Lact。baciーーus bifidus に関する研究

328
金沢大学十全医学会雑誌第77巻第2号 328−334 （1968）
Lactobacillus bifidusレて関する研究
〔1〕各種環境下における穎粒体存続と菌生存能との関係
金沢大学医学部微生物学講座（主任西田尚紀教授）
高村保徳
（昭和43年8月22日受付）
Lactobacillus bifidusは乳幼児のnormal flora
た．分離培地に発育した集落の内，その性状及びグラ
の主たる成分を構成するものであることはひろく知ら
ム染色並びにNeisser染色の所見より本四集落と思
拠ているが最近Haenelら1）は成人のnormal flora
われるものを選び，1．0％ブドウ糖・0．3％粉末酵母
としてもE．coliに匹適するか或はそれ以上に存在す
エキス・0．1％寒天加brain heart iufusion培地
ることを示している．L． bifidusは腸管に共存する
（pH＝6．8）（以下B培地と省略）に穿刺培養した．以
他のLactobaciUusと形態的生物性状の上で大きく
後この培地にうえ継ぎ菌株を確保した．
異るので最近の分類ではActinomycesに入れるか2）
II．同定法：本菌を同定する上に必要な生物学的性
或はBifidobacteriumとして3）1つのnew genus
状は未だ一定していないが，諸家の成績を要約した次
を作りここに入れる傾向がつよい．この菌群の形態的
の如き基準に従った．1．偏性嫌気性である事，2．
特徴としてその名前の示す如き尾部が2つに分岐する
多形性でL．bifidusの名にふさわしく尾部の分岐し
性質の他にその作るclub shapeはMycobacterium
た独特の菌形態を有し通常グラム染色陽性であるか，
Corynebacterium，或は Actinomycesのclub
時に顯学部を除く菌体蔀分が陰性に染ることがあり，
shape と著しく似ている． Corynebacterium や
また菌体内に1ないし数ケのグラム強陽性の畑町を有
Mycobacteriumのclub shape或はその先端の大
する事，3．胞子を作らず運動性のない事，4．カタ
ぎな下下に関しての研究は数多く行われMudd 4）に
ラーゼ反応陰性で硝酸塩を還元しない事，4．につい
よってひろく綜説されているがし，bifid飴のそれに
ては成績記載10）の如く行った．糖分解用培地として
関しての報告は全くないといって良い．著者の同僚の
次の如き組成11）のものを使用した．
石田ら5）寺本6）は Cbrynebacterium の club
Proteose peptone（Difco）
2．09
shape或は所謂oval granuleについて検討しこれ
NaCl
0．59
がこの菌の生存にあっかる耐久形であることを主張し
Sodium thio91ycollate
0。19
か．著者らはし．bifidusが保存しにくい菌である
粉末寒天
0．19
ことを考え，この菌の穎粒と生存力との問題について
各種糖液
1．09
検討したいと考え本実験を行った．
0．2％B．T， B．
1．2m1
蒸溜水
100m1
実験方法
pH＝6．8 115。C
15分丁子
1．分離培養法：本菌の分離培地としてPetuely
糖分解を行う場合，
予め菌を0．1％寒天加brain
培地7）及び20％母乳寒天培地8）を使用した．生後
heart infusion培地に37。C 48時間穿刺培養してお
7日ないし5カ月の天然栄養児9例，混合栄養児3
例，入工栄養児2例，1年ないし3年の幼児3例の合
で採り，糖分解用培地の中に穿刺した．37。Cの艀卵
計17例より，なるべく新鮮な糞便を採取しプこれを適
器に入れ10日間連日菌の発育状態と培地の色の変化を
当に稀釈して分離培地に塗布し，ピロガロール・炭酸
観察した．
ソーダ法9）により嫌気性とし，370Cで48時間培養し
皿．菌の生存試験法：本実験に使用した菌株は
き，発育の盛んな菌を直径約8mmの渦巻型自金耳
Studies on Lσo’o∂oo〃1％εβヴゴ4〃ε〔1〕Some Correla士ions betweell the Granule
Formation in Different Environments and the Survival of this Species． Yasunori
Takamura， Department of Bacteriology （Director；Prof． S． Nishida）， School of
Medici且e， Kanazawa University．
329
Lactobacillus bifidusに関する研究〔1〕
表1 分離菌株の糖分解能成績
0．5％寒天加brain heart infusion培地（pH＝6．8）
ぎ巳凶
十十十十十十十十十十十十十十十十
十
一U
№nけOωΦ・
