悪性腫瘍に対する高選択的細胞毒性を有する
インディルビン誘導体
日本大学薬学部臨床医学研究室教授
日本大学薬学部有機化学研究室教授
日本大学薬学部臨床医学研究室准教授
日本大学薬学部有機化学研究室助教
鈴木
宮入
田畑
齋藤
孝
伸一
恵市
弘明
1
Indirubin とは？
O
NH
N
H
O
indirubin
板藍根
１．板藍根 (Isatis indigotica 他) という生薬に多く含有される
色素成分である。
２．Aryl hydrocarbon receptor (AhR; 別名ダイオキシン受容体)
のリガンドであることが示された。
３．近年、Cyclin dependent kinases (CDKs) や Glycogen synthase
kinases (GSKs) は、indirubin 誘導体により阻害されるという
報告がある。
2
研究目的
1．Indirubin 誘導体の神経芽腫細胞及び正常細胞に対する
細胞傷害活性評価
MTT法
・ヒト神経芽腫細胞（IMR-32、NB-39、SK-N-SH、 LA-N-1）
・正常細胞（NHDF-neo、HUVEC）
2．活性に基づいて最適化された indirubin 誘導体の合成
(現時点で計 68 種類)
ケミカルバイオロジー
3．代表的な化合物のさらなる活性解析
アポトーシス解析、細胞周期
3
Indirubin 誘導体
1
6
11
N
H
O
2
7
N
H
O
O
N
O
O
17
N
H
Br
O
O
22
Br
HO
OMe
N
NH
NH
N
H
12
HO
21
O
NH
MeO
HO
Br
16
N
NH
NH
N
H
HO
OH
O
O
OMe
HO
N
N
Br
NH
NH
N
H
N
H
O
3
Br
NH
N
H
O
8
OMe
HO
13
OMe
O
N
H
4
N
H
CH 3
HO
O
OMe
O
NH
N
H
O
14
O
Br
O
NH
N
H
O
5
OH
10
HO
O
O
NH
N
H
O
NH
N
H
O
15
MeO
O
19
MeO
NH
N
H
O
9
HO
N
NH
N
H
O
20
O
N
O
Br
N
NH
N
H
O
18
HO
N
N
N
H
O
MeO
NH
NH
O
Br
N
H
O
NH
NH
NH
N
H
MeO
O
N
H
O
NH
N
H
O
4
Indirubin 誘導体の細胞傷害活性 (MTT、48 h)
6
40
20
0
-5
-7
concentration (logM)
-6
2
80
60
40
20
-5
80
60
40
20
-7
-6
3
-5
20
0
40
20
-6
-5
0
-4
-7
concentration (logM)
-6
4
-5
60
40
20
60
40
20
-5
0
-4
-7
-6
-5
5
80
60
40
20
0
-6
100
80
60
40
20
-7
120
100
80
60
40
20
0
-5
concentration (logM)
-4
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
-5
-4
20
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
0
-4
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
18
-6
-5
100
80
60
40
1
20
0
-4
-7
100
-6
-5
-4
concentration (logM)
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
19
14
100
120
80
60
100
80
60
40
20
0
-6
40
-5
0
-4
-7
-6
15
120
0
0
60
-4
20
20
80
-5
concentration (logM)
-7
40
100
80
60
-6
-5
-4
40
concentration (logM)
20
0
0
40
concentration (logM)
survival (% of control)
survival (% of control)
100
-7
-7
10
120
-6
22
60
0
0
120
-7
concentration (logM)
concentration (logM)
20
-4
0
-4
80
-4
40
concentration (logM)
140
-5
60
0
concentration (logM)
0
-6
80
120
80
-5
100
120
0
0
-6
120
concentration (logM)
100
20
120
0
survival (% of control)
survival (% of control)
80
-6
-7
9
100
40
0
100
-4
120
-7
20
concentration (logM)
120
0
40
0
0
-7
60
0
survival (% of control)
survival (% of control)
40
-7
13
60
60
17
120
80
80
0
0
concentration (logM)
100
100
concentration (logM)
80
8
60
20
-4
100
-4
120
80
40
120
concentration (logM)
100
-5
0
0
60
12
100
-4
120
0
-6
120
0
-6
80
concentration (logM)
survival (% of control)
survival (% of control)
survival (% of control)
100
-7
-7
7
concentration (logM)
survival (% of control)
0
-4
120
0
survival (% of control)
-5
100
0
concentration (logM)
