氏名(本学位 ,学の種位記ぬまざわみつてる沼沢光輝類薬学博士号薬籍, 番博第40号学位授与年月日昭和47年3月24日学位授与の要件学位規則第5条研究科専門課程東北大学大学院薬学研究科 (博学位論文題目士課程)薬第1項該当学専攻 3-Deoxyestroneの体内代謝に関する研究 (主論文審査委員教授査) 南原一41一利夫教授内山教授竹本充常松旨論内因性estrogenが acti。内文容要顕著な低コレステロール作用を示すことからnOn-en 、docrine 且のみを期待して種々化学修飾を施した変形ステロイドが数多く工夫されるにいたつている。 3-deoxyes霊rone(DOE)はこのような目的に沿つて開発された代表的な脱コ1/ステロール剤の一つであり現在臨床に広く便用されている。内因性メテロイドの体内代謝は今日その様相がほぼ明らかにされているが変形ステロイドのそれはかならずしも充分とはいい難い。ステロイド剤の生体内挙勲牲の評価にきわめて:重要であり,著運命の観察は薬物の有効性と安全者はこのような観点からDOEの体内代謝に関する研究に着手した。 L3・一Deoxyes重rOne代 estro鐸enの謝産物標品の合成体内変換に論いて16位酸素化はその重要性がすでに指摘されて訟り,6位 ,化雪よくみられる代謝様式である。また,家つこと炉知られている。そこでDOE代兎尿中の主たるestrogenは17α 酸素水酸基構造をも謝産物を同定するための標品としてそれら化合物ならびに誘導体の合成を試みた。まず。GaUagherらにょり開発された方法に準じ16,17℃xygenatedestraoす tol転なわちg△ 16 -e恥lacetate(1)を移を利用して16α,1718-dihydroxy体(5),1 (g).,・16β は △16体 .6沈一hydroxy-17-oxo体(19)をぐ・6)の基幹物質としke-tfienesの合成を行なつだ工7β 一dihydroxy体製しだ。cis-16(∼17α 四酸化オスミウム酸イヒにより,・7α 一g監yco童(17) 一hyd,。xy体(22,26)は・7β 一 tosylate、(21,25)をWaideロ反転さぜて得た。また6-hydrσxy体(34,43)はれぞれ6-Oxo体(29)の}拍BH4還元ならびにPtO2をそ用いる接触還元にょり合成した (Chart1,2)0 2.3-DeoxyesuOneの家兎尿中代謝産物家兎に澄けるestrogenのがなされている。最近,抱代謝とりわけ抱合についてはすでにLay匝e一派により広範な研究合体は必らずしも最:終産物ではなく薬理作用発現上重要な役割を演ずる場合のあることが見出され注目をあびている。また,芳 shiftぞ・香環の酵素的水酸化に誇いて"NIH と呼ばれる現象が見出され水酸化機構に関して重要な示唆が与えられるにいたつた。著者はこれらの事実に注目しDOEの家兎尿中代謝物とそれらの抱合様式の検討ならびに芳香環水酸化機構の解明を試みた。一42一 0 OAc Otlc 、.、・0'ξ 1 一ノ一、メ. 1 DOE ム L fi'Cs 2 i O O OR llOAc oa C H A ニ＼ OR 0 ㎝脇﹁﹁ . し R R o ;0 ∼赴 ! O 19 , r 20:R=H 21:R=Ts 3 ., 4 ﹂覗 15 、 ""OR 儀卍 27=R=C(i,C6H5,R'=Ac 28:R=CH￡崎1{5,R'=H Chart1 一43一 C HA 0⊥ 26:R」H,R'まAc ,R'一H キ。 25:R=CH二C6H⊃,R'=Ts ac=CHaCO一 X正 RO RoX. 2朝R=C}1、C,1{, Ts=p-CHaCaHcSOr 11 = 一 ● . ORσ ● 9:R嵩H lO:R二Ac = = ・ ● C EA = ● φ RR . ・3 ・4 α 17:R=H 18=R=Ac O ︿一 22:R=H 23:R=Ae RR OR 亀覧一 )6 ゆ OR l"OR 鑑課匙㎝人ロ i ーー 1 OR 、 78 z6 ユ2 OB 0 9疎 i o凶＼く DO居 0 37:R=H 38:R嵩Ac ox OR 明 s 測甲 = ぞ二 = H 飴轟 co 冠﹂㏄鴇 5 ニ R R R R H = = ぶ曙 = O123 3333 ニ H 廊轟 co 、ヒ㏄巳 RRC R R R R C R- 0 弩㎝壌駅歌歌融 9 01 2 冒 . 