ver.201312版 研究用 KAPA3G Plant PCR Kit クイックガイド Cat.No KK7251 KK7252 Kit Size ● 内容 250×50μl反応 KK7251 500×50μl反応 ・1×250 U KAPA3G Plant DNAポリメラーゼ（2.5 U/μl） ・1×6.25ml KAPA Plant PCRバッファー（2X） ・1×125μl KAPA Plant PCRエンハンサー（100X） ・1×1.6ml MgCl2溶液（25 mM） 製品概要 KAPA3G Plant PCRキットは、植物由来の精製したDNAあるいはク ルード抽出法で調製したDNA（クルードサンプルPCR）のいずれでも PCRが可能となるようデザインされています。また、KAPA3G Plant PCRキットは、直接PCR反応液中に加えた植物組織からのDNAの増 幅（ダイレクトPCR）にも使用できます。 KK7252 ・2×250 U KAPA3G Plant DNAポリメラーゼ（2.5 U/μl） ・2×6.25 ml KAPA Plant PCRバッファー（2X） ・2×125μl KAPA Plant PCRエンハンサー（100X） ・1×1.6ml MgCl2溶液（25mM） KAPA3G Plant PCRキットには、一般的な植物由来のPCR阻害物質 （ポリフェノール 類 や 多 糖 類 な ど）に 対 する耐 性 向 上を目的として、 directed evolution（KAPA社 独自のスクリーニング 法）を 通じて開 発 さ れ た 新 規KAPA3G DNAポ リ メ ラ ー ゼ が 含 ま れ て い ま す。 KAPA3G Plant DNAポ リ メ ラ ー ゼ は、エ ン ジ ニ ア 加 工 さ れ た KAPA3G DNAポリメラーゼ（A-family）と改良を加えたDNAポリメ ラーゼ（B-family）をブレンドしたもので、この酵素ブレンドは、最初の 変性ステップまでの間、その酵素を不活性化にする独自の抗体と結合 しています。KAPA3G Plant DNA ポリメラーゼの正 確 性 は 野 生 型 Taqの4 ∼ 10倍 です。KAPA3G Plant PCRキットで得られ たDNA フラグメントの多くは3’dA突出末端であり、制限酵素消化、TAクロー ニングやシークエンスなどのダウンストリームアプリケーションに使用 することも可能です。 クイックノート KAPA3G Plant DNAポリメラーゼは、植物由来のPCR阻害物 質に耐性があり、精製したDNA、クルード抽出物、植物組織から 増幅することができます。 ダイレクトPCRあるいはクルードサンプルPCRを行う前に精製 したDNAを用いて反応条件の最適化を行ってください。 ダイレクトPCRでは、反応に加える植物組織の量を、サンプリン グツールを使ってコントロールしてください。PCRに過剰量の植 物のクルードサンプルを添加してしまうことが、ダイレクトPCR 反応がうまくいかないことの主な原因です。 KAPA Plant PCRバッファー（2X）は、すぐに使用できるミックスで、 DNAポリメラーゼ､プライマー、テンプレートを除く全てのコンポーネ ントが含まれています。このバッファー（2X）には、各0.2 mM（1X） のdNTP、および1.5 mM（1X）のMgCl2 が含まれています。このバッ ファーシステムによって、広範囲のアニーリング温度で、特異性が高い 増幅が可能となり、アニーリング温度の最適化の必要性が軽減されま す。 クルードサンプルPCRでは、Extraction Buffer（抽出バッファ ー。セクション3：クルードサンプルPCR参照）内に少量の植物 組 織を加えたものを使 用してクルードDNAサンプルを調製し、 50 μlの反応あたり1 μlを使用してください。 KAPA Plant PCRバッファーには1.5 mM（1X）のMgCl2と各 0.2 mM（1X）のdNTPが含まれています。また、最適化のため のMgCl2（25 mM）も提供されています。 KAPA Plant PCRエンハンサーは、特定のサンプルやアッセイでPCR のパフォーマンスを高めるためのオプションの添加剤です。通常の反応 条件で求める結果が得られない場合に使用します。 KAPA Plant PCRエンハンサーは、他の最適化の方法が全てう このプ ロトコ ールで は、KAPA3G Plant PCRキットを 用 い たPlant PCRの方法を3つ示します。