れに対してなした定義に従った．グラム強陽性に染ま
十
Oεooooo十十十十十十十十十十十十十十十十
は，寺本2）がCorynebacterium diphtheriaeのそ
十十十十十十十十十十十十十十・十十十
V．・穎粒体存続の判定法：まず顯粒体の定義として
十±
使用に供しなかった．
1
1⊥ーユー
た．尚一話語話した保存培地はそのまま放棄し次回の
十十十
面に菌の発育の認められるものを菌生存陽性と判定し
十±十
発育の有無を観察した．その結果・穿刺線に沿って一
十
閑鋤hh一昌OωO
をすくい上げ，直ちにB培地に穿刺し37。C 48時間
培養した．菌の生えの悪い場合は72時聞迄培養し菌の
十十十一十十、十十十十±十
IV．菌の生死の判定法：各保存培地より毎月1回前
記白金耳で，なるべく培地底部より穿刺線に沿って菌
国下口Oω①
び37。Cに保存した．
十十十十十十十十十
37。C 36時間培養後ゴムキャップで密栓し0∼4。C及
十一
E十±十±十±十
に穿刺培養した．
一一一［一一︻一一一一一一一一一一
天高層培地の各々につき10本ずつそのなるべく中心部
‘■一−⊥−ニーユー
養した菌を上記白金耳ですくい上げ，直ちに各種軟寒
12345678123456789
LLLLLLLLLLLLLLLLL
した．これらの培地は中試験管に・約10m1つつ注入
し高層培地として用いた．B培地に37。C 48時間培
×覧。ωΦ
ヘモグロビン0．5％，血球10％に加えたものを使用
菌株名
更にBHI軟寒天培地に，それぞれ血液10％，乾燥
糖
︾同①げ一昌OωO
（以下BHI軟寒天培地と省略）に良く慣れ，良好な
発育を示したので，保存培地としてこれを使用した．
±
＋1＋
るclub−shape或は「oval granule」で， vegetative
を示した．即ち37。C 48時間嫌気性培養後の集落は直
phaseの菌体に見られる「顯粒部が上体を膨隆させ
ていないもの」と区別した．一方また，穎粒体でもグ
径約0．5∼2．Ommの種々の大きさのものが見られた
が，乳白色を呈し半球状で軟かく不透明で特に著しい
ラム染色性がvegetative cellより橿化したものは
光沢はなかった．集落が小さい時はやや扁平で灰白色
除外した．このような際には穎粒は大きく膨化し，そ
であったが，集落が大きくなるに従い白磁色となり半
の限界が不鮮明となる傾向を示した．（図1，及び図
球状に盛上るのが認められた．それらの集落をグラム
3参照．即ち，図3の（a）並びに図1の（b）はそれ
染色し鏡検すると，通常グラム陽性の桿状ないしは菌
ぞれグラム強陽性に染まる典型的なclub−shape並
一三は菌側よりY字状に分岐した形態が認められ『た
びに「oval granule」を示し，図1の（c）はグラ
（図2）．また常にNeisser染色により所謂異染小体
ム染色性のすでに感化し膨化したものを示す。）
染色標本を鏡検し数＝視野の菌合計約1000ケ中の訓諭
を菌体内に1∼3ケ認めた．時にグラム陽性のclub−
shape或は「ovale granule」を示すものも認められた
点数を計算した．尚同様な実験を2旧くりかえして計
（図3）．また，天然栄養児由来のものにグラム染色で
3回の平均値即ち約1000ケの菌体中の穎粒体の数を求
一体は淡赤色で核様体だけが黒紫色に染まり菌端が細
めた，乱心体を全く認めないものを一，1∼9ケのも
くなった桿菌状の形態を示すものをしばしば認めた
のを±，10∼99ケのものを＋，100ケ以上のものを十
（図4）．
と定め，そのうち＋以上のものを穎粒体存続陽性と判
分離し得た菌株17株を選び生物学的検査を行った．
定した．
全株共胞子を作らず運動性は認められなかった．また
W．写真：Nikon F型カメラ並びに同写真装置
カタラーゼ反応陰性で，硝酸塩を還元しなかった．B
（拡大力率1：2）を使用した．
培地培養4日目の培地のpHは，いつれも3．4∼3．8
であった．6∼7種の糖について行ったが糖分解の結
実験成績
1．分離所見
Petuely培地でも母乳寒天培地でも大体同様の所見
果は表1の如くであった．
以上の生物学的性状の結果並びに偏性嫌気性である
こと，集落の性状及びグラム染色により独特の菌形態
330
村
高
を有する事より，全株共L．bifidusと同定した．こ
に保存したものは平均2．4、カ月生存し，頬粒体の存続
の17株の菌を使用し以下の実験を行った．
は平均1．3カ月であった．
皿．BHI軟寒天培地及び10％血液加BHI軟寒天
従って0∼4。Cに保存した場合，培地の血液の有無
培地における保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間
にかかわらず穎粒体の存続と菌の生存期間との間に何
に及ぼす影響
本実験に入る前に予備試験として，寒天濃度0％，
に保存したものが，その他の条件のものに比較して一
0．1％，0．5％，1．0％とした各BHI培地を作り，そ