3 44 4 7 0員畠 0 強VIIg ox ox 34:R=H 35:R=Ac 36;R=COC6R5 43:R二H 44:R=COC6H5 Ac=CH3CO一 Char七'2 1)3-Deoxyestrone代 DO露謝産物の単離と構造を成熟雄性家兎に経口投与後摘集した尿を常法通り,8-glUCUronidase水 solvolysisに付しアルミナクロマトグラフイー翁よびTLCを代謝産物の構造はKMR,mas馬IR,スに呈色反応,誘併用して主代謝産物を分離した。ペクトルならびに ⑦LC,GLGな導体生成などの化学的手法により確認した。その結果Chart3に産物の構造を明らかにすることができた。一44一解, どの物理的手法さら示す8種め代謝 OH ococxe OH OH HO HO HO 皿 I a/ O u 一一 HO VI 一一 0 HO V rv 。＼ OH OH oK VII VIII II Chart3 2)3-Deoxyestrone代 1)と謝産物の抱合形式同様にDOEを揖一与後捕集した尿をn一 SephadexLH-20をりacetate一用いて分離,精膿ethylest町プタノールで抽出し抱合体画分を得た。まず, 製を行ないKを結晶状に単離した。他の抱合体は常法通に誘導してアルミナクロマトグラフィーならびにTLCに分離した。NMR,mass,IRスベクトルさらに酵素水解,呈より色反応などの結果からChart4 に示す抱合体4種の構造を明らかにすることができた。 3)3-Deoxyestrone芳香環:水酸化に誇ける標識重水素の転移重水素を標識した2-deuterio一ならびに3-deuterio-DOEを家兎に経[]投.与した。主代謝産物,2-hydroxy-DOE細重水素の保持率とその標識位置をmass,NMRス 2位水酸化では3位に,一方3位合成し1)とよび17α 一estradiolを同様に単離しペクトルより精査した。その結果標識重水素は水酸化では2,4位確認された(TableI)。一45一に約5:2の割合でそれぞれ転移ナることが O ーー1 ヨ R 恥R L馬 4融手 r 0 GOONa ・%深 0 。 oH .X 鴬恥 R10 α 蕊 X X 鰭 OR X工:R=G X工㍗R嵩G『 G 繊 α 了畷轟 C HA = = 2 2 R R G G R R と﹁F V診叢 ∬ Char七4 Tablei.Retcn`ion,,:i)euteriuminthePhenolicMeta- b・Hte・f・r… byぬ磁fr・mDeuteτated3つeoxyestr・ne 画・Hア登… γ1・ti・、・i・R・bbit Retentionof Sub$trateき ∫etabollte deuterium(%) 2-DeuYerio-DOE2-hydroxy-DOEC-3 _47 { 17a-estradiolC-281 3-Deuterio∼DOE2-hydroxy-DOEC-381 { 17a-estradiolC-2c｢.50 t C-40α.20 DOEは主としてまず3位に水酸化をうけたのち内因性をうけることなどが明らかとなつた。また,極 θstrOgenと性化を伴う6位同様の経路により変換水酸化は従来抱合の代償機構と推測されてきたが著者の結果からみてこの種の説明は普遍性にとぼしいことが判明した。酸化的薬物代謝酵素とステロイド水酸化酵素との間に多くの類似点のあることが指摘されているQ DOEの芳香環水酸化に翁いても"MHshi丘"がみられたことはこれを強く支持するもので一46一あり,また中間体として2,3-oxldeの 3.3-Deoxyestroneの・ estrogenはラット尿中代謝塵物ラツトに訟いて2位が報告されて澄り,e6trogenの DOEの関一与が示唆された。水酸化をうけた後ある条件下でグルタテオンと抱合すること新しい代謝型式として注目されている。著者はラツトに溢ける水酸化に着目し生体内運命とくにペプチド抱合体の生成について検討した。 DOE-6,7-3Hを腹腔内投一与後尿中の91ucuronide,sulfateをし,遊難ステロイドを抽出,分離した結果Chart5に示す代謝産物が同定された。非水解性画分 (ペプチド抱合体)はAmberliteXAD-2,SephadexG-25をィーに付し,さらにDNP誘る水解,RaneyNiに用いるクロマトグラフ導体に導き精製した。ここに得られたペブテド抱合体は6N塩よる脱硫反応などの結果からChart6にびにestradio1に前述の通 ρ水解酸によ示すごとくestroneならグルタテオンがイオウを介して結合した構造であることが確認された。 ox O HO ζ1 0 HO ζ1 HO X■ 工工 (! XIV ox XV OH 0 H H ζl ζ1 ζ1 OH XV工 XVI工 XVI工 Chart5 ｰ47一 ■ R すでに報告されているestroge'nのグルタテォン抱合にっいては2-hydroxyestrogenを中間体とする機構が考えられている。