精製したDNAからのPCR（セクション1）、 ダイレクトPCR（セクション2）、クルードサンプルPCR（セクション3） です。反 応条 件は、ダイレクトPCRあるいはクルードサンプルPCRを 行う前に精製したDNAで最適化しておく必要があります。 まくいかなかった場合にのみ使用してください。最終濃度0.1 X ∼ 1 Xで使用してください。 製品アプリケーション KAPA3G Plant PCRキットは、以下のPCR増幅に理想的なキットです。 ■ 市販キットで抽出した、あるいはCTABベースの方法で抽出した植物の精製DNAからのフラグメント増幅（長さ5 kbまで）。 ■ リーフディスク（葉の断片）や種子サンプル、その他の植物組織サンプルからのダイレクトPCR。 ■ 葉や種子から得たクルード（粗抽出）DNAからのPCR。 KAPA3G Plant PCRキットを用いたPlant PCRの最適化に関する詳細な情報は、 「KAPA3G Plantアプリケーションノート」を参照ください。 製品仕様 輸送および保存 製品のお受け取り後は、常時-20℃のフリーザー内で全コンポーネントを保存してください。上記の条件下で保存し、正しく取り扱うことにより、ラベ ルに示された有効期限まで十分な活性を保持します。 ご使用前に必ず、すべてのコンポーネントが完全に解凍し、適切に混合されていることを確認してください。解凍後の試薬の保管温度は、短期間（1ヶ 月まで）の場合、4℃で保管できます。長期間の場合は、再度-20℃で保管ください。 品質管理 KAPA3G Plant DNAポリメラーゼは、混入しているタンパク質が2%未満であることが確認されています（Agilent Protein 230アッセイ）。 KAPA3G Plant PCRキットは、厳しい品質管理検査を受けており、エキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性のコンタミネーションは なく、DNAコンタミネーションに関する厳格な要件に適合しています。 1 KAPA3G Plant PCR Kit セクション1 ：精製したDNAのPCR 注意：ダイレクトPCRあるいはクルードサンプルPCRを実施する前に、下に示すプロトコールを使って、精製したDNAで反応条件を最適化してください。 反応条件が最適化された後、ダイレクトPCR（セクション2）あるいはクルードサンプルPCR（セクション3）のいずれかに進んでください。 反応セットアップ：精製したDNA サイクルプロトコール 各反応は以下のようにセットアップしてください。 PCRは以下のサイクルプロトコールで実施してください。 コンポーネント 50 μl rxn1 最終濃度 ステップ 温度 PCR grade water 50 μl未満 N/A 初期変性 25.0 μl 1X 変性1 必要に応じて >1.5 mM 3 50 ∼ 68℃ 15 sec 1.5 μl 0.3 μM 伸長 72℃ 30 sec/kb 最終伸長 72℃ 1 min/kb KAPA Plant PCR Buffer（2X）2 MgCl2（25 mM） Forward Prime（10 μM） Reverse Primer（10 μM） Template（DNA）4 2.5 U/µl KAPA3G Plant DNA Polymerase 5 1.5 μl 0.3 μM 必要に応じて 必要に応じて 0.4 μl 1U アニーリング2 期間 サイクル数 95℃ 3 min 1 95℃ 20 sec 35 1 1：20 sec/cycleで変性を行ってください。複雑な配列やGCの多いタ ーゲットでは、変性を30 sec/cycleに上げることも可能です。 2：平均プライマー Tm＋2℃に設定するか、あるいはグラジエントPCR 1：条件が最適化された後は、反応量を50 μlより減らすことも可能です。 2：KAPA Plant PCRバッファーには、1.5 mM のMgCl2（1X）と各0.2 mM のdNTP（1X）が含 を使用してアニーリング温度を最適化してください。 まれています。 3：必要に応じてMgCl2を追加してください。 4：反応50 μlに対し精製したDNAを1 ∼ 50 ng 使用してください。 5：反応50 μlに対し酵素を1 U使用してください。精製したDNAの増幅の場合、酵素の追加はほとん ど必要ありません。 