120
0
20
0
0
-4
40
survival (% of control)
-6
60
survival (% of control)
-7
80
survival (% of control)
0
100
120
survival (% of control)
20
60
survival (% of control)
40
80
survival (% of control)
60
100
21
120
survival (% of control)
80
16
120
survival (% of control)
survival (% of control)
survival (% of control)
100
0
survival (% of control)
11
120
survival (% of control)
1
120
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
5
7
O
#5
HO
O
N
H
O
4
O
100
80
60
40
20
0
6
120
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
-7
concentration (logM)
#7
-6
-5
#8
0
-7
-6
NH
O
40
20
9
100
80
60
40
20
0
0
-5
concentration (logM)
-4
O
120
survival (% of control)
60
OMe
N
H
8
80
-4
#9
120
100
-5
concentration (logM)
O
N
H
O
7
-6
20
NH
120
-7
40
O
NH
0
60
-4
OMe
O
-4
80
concentration (logM)
MeO
N
H
100
0
0
-4
O
120
140
survival (% of control)
survival (% of control)
N
H
5
120
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
NH
NH
survival (% of control)
N
H
N
H
OH
O
O
NH
NH
#6
OH
O
survival (% of control)
M)
#4
6
5
survival (% of control)
5
細胞傷害活性: 5位＞6位、7位
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
6
5 位に何を導入しても活性が増強するのか？
1
120
100
survival (% of control)
120
増強
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
0
-4
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
concentration (logM)
120
80
60
40
20
40
20
0
0
0
0
-7
-6
-7
-6
80
60
40
20
0
-6
100
80
60
40
20
-5
-7
-6
-5
40
20
0
-4
-7
60
40
20
0
37
100
80
60
40
20
0
-4
-4
140
survival (% of control)
80
-5
CM
32
100
-6
concentration (logM)
120
concentration (logM)
60
t-Bt
120
-5
80
concentration (logM)
31
-6
100
0
0
-4
isoPr
-7
-4
30
120
concentration (logM)
0
-5
120
0
-7
-4
Et
survival (% of control)
survival (% of control)
100
0
-5
concentration (logM)
140
survival (% of control)
O
survival (% of control)
N
H
60
29
120
NH
80
Me
24
O
100
concentration (logM)
Br
5
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
7
増強せず
survival (% of control)
0
OMe
100
survival (% of control)
4
1
survival (% of control)
120
OH
survival (% of control)
H
120
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
7
#1
6
#7
N
H
N
H
O
120
80
60
40
20
0
survival (% of control)
survival (% of control)
120
100
100
80
60
40
20
-7
-6
-5
0
-4
-7
concentration (logM)
-6
-5
80
60
40
20
0
-4
#9
-6
-5
-4
concentration (logM)
#15
#14
O
OMe
O
-7
concentration (logM)
O
MeO
NH
NH
N
H
N
H
O
NH
MeO
O
80
60
40
20
120
survival (% of control)
100
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
O
15
120
0
N
H
14
9
120
-4
100
0
0
0
O
8
7
120
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
NH
N
H
O
1
O
survival (% of control)
N
H
O
NH
NH