番生存力が強く，また穎粒体の存続と菌の生存期間と
れぞれに菌を培養し25。Cに保存した．そして1カ
の関係も著しく密接である事が判明した．
月後に穎粒体形成度並びに菌生存度を検討した結果，
皿．0．5％乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地にお
らの関係も見出されなかったが，血液加培地で37。C
0．5％にしたものが最も条件が良いように思われたの
ける保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす
で，以下の実験には寒天濃度0．5％の培地を主とし
影響
て使用した．
乾燥ヘモグロビンは容易に手に入るので，血液の代
経験上血液を加えた培地の中では亭亭体の形成が良
りにこれを加えた培地で同様の実験を行った．結果は
い事が判っていたので，BHI軟寒天培地と共に10％
表3の如くであった．
血液加BHI軟寒天培地を使用し両者を比較対照し
37。Cに保存したものは平均3．5カ月生存し，0∼
た．
4。Cに保存したものは平均2．8カ月生存した．明ら
さて各保存培地に発育盛んな種々の菌を37。C 36時
かに37。Cでは0∼4。Cに比較して長く生存した．
間培養後，37。C及び0∼4。Cに保存したが，菌株に
また二丁体は37。Cに保存したものは平均3．7カ月
よりその時すでにclub−shape或はoval granule
存続し，0∼4。Cに保存したものは平均1．5カ月存続
をとるものが見られた．
した．従ってここでも0∼4。Cでは穎粒体の存続と
結果は表2の如くであった．BHI軟寒天培地で
菌の生存期間との間に何らの関係も見出されなかった
37。Cに保存したものは，1カ月以内に死滅しまた願
が，37。Cの場合両者の関係は著しく密接である事が
粒体の存続も平均0．4カ月と極めて悪かった．一方，
判明した．
0∼4。Cに保存したものは平均2カ月生存し，二二体
また，本実験と皿の実験との成績は，大体同様の
の存続は平均0．6カ月であった．
結果を得たので，血液の代りに乾燥ヘモグロビンでも
これに比浸，10％血液加BHI軟寒天培地で37。C
充分代用し得ると考えられた，
に保存したものは平均3，1カ月生存し，穎粒体の存続
］V．種4の糖分解能を示す菌株を用いての0．5％乾
は平均3．6カ月と比較的良好であった．また0∼4。C
燥ヘモグロビン加BH：1軟寒天培地における雲粒体存
表2 BHI軟寒天培地（1）及び10％血液加BHI軟寒天培地（皿）における
保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす影響
0∼4。C
37。C
2．0
山粒体
002229］−
＊越中数字は雨粒体の存続並びに菌生存月数を示す．
0．6
生存
QUOJ9臼0δ−漏噌■喧■
3．1
霊山体
0001占ームー占−
3．6
生存
621460∩δ
0
顯粒体
ρ02噌⊥47・200
0．4
00000︵UO
均
000ーム■11←0
一一一一一一一
噌⊥24FOρ07‘8
LエエLLLL
平
生存
1
1．3
生存
4333212
穎粒体
：皿
］1
1
2．4
331
Lactobacillus bifidus lこ関する研究（1〕
続と菌生存期間との関係，
月生存した．また，穎粒体形成も良好で平均4カ月存
実験 2）3）に使用した菌株はすべてDhenert
続した，従って本実験でも忌地体の存続と菌の生存期
分類12）のV群に属すると思われるものであった．そ
間との関係は著しく密接である事が判明した．尚，本
こで更に種4の糖分解能を示す菌株（皿群，IV群と思
実験では各菌株の群の種類と生存力との間に特別の関
われるものを含む）を使用して，保存温度37。Cで
係を認める事ができなかった．
同様の実験を行った．培地は0．5％乾燥ヘモグロビ
V．10％血球加BHI軟寒天培地における保存温度の
ン加BHI軟寒天培地を使用し，対照としてBHI軟
顧粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす影響．
寒天培地を併用した．
結果は表5の如くであった．0∼4。Cに保存したも
結果は表4の如くであった．乾燥ヘモグロビン加培
のは平均2．5カ月生存し，穎粒体は平均0．8カ月存
地では対照と比較し，生存力は極めて強く平均3、8カ
続した．また37。Cに保存したものは平均3．3カ月
生存し，穎粒体は平均3．3ヵ月存続した。本実験では
表3 0．5％乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒
天培地における保存温度の二二体存続
並びに菌生存期間に及ぼす影響
37。C
37。Cに保存の場合，穎粒体の存続と菌の生存期間と
は全く一致した．
VI，血液ブイヨン培地における穎粒体存続と菌生存期
間との関係
0∼4。C
本菌はある菌株を除き血液ブイヨン培地には極めて