セクション2：ダイレクトPCR 多様な植物種の葉あるいは種子を使用してダイレクトPCRを実施することが可能ですが、阻害物質の濃度が高い植物（Eucalyptus spp.など）では推奨さ れません。PCRへ加える植物組織の量のコントロールは極めて重要で、一貫性を維持するためにサンプリングツール（直径0.35 mm ∼ 0.5 mm）を使用 することが必要です。過剰量の植物組織をPCRへ加えると、反応で失敗する可能性が高くなります。ダイレクトPCRの結果が良くない場合、あるいは、ひ とつのサンプルから複数の反応を実施する必要がある場合は、クルードサンプルPCR（セクション3）が推奨されます。 反応セットアップ：ダイレクトPCR サイクルプロトコール 各反応は以下のようにセットアップしてください。 精製されたDNAで最適化されたサイクルプロトコール（セク ション1 ：精製したDNAのPCR）を使用してPCRを実施して ください。以下の点にご注意ください。 コンポーネント 50 μl rxn1 最終濃度 PCR grade water 50 μl未満 N/A 25.0 μl 1X 必要に応じて >1.5 mM 2 2 X KAPA Plant PCR Buffer 25 mM MgCl2 Forward Prime（10 μM） 1.5 μl 0.3 μM Reverse Primer（10 μM） 1.5 μl 0.3 μM 必要に応じて 0.1∼1X 直径0.3∼0.5 mm N/A 0.4 μl 1U 100X KAPA Plant PCR Enhancer3 Template（リーフディスク）4 KAPA3G Plant DNA Polymerase（2.5 U/μl） 5 1：反応中の阻害物質濃度が高くなるため、50 μl未満の反応量は推奨しません。 2：ダイレ ク トPCRで は、通 常、必 要 なMgCl2濃 度 が 高 く な り ま す の で、最適化を実施ください。 MgCl2の最適濃度は、通常は、2 ∼ 3 mMの範囲です。 3：反応が得られない場合やアンプリコンの収量が低い場合は、KAPA Plant PCRエンハンサーを加 えることが可能です（最終濃度1X未満）。 4：0.35 ∼ 0.5 mmのリーフディスクを加える際にはサンプリングツールを使用してください。 5：ダイレクトPCRには酵素の追加が必要となる場合があります。収量が低い場合、1ユニットずつ追 加してください。 ■ 通常ダイレクトPCRで必要となるサイクル数は、精製され たDNAでのPCRよりも多くなる可能性があります。最低で も40回から始め、必要に応じてサイクル数を5回ずつ増やし てください。 ■ ダイレクトPCRはサンプルに存在する阻害物濃度が高いた め、長い伸長時間が必要となることがあります。30 sec/kb で高い収量が得られない場合は、15 secずつ増やしてくだ さい。 KAPA3G Plant PCR Kit セクション3：クルードサンプルPCR KAPA3G Plant PCRキットでのクルードサンプルのPCRは、下に示すプロトコールを使用してクルード抽出物を用意してください。 抽出バッファーの準備 必要量のKAPA3G Plant 抽出バッファーを以下のように調製してください。 ■ Tris-HCl（pH 8.0 ∼ 8.5） ：50 mM ■ EDTA：0.1 mM ■ 2% ß-メルカプトエタノール（使用直前に添加）1 ■ オプション：0.2X KAPA Plant PCRエンハンサー 2 1：ß-メルカプトエタノールが入手できない場合の代替として、ジチオスレイトール（DTT）を最終濃度10 mMで使用することが可能です。ただし、DTTで調製した抽出物は、通常、 ß-メルカプトエタノールで調製した抽出物よりも安定性が低くなるため、PCRの収量も低くなる場合があります。 2：KAPA Plant PCRエンハンサーは、うまく増幅できない場合のみ使用してください。同じサンプルについてエンハンサーを使用した場合としない場合で評価して判断してく ださい。 抽出手順 特定の植物に対する最適な抽出手順は、最初にクルードサンプルPCRを行う際に決定しなくてはなりません。これには熱処理が必要かどうかの判断が含 まれ、以下の方法で行われます。 ■ メスあるいは1つ穴のパンチを使って約5×5 mmの葉あるいは種子の組織片を2つ用意し、2本のチューブにそれぞれ入れます。大きさが5 mmに満た ない種子の場合は、種子全体を潰すあるいは切断して、子葉を露出させて使用します。