6’
OMe
O
5’
NH
#8
MeO
O
7
O
survival (% of control)
M)
5
survival (% of control)
5
5’位のメトキシは腫瘍細胞選択性を増大する
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
8
5’-methoxy indirubin によるアポトーシス誘導
O
MeO
NH
N
H
O
#14
Vehicle
10-6 M 10-5 M 10-4 M
IMR-32、24 h
IMR-32、48 h
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 5370–5373
9
HO
N
O
3’
O
NH
N
H
O
1
120
survival (% of control)
O
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
0
-4
-7
concentration (logM)
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
O
2
120
survival (% of control)
N
H
NH
NH
N
H
-6
-5
#9
#12
HO
OMe
O
OMe
N
NH
NH
N
H
N
H
O
9
-4
-4
concentration (logM)
O
12
120
120
survival (% of control)
M)
#2
#1
survival (% of control)
5
3’位のオキシムは細胞傷害活性を増大する
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
10
オキシムとメトキシを組み合わせたら理想的な活性が得られるか？
HO
1
N
N
H
N
H
1
O
survival (% of control)
120
100
80
60
40
120
NH
100
O
2
60 100
40
80
60
20
0
20
0
40
20
0
-7
-6
0
0
-7
-6
-5
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
80 120
survival (% of control)
NH
survival (% of control)
O
0
-4
-7
concentration (logM)
-5
concentration (logM)
-6
-5
-4
-4
concentration (logM)
HO
O
N
MeO
MeO
NH
NH
N
H
O
N
H
14
O
23
120
survival (% of control)
survival (% of control)
120
100
80
60
40
20
0
100
?
80
60
40
20
0
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
0
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
11
細胞傷害活性の構造活性相関
6
5
6
5
HO
5’
7
O
4’
3’
5’
N1
6’
N
H
H
H
H
H
H
5 > 6,7
10
11
12
23
H
H
H
H
13 H
17 H
18 H
22
26
28
33
34
35
36
OMe H
H
H OMe H
H
H OMe
H
H
H
H
H
H
H
OMe OMe
Br
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Br
H
H Me H
H
Et
H
H isoPr H
H t-Bt H
3 Me
H
Br
NHDF
H
HUVEC
2 H
NB-39
6’
SK-N-SH
5’
IMR-32
4’
40 uM
HUVEC
7
NHDF
6
NB-39
5’-メトキシ基は腫瘍選択的な
活性増強をする
5
IMR-32
H
H
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
1
SK-N-SH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OMe H
H OMe
H
H
H
H
Br
H
Br
H
H
H
H
H
H
O
4 uM
HUVEC
NHDF
NB-39
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
IMR-32
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
6’
SK-N-SH
H
Br
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Br
H
H Me H
H
Et
H
H isoPr H
H t-Bt H
H CM H
Me H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
5’
N
H
40 uM
HUVEC
H
H
H
OH H
H
H OH H
H
H OH
OMe H
H
H OMe H
H
H OMe
H
H
H
H
H
H
4’
NHDF
7
NB-39
24
16
25
19
20
21
27
29
30
31
32
37
38
H
H
H
H
H
H
H
H
H
6
SK-N-SH
1
4
5
6
7
8
9
14
15
5
N1
O
IMR-32
1
3’
6’
4 uM
7
N
4’
オキシムは活性を
増強する
H
H
H
OMe
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Br
H
Br
H
H
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
細胞生存率 (%)