穎粒体
422423
1．5
3．5
米表中数字は表2参照．
生存
0034凸20
3．7
穎粒体
2342ハ04
＊
234274
一一一一一一
ーム9臼nδ∠て︻08
LLLLLL
平均
生存
2．8
発育が悪く，直接培養する事は困難だったので，予め
0。1％寒天加brain heart infusion培地に37。C 48
時間培養した菌を用意しておき，駒込ピペットで約
0．2mrづう血液ブイヨン中に注入し，ゴムキャップ
で密接後直ちに25。Cに保存した．尚，本実験には
5株を使用し同様の実験を4回行った．
結果は表：6の如くであった．各回の穎粒体存続と菌
生存期間との一致率を見るに，それぞれ88％，91％，
89％，94％であり，ここでも両者の関係は著しく密
接である事が判明した．
察
考
表4 BHI軟寒天培地（1）及び0．5％
乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地
（皿）における頼粒体存続と菌生存
期間との関係（保存温度37。C）
1
L−16
L−17
L−18
L−19
平均
0，4
亡霊体
0
＊表中数字は表2参照．
4．0
∼16）がある．例えば石原17）はwarm stage obser・
表5 10％血球加BHI軟寒天培地に
生存
354472234
365463234
L−15
生存
000000000
L−13
L−14
＊
し−11
L−12
010100011
穎粒体
皿
L．bifidusの発育形式に関しては従来多くの報告13）
3．8
おける保存温度の穎粒体存続並びに
菌生存期間に及ぼす影響
菌株名
0∼40C
37。C
保存
温度
粗粒体
生存
顎口体
生存
L−1
3＊
3
0
3
L−2
3
3
0
2
L−5
4
4
3
3
L−8
3
3
0
2
平均
3．3
3，3
＊表中数字は表2参照．
0．8
2．5
332
高
村
vationにより，初期の分岐糸状発育；期とこれに続く
たので，菌の生存にあっかるのはグラム強陽性の比較
桿状細菌発育期の極めて特異な二相生の発育形式を確
時小さなものでないかと推察された．しかしながら，
認した．このような発育過程における種々の形態は，
更に恥しい細胞化学的検索が必要と思われた．これは
著者の実験の途中においてもしばしば観察されたが，
後報で更に述べたい．
この事は本菌の発育形式はActinomycesのそれに非
論
結
常に類似しており，真性細菌とは異なるものを持って
いるように思われた．
1．L． bifidusは10％血液加BHI軟寒天培地
さて，L． bifidusの定型的な形態としてY字状に
において，370Cに保存のものは0∼4。Cに保存のも
分岐した桿菌様形態があげられるが，同一菌株でも上
のよりも明らかに生存期間が長かった．またタ0．5％
述した如く発育の時期の相違や四境条件により，しば
乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地でも同様の結果
しば棍棒状や球形等の多彩な形態を示す．これらの形
を示した．
態変化を起す原因として，培地の種類，pH，塩類の
2．各種培地において且つ頼粒体形成能力の異なる
影響，酸素分圧の差異，或はdegeneration等あげら
菌株を用いての実験の結果，L． bifidusの糸粒体存
れる3）18）19）が，未だ明らかでない．
続は菌の生存期間と極めて密接な関係がある事が判明
所で，著者が本研究でなした如く，L． bifidusの
した．
陳旧化した培地でしばしば認められる顯粒状構造と菌
稿を終るにあたり，御指導と御校閲下さいました西田尚紀教授
の生存能との関係について追求した報告は他に接して
に衷心より感謝申し上げます．
いない．これは本四が，栄養要求の極めて厳しい菌で
あり，また偏性嫌気性である為，培地条件や酸素の浸
献
文
入等によりすみやかに死滅するので，一定の二二下に
中期月も保存し，逐次形態的な変化を観察するのが困
1）Haene1， H．， K：6hler， F．，：Mertsc11ヅH，＆
i平な事も一因と思われた．ともあれ著者の研究は，前
Pardeman皿， Ch．：Zb1． Bkt．， Abt．1，つrig．，
に寺本がC．diphtheriaeで証明した如く，本丁の
177，41 （1940）． 2） Rosebury， T．＝ Biacteria
丁丁培地で最：も現われ易い「oval granule」（club−
indigenous to man， in R， Dubos ed． Bacteria
s坤peの尾部はグラム陰性化して先端膨隆部のみ残
＆mycotic infections of man 4 th ed． p．326
る）即ち一粒体が，この菌の生存にあずかる代謝冬眠
J．B． Lippincott Co．， Philadelphia．（1965）．
ともいうべき状態の一種のrest formである事を暗
