-7 細胞抽出液（ネガティブコントロール） Lane3: pFLAG-CMV-2-BAP* をトランスフェクションしたCOS-7細胞抽出液ワンステップ精製 ■ ワンステップのクロマトグラフィーでシングルバンドまで精製 ■ 非変性条件下での精製 ■ FLAG、3ｘFLAG 合成ペプチドによる単純で拮抗的な溶出 ■ アフィニティゲルと96 ウェルプレートでの精製が可能図5. Anti-FLAG M2アフィニティゲル精製による SDS-PAGEの結果 Anti-FLAG M2 アフィニティゲルで精製しpFLAGATS™ -BAPをトランスフェクトした大腸菌ライセートの SDS-PAGE。（クマシーブリリアントブルーで染色した） Lane1: 大腸菌ライセート（精製前） Lane2: 大腸菌ライセート（精製後）