<20 20-40 40-60 60-80 80<
12
ここまでのまとめ
1) 5位に結合する水酸基またはメトキシ基は、6位、7位の
それより活性が高かった。
2) 5’位にメトキシ基が結合する化合物は、最も高い腫瘍選択性
が認められた。
3) 3’位にオキシム構造があると活性が上がった。
3’
6
5
7
O
5’
NH
N
H
O
13
ドッキングシュミレーション
Indirubin は CDK、GSK-3b の ATP 結合部位にはまり込み、ATP の
結合を阻害する。
この結合に、水素結合が強く寄与することがドッキングシミュレー
ションで示唆されている。
X線結晶構造解析の結果から、インディルビン 3’ 位周辺は立体的
に空いていると推測され、3’位は構造修飾に向いていると考えられる。
(Vougogiannopoulou K. et al. J Med Chem 2008, 51, 6421）
3’
O
NH
N
H
O
14
3’位のオキシムをさらに改変した
#2
3’
#1
#43
HO
NH
N
H
O
1
N
H
O
120
80
60
40
20
0
survival (% of control)
100
100
80
60
40
20
-6
-5
concentration (logM)
-4
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
NHDF
HUVEC
100
80
60
40
20
0
0
-7
O
43
120
survival (% of control)
survival (% of control)
NH
2
120
-8
O
N
NH
N
H
O
N
O
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
-8
-7
-6
-5
-4
concentration (logM)
エポキシドを導入することにより飛躍的に活性が増強した。
15
Hoechst 33342 染色
O
O
N
NH
N
H
O
43
vehicle
0.1 mM
1 mM
IMR-32、 24 h
10 mM
16
O
Flow cytometry (apoptosis)
O
N
NH
N
H
43
O
v
Control
1vmM
v mM
10
PI
0.1vmM
Annexin V
IMR-32、 24 h
B4 (early apoptosis)
B3 (alive)
80
*
100
100
80
80
60
**
%
%
60
40
40
**
20
0
N
V
-7
-6
concentration (logM)
-5
60
%
100
B2 (late apoptosis)
20
20
0
0
N
V
-7
**
40
*
-6
concentration (logM)
-5
**
N
V
-7
-6
-5
concentration (logM)
One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01 vs Vehcle control
17
アームの長さを伸ばした
#43
O
#60
O
O
O
O
N
N
N
NH
N
H
N
H
O
N
H
O
100
80
60
40
20
0
Survival (% of control)
Survival (% of control)
100
100
80
60
40
20
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
O
62
60
120
survival (% of control)
NH
NH
43
-8
#62
O
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
LA-N-1
NHDF
HUVEC
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
Concentration (log M)
-4
-8
-7
-6
-5
-4
Concentration (log M)
アームを長くすることにより活性が落ちた。
18
エポキシド部分を改変した
#52
#53
O
O
O
N
N
O
43
O
60
40
20
0
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
N
H
O
53
100
80
60
40
20
0
-8
NH
120
100
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
O
61
120
survival (% of control)
survival (% of control)
survival (% of control)
N
H
120
80
N
NH
52
120
O
N
NH
N
H
100
OH OH
HO
NH
N
H
#61
Survival (% of control)
O
#43
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
LA-N-1
NHDF
HUVEC
100
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
-8
-7
-6
-5
-4
Concentration (log M)
ジオールで活性低下、それ以外は活性を失った。
19
部分構造体の細胞傷害活性
R2
O
R3
R1
O
R5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
R1
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Me
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
N
R4
R2
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
N
R1
R3
R4
H
H