示した．尚，著者ぶ使用した培地で本丁を長く保存し
3）Pr6vot A．＆Fredette． V．3Manual for
the classification and determination of the
た場合，種々の大きさの穎粒体が認められたが，大き
anaerobic Bacteria l st ed． p．361 Lea＆Febi。
く膨隆したも．のは大きさを増すにつれグラム染色性が
ger Co．， Philadelphia．（1965）． 4）
悪くなり，ついに陰性化し崩壊していくのが認められ
Mudd， S．：Annual Rev．．Microbiol．8，1
表6 血液ブイヨン培地における穎粒体存続と菌生存期間との関係（保存温度25。C）
実験回数
菌株名
第1回
越智体
第2回
第3回
第4回
生存
穎粒体
生存
穎粒体
生存
穎粒体
生存
L−1
6＊
5
6
6
5
5
5
4
L−2
3
3
6
6
4
3
4
4
L−3
5
4
3
2
3
2
2
2
L−4
4
3
3
3
4
4
4
4
L−8
6
6
4
3
2
2
2
2
3．6
3．2
平均
4．8
＊表中数字は表2参照．←
4．2
4．4
4．0
3，4
3．2
Lactobacillus bifidusに関する研究〔1〕
333
（1954）． 5）石田宗治・寺本友一・西田尚紀3
13）Weiss，」』．＆RettgerジL．F．：J． Bact．，
医学と生物学，63，146（1962）． 6）
28，501（1934）． 14）Hayward， A． C．，
寺本友一3十全医会誌，69，55（1963）．
Hale， C． M． F．、＆BissetジK：． A．： J． gen．
7）Petuely， F．＝ Zb1． Bkt， Abt．，雪1，0rig．，
microbio1．，13，292（1955）． 15）
166，95（1956）． 8）門平浩3日小会誌，
Gyllenberg， H． G．： J． gen． microbiol．，13，
66，284（1963）． 9）中川正明・山岸高由・
394（1955）．‘ 16）根岸章：日小会誌，
63，187（1959）． 17）石原裕＝日小会誌，
西田尚紀＝メディヤサークル，No，53，17（19
64）． 10）谷友次：医学微生物学，第4
63，1007（1959）． 18）Norris， R． F．，
版，288頁，南山堂，東京（1957）． 11）
Flanders， Tl．， Tomare11i， R． M．＆Gy6rgy，
Willis， A，． T．：Anaerobic Bacteriology in
P．： J．Bact．，60，681（1950）． 19）
Clinical Medicine，2nd ed． Butterworth， Lo・
本間道・太田淳・新井四郎＝小児科臨床，
ndon （1963）． 12） IDehnert，」．：
13， 1274 （1960）．
Zbl． Bkt．， Abt．1，0rig．，169，66（1957）．
Abstract
Lαo’o∂σ6〃1πs∂ヴゴ4％scultured in braill heart ir面sioll half fhlid medium colltai・
ning 10％blood survived definitely longer lat 37。C than at O to 4。C． The same
result was obtained also when the blood was replaced by O．5％霞haemoglobin．一
Furthermore，．L．ゐヴ∫4％3 strains differing ill the ability to form granules we■e
examined as for surval and it was demonstrated that the granule formation was
closely ass‘⊃ciated with the ability to survive．
高
謝
村
図1 Lbifidus， L−6株，×2500，
10％血液加工BHI軟寒天培地，37。 C 5カ月培
図2 Lbifidus， L−13株，×2500，
養，グラム染色．
色．
20％母乳寒天培地，37。C48時間培養，グラム染
b＝oval granule
c．グラム陽性のうすれた膨隆した穎粒
顯、
図3 L．bifidus， L−6株，×2500，
図4 Lbifidus， L−12株， x2500，
20％母乳寒天培地，37。C48時問培養，グラム染
20％母乳寒天培地，370C48時間培養，グラム染
色．
色．
a＝oval granule
鵜
1臨
．義義螺
轟嘩縫翻
撫論
難
彊㍉声

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