しかし,DOEの HO 場合XIX,XXの生成はこの機構では説明されずこれとは異な CO坦CH2S る新しい抱合機構の関与が推測される。認HCH幻H、CONHさH l CONHCH￡02H X工X:R冨 4,ラツト肝ミクロゾームによる3- Deoxyestroneのぐ"H ノOH 水酸化とそれに凄よぼす薬物前投与の影響 XX:R零O ある種の薬物,多核芳香族炭化水素あるい Char七6 は輩虫剤などを動物に投与するとその肝ミクロゾーム(M.s)に局在するNADPH依性酸化酵素の活性に変化を来すが,こ存の種ゐ乳' 誘導現象は薬物代謝酵素の研究上一つの:重要な命題となつている。そこで代表的な誘導剤フエノバルビタールぐPB),3一メテルコランスレン(Mc)の前投与がDOEのへを検討した。まず,雄性幼若ラツト肝より得られだMs画酸素の存在下DOE-6,7-3Hとられ2,3細'よついでMG澄び6β イシキユペートした。その結果5種よびPBをの代謝産物の生成が認め前投与した雄性幼若ラツト肝MsとDOE-S,7-3Hをらびに6位化はほとんど影響をうけないが6β 前述と同様水酸化活性を測定した。その結果PB投水酸化は対照群に比し200%上投与では芳香環水酸化は対照群に比して270砺与の場合芳香環水酸昇がみとめられた。他方MG 上昇し2位水酸化/3位水酸化は約2倍となつた水酸化に対する影響はほとんど観察されなかつた。 PBとMCによる誘導現象のこのような差異は異なる水酸化酵素系の存在を示唆し興味深いものがある。最近2種 P-450とP-448が 450が分を用いNADPH-ge肥ratingsystem, 位に水酸化の起ることが確認された。インキュベートし2,3なが6β 水酸化に澄よぼす影響他方MCにの肝ミクロゾームGO-bindiロgpigmentすなわちcytochrome 存在しこれらが相互に異攻る酵素活性を有すること,塵よりP-4ξ8がたPBによりP- 特異的に誘導されることが明らかにされている。著者の結果はこれらの事実を支持するものであり,ステロイド水酸化反応に異なる酵素系が関与していることが示唆された。一48一審査結果の本研究は脱コレステロール剤3-deoxyestrone(DOE)の咳の変換,新規抱合体の生成,芳要旨体内代謝を検討し.,ステロイド香核水酸化の機構ならびに他薬剤前投与の水酸化酵素活性におよぼす影響を明らかにしたものであるQ まず,代謝産物同定のための標品として16,17一 hydroxy誘導体の合成を行なつたoっの購造を物理的手法,微いでDOEを。xygenated,6-hydr・xyおよび17α 一家兎に経口投与後分離した尿中代謝産物8種量化学反応を駆使して推定し,合成標品との直接比較によつて確認した。一方これらの抱合形式を明らかにするためブタノール抽出物をゲル濾過に付し,aCetate-methyl esterに誘導して4種 glUCur・nldeとのglucur・nideを分離した。このときユ6,17-epiestri・正がdi- して捕捉されたことは注目に値する。さらにDOEの2,3位に芳香核水酸化がみられることからあらかじめこれらの位置を重水素標識した基質を含成し,家のmass,NMRス兎に投与後単離した尿中代謝産物2-hydr・xy-DOE,17α 一estradiol ペクトルを測定した。その結果水酸化に伴ない標識重水素が隣接炭素に転移するいわゆる'気NIH・bift"の生起することが証明された。この事実はステロイド水酸化酵素と薬物代謝酵素の類似性を支持するものであるc つぎにラツト尿中にみられるDOEの estr・ne,estradidのA環抱合型代謝産物を精査し,グルタチオソがイオウ原子を介し・に結合した新規抱合体を証明した。カテコール型でないグルタチオン抱合体はこれが初めてであり,・最後にラットにおける2,3,6β 一キノンを経由しない生成機構の関与が示唆される。位水酸化におよぼすフエノバルビタール,3一メチルコランスレンの影響を検討した。すなわちこれら誘導剤を前投与したラツトの肝ミクロゾームとDOEをインキユベートし,前記水酸化物の生成量を対照群と比較した。その結果フエノ・ミルビタールでは6β 化のみが上昇する一方,3一水酸メチルコランスレン投与では芳香核水酸化酵素が特異的に誘導されるこ・とが判明した。以上本論文は薬物の有効性,安全性の評価にきわめて璽要な生体内連命を明らかにしたばかりでなく変形ステロイドの代謝形式に関し数々の新知見を加えたものであり,掌位を授与する.に値するものと認める。一49一