OMe
H
H
OMe
H
H
OMe
OMe
OH
H
H
OH
H
H
OH
OH
H
H
H
H
Br
H
H
Br
H
H
F
H
Cl
H
NO2
H
CF3
H
Me
H
Et
H
isoPr
H
t-Bt
H
CM-Me
H
CM
H
CPr-Me
H
CPr
H
CMeO
H
R5
H
H
H
OMe
H
H
H
OH
H
H
H
H
H
Br
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
IMR-32
4 uM 40 uM
28
29
R1
H
Br
IMR-32
4 uM 40 uM
R1
N
30
31
32
43
44
IMR-32
R1 4 uM 40 uM
AcOH
EtOH
MeOH
oxime
epoxy
細胞生存率 (%)
<20 20-40 40-60 60-80 80<
20
メトキシ基を導入した
#43
O
#45
O
O
#46
O
NH
N
H
43
N
H
O
20
0
100
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
O
63
100
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
O
120
Survival (% of control)
40
N
H
120
survival (% of control)
60
NH
46
120
survival (% of control)
survival (% of control)
NH
45
120
80
N
NH
O
O
N
MeO
100
O
O
N
N
H
MeO
OMe
O
N
#63
IMR-32
SK-N-SH
NB-39
LA-N-1
NHDF
HUVEC
100
80
60
40
20
0
-8
-7
-6
-5
concentration (logM)
-4
-8
-7
-6
-5
-4
Concentration (log M)
メトキシ基導入による選択性や活性の上昇は認められなかった。
21
エポキシド誘導体の細胞周期への影響
Cell cycle status (24 h)
poly
G2M
S
G0G1
subG1
50
63
62
61
60
53
52
46
45
43
2
1
0
Veh
Ratio (%)
100
IMR-32
22
細胞周期に特徴的な影響を及ぼした化合物
G2M
#61
50
**
Ratio (%)
40
OH OH
30
**
** **
*
#61
O
N
20
NH
10
N
H
63
62
61
60
53
52
46
45
43
2
1
Veh
0
S
#46
25
**
O
#46
O
N
15
10
NH
5
N
H
O
63
62
61
60
53
52
46
45
43
2
1
0
Veh
Ratio (%)
OMe
*
20
O
Control
23
エポキシド誘導体の構造活性相関
5
-
6
-
-
2
Oxime
-
-
-
-
43
Epoxide
-
-
-
-
45
Epoxide
OMe
-
-
-
63
Epoxide
-
OMe
-
46
Epoxide
-
-
OMe
60
EtEpoxide
-
-
-
62
PrEpoxide
-
-
-
61
Dihydroxy
-
-
-
52
Allyloxime
-
-
-
53
O-Ethanol
-
-
-
0.3～1
1～3
IC50 (μM)
～0.3
-
HUVEC
-
5'
-
NHDF-neo
LA-N-1
NB-39
3'
SK-N-SH
IMR-32
#
1
S arrest
G2M arrest
3～10
10～30
30～
24
総括
1．エポキシドを導入した indirubin 3’-(O-oxiran-2-ylmethyl)oxime
は強力なアポトーシス誘導活性を示した。
2．エポキシドまでのアームの長さは短い方が活性が高かった。
3．エポキシド構造が活性に重要であることが示された。
4．メトキシ基導入により活性や選択性の向上はもたらされなかった。
5．エポキシドをジオールに加水分解した化合物は顕著なG2/M 期
細胞周期停止を示した。
6．6位にメトキシ基を導入したエポキシド化合物は顕著な S 期
細胞周期停止を示した。
Indirubin 3’-(O-oxiran-2-ylmethyl)oxime とその類
縁体は神経芽腫治療薬のシーズとして有用であ
ることが示された。
25
想定される用途
１．Indirubin 3’-(O-oxiran-2ylmethyl)oxime（＃４３）は
強力なアポトーシス誘導効果があるため、広く悪性腫瘍
に対して、抗腫瘍薬としての利用が考えられる。
２．＃４３の類縁体は細胞周期停止作用もあり、複数の
抗腫瘍作用が期待できる。
26
実用化に向けた課題
１．諸種の腫瘍細胞株での活性を行っていない。
２．動物実験（in vivo実験）を行っていない。
３．腫瘍特異的輸送される drug delivery systemが
確立されていない。
27
企業への期待
１．動物実験に関しては、各企業が持っている
技術により克服できると考えている。
２．Drug delivery system の技術を持つ、企業
との共同研究を希望
３．抗腫瘍薬を開発中の企業、抗腫瘍薬分野へ
の展開を考えている企業には、本技術の導
入が有効と思われる。
28
本技術に関する知的財産権
発明の名称：悪性腫瘍に対する高選択的細胞毒性を
有するインディルビン誘導体
出願番号：特願2013-524655，
米国，EP（JST外国出願支援）
出願人：学校法人日本大学
発明者：鈴木孝、宮入伸一、齋藤弘明、田畑恵市
29
お問い合わせ先
日本大学産官学連携知財センター(NUBIC)
コーディネーター渡辺麻裕
ＴＥＬ０３－５２７５－８１３９
ＦＡＸ０３－５２７５－８３９８
e-mail [email protected]
30

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