大きな種子や周りが堅い種子は、メスでの切断、あるいは乳鉢と乳 棒ですり潰すことが必要とされる場合もあります。 ■ Extraction Buffer 100μlを各チューブに入れ、サンプル全体がバッファーに浸かっていることを確認します。 ■ 滅菌したピペットチップの先を使い、Extraction Buffer内で葉あるいは種子のサンプルを静かに叩き、傷を付けます。 ■ 2本の遠心管のうち1本を氷の上に置き、もう1本を95℃で5分間インキュベートします。インキュベーションが完了した後の遠心管は、PCRのセットア ップまで氷上に置きます。 ■ 2つのクルード抽出物を1つずつPCRにかけ、使用する植物タイプに熱処理が必要かどうかを判断します。 抽出物の安定性は、サンプルに依存します。Extraction Bufferにß-メルカプトエタノールを使用し、本プロトコールで抽出した抽出物は、通常4℃で3 ∼ 5 日間の安定性があります。 （DTTを使用した場合、安定性がより低くなる場合があります。） 反応セットアップ：クルードサンプルPCR サイクルプロトコール 各反応は以下のようにセットアップしてください。 精製されたDNAで最適化されたサイクルプロトコール（セク ション1 ：精製したDNAのPCR）を使用してPCRを実施して ください。以下の点にご注意ください。 コンポーネント 50 μl rxn1 最終濃度 PCR grade water 50 μl未満 N/A 25.0 μl 1X 必要に応じて >1.5 mM2 Forward Prime（10μM） 1.5 μl 0.3 μM Reverse Primer（10μM） 1.5 μl 0.3 μM 必要に応じて 0.1∼1X 1 μl N/A 0.4 μl 1U 2 X KAPA Plant PCR Buffer 25 mM MgCl2 100X KAPA Plant PCR Enhancer3 クルード抽出物 KAPA3G Plant DNA Polymerase（2.5 U/μl）4 1：初めの検証には、50μlの反応量を使用してください。反応量を減らす場合は、 「重要なパラメータ： 反応量」を参照してください。 2：クルードサンプルPCRでは、通常、必要なMgCl2濃度が高くなりますので、最適化を実施ください。 MgCl2の最適濃度は、通常は2 ∼ 3 mMの範囲です。 3：反応が得られない場合やアンプリコンの収量が低い場合は、KAPA Plant PCRエンハンサーを加 えることが可能です（最終濃度1X未満）。 4：クルードサンプルPCRには酵素の追加が必要となる場合があります。収量が低い場合、1ユニット ずつ追加してください。 3 ■ クルードサンプルPCRで必要となるサイクル数は、精製さ れたDNAでのPCRよりも多くなる傾向があります。最低で も40回から始め、必要に応じてサイクル数を5回ずつ増やし てください。 ■ クルードサンプルPCRはサンプルに阻害物質が存在するた め、長い伸長時間が必要となることがあります。30 sec/kb で高い収量が得られない場合は、15 secずつ増やしてくだ さい。 KAPA3G Plant PCR Kit 重要なパラメータ 反応量 反応の最適化は50μlの反応量で行います。テンプレートとして精製されたDNAを使用している場合は、必要に応じて反応量を減らすことが可能です。ク ルードサンプルPCRのプロトコール（セクション3）は、10μlの反応量で検証されています（反応ごとに1：10で希釈したクルード抽出物を1μl使用）。ダイ レクトPCRでは、サンプルサイズを合わせて減らさない限り、反応量を50μl未満に減らした場合、うまく増幅しないリスクが高くなります。 サンプルサイズ 植物組織の阻害性のため、ダイレクトPCRプロトコールで得た結果は、テンプレートとして使用した組織の量が減るほど改善されます。一貫した結果を得る ためにはサンプリングツール（0.35 mm ∼ 0.5 mm）を使用し、同一量のサンプルを各ダイレクトPCRに加えてください。 クルードサンプルPCRのプロトコールでは、より多くのサンプル量を使用することが可能のため、サンプリングの目的でメスを使用することができます。 ダイレクトPCRまたはクルードサンプルPCR 通常、ダイレクトPCRよりもクルードサンプルPCRが望ましい方法です。以下はその理由です。 • サンプルサイズの厳密なコントロールを必要としません。 • ひとつのクルード抽出物から複数のPCRを実施することができます。 • PCRの追加あるいは反復が必要となった場合、クルード抽出物は4℃で3 ∼ 5日保管できます。 • 再現性がダイレクトPCRよりも優れています。 • ダイレクトPCRと比較し最適化の必要が大幅に削減されます。 • ダイレクトPCRはサンプルタイプによって使用できないものがあります。 MgCl2 濃度 KAPA Plant PCRバッファーには、濃度1.5 m MのMgCl2（1X）が含まれています。通常、精製したDNAのPCRでは十分な濃度ですが、ダイレクトPCR あるいはクルードサンプルPCRではMgCl2の追加が必要となる場合があります。まずは最終濃度2 mMのMgCl2を推奨します。 酵素濃度 精製されたDNAでは、50μl の反応量に対して1ユニットのKAPA3G Plant DNAポリメラーゼが推奨されます。ダイレクトPCRおよびクルードサンプル PCRのプロトコールでは、まず1ユニットで試し、必要に応じて1ユニットずつ増やしてください。 KAPA Plant PCRエンハンサー KAPA Plant PCRエンハンサーは、Extraction Buffer（セクション3）あるいはPCR反応液自体に使用できるオプションの添加剤です。使用できる濃度 の範囲は0.1 ∼ 1Xです。エンハンサーは、PCRで良好な結果が得られないときだけに使用します。 プライマー PCRの成功にとってプライマーの質は極めて重要です。分解を防ぐため、プライマーは、水ではなく10 mM のTris-HCl（pH 8.0 ∼ 8.5）で希釈・保管します。 また、プライマーセットは、計算上のTm値が同じあるいは近くなるように設計します。 特定のプライマーでPCRを始める前に、ユニバーサルプライマーを使用して特定のサンプルタイプに対するダイレクトPCRやクルードサンプルPCRを、評 価しておくことも有用かもしれません。これによって、サンプルタイプがダイレクトPCRあるいはクルードサンプルPCRに適しているかどうかの判断が可能 となります。 GCリッチな配列のPCR GC含量が高い（> 65%）場合は、5%のDMSOを加えて反応を促進することができます。 GC含量が非常に高い場合は、テンプレートとして精製されたDNAを用いた場合でも難しい可能性があり、このようなアッセイは、ダイレクトPCRあるいは クルードサンプルPCRに変換することも困難となる可能性もあります。 サイクルプロトコール KAPA3G Plant PCRキットには、エンジニア酵素が含まれていますので、通常の野生型Taqで使われるようなサイクルプロトコールは使用しないでくださ い。30 sec/kbの伸長時間で十分に効率的な増幅が得られます。 精製されたDNAのテンプレートの場合は35サイクル（反応当たり∼ 10 ng）を推奨します。一方ダイレクトPCRには45サイクル、クルードサンプルPCR には40サイクルからお試しください。 アニーリング温度は、テンプレートに関わらず、PCRを成功させる上で最も重要なパラメータです。KAPA Plant PCRバッファーは、広い範囲のアニーリ ング温度（∼ 10℃）で特異的な増幅を促進するように設計されており、アニーリング温度の最適化の必要性が軽減されます。アニーリング温度をプライマ ーの計算上のTm値よりも2℃高く設定して始め、必要に応じて温度を上げる（特異性を上げる場合）、または下げる（収量を改善する場合）ように調整します。 ●注意：本製品は研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。 また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。 http://www.n-genetics.com 本 社 ： 〒112-0004 東京都文京区後楽１丁目４番14号 後楽森ビル18F Tel. 03（3813）0961 Fax. 03（3813）0962 西日本営業所 ： 〒604-8277 京都府京都市中京区西洞院通御池下ル565番地 ラフィーネ御池3F Tel. 075（257）5421 Fax. 075（257）5422 2013年12月現在のものです。製品は改良のため予告なく変更する場合があります。 4 10P1312
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