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がん細胞内への還元型ビタミン K2 の送達法とその効果に関する研究
創剤学教室瀬戸口修一
【背景•目的】
肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma, HCC) は肝切除やラジオ波焼灼などの治療後におい
ても肝内転移や多中心性発癌による再発率が非常に高いために長期予後が極めて悪いがん
である。従って、長期投与に耐える安全性の高い再発予防剤が望まれていた。Vitamin K2
の中でも menaquinone-4 (MK-4, vitamin K2(20)) の HCC に対する増殖抑制効果が in vitro と
in vivo で報告された。また、MK-4 の骨粗鬆症治療薬として長期投与の安全性が確立されて
いたことと相まって、MK-4 は HCC の再発予防薬として大きく期待された。小規模の臨床
試験では MK-4 は肝硬変患者における de novo 発癌、外科的手術後の HCC 再発を抑制した。
しかしながら、最近の大規模の臨床試験では失敗の結果となった。HCC 患者において、正
常肝組織に比べ HCC 組織での vitamin K レベルが低下していること、正常肝細胞に比べ HCC
細胞では MK-4 の取り込み速度が低下していることが報告され、HCC 組織における MK-4
の availability の低さが臨床試験失敗を招いた可能性が考えられた。一方、des-γ-carboxy
prothrombin (DCP) は、よく知られた HCC の腫瘍マーカーであり vitamin K 依存性カルボキ
シ化反応が不完全な異常プロトロンビンである、また、最近 HCC の増殖因子であることが
明らかになっている。カルボキシ化反応には vitamin K hydroquinone (KH2)（vitamin K の二
電子還元体）が律速因子である。以上のことから、HCC 細胞中に MK-4 の二電子還元体 (活
性体)である menahydroqinone-4 (MKH) を効率よく送達することで、MK-4 の低い availability
と DCP 生成が同時に克服でき、効率的な HCC の増殖抑制が可能になると仮説を立てた。
活性体 MKH は極めて酸化され易い化合物であるため、直接治療に用いることは不可能であ
る。私は、本研究において世界で初めて、MKH の prodrug 化によって HCC 細胞内へ効率的
に MKH を送達し、優れた HCC 増殖抑制効果を発揮させることを可能にした。
【結果】
(1) MKH 1,4-bis N,N-dimethylglycinate HCl
(MKH-DMG) による HCC 細胞内への
MKH の効率的な送達
MKH は極めて不安定であるため正確な
濃度を直接測定することは不可能である。
MK-4 は VKORC1L1 によって二電子還元
体 MKH となり γ-glutamyl carboxylase
(GGCX) の補因子として機能すると化学
量論的に MK-4 epoxide (MKO) へと代謝
され、MKO は VKORC1 によって MK-4 に
Fig. 1. Schematic illustration of vitamin K cycle
還元され Vitamin K cycle を形成している
and concept for MKH delivery system.
(Fig. 1)。即ち、HCC 細胞内 MKO 量は、少
なくとも細胞内に送達された MKH 量を反映することになる。そこで、MKH-DMG 投与後
の HCC 細胞中の MKH-DMG、MKO、MK-4 濃度を LC-MS/MS で測定し、その薬物濃度変
化から MKH 送達性を評価した。
A
B
Fig. 2. MKH delivery with MKH prodrug to PLC/PRF/5 cells. (A) Intracellular MKH-DMG
concentration-time profiles following 50 μM MKH-DMG treatment for up to 72 h. (B) Intracellular MK-4
and MKO concentration-time profiles following 50 μM MKH-DMG or MK-4 treatment.
DCP 陽性 HCC 株(PLC/PRF/5)に MKH-DMG または MK-4 を曝露させ、その細胞中の MK-4、
MKO、MKH-DMG 濃度の経時変化を Fig.2 に示した。MKH-DMG 投与後、細胞中の
MKH-DMG 濃度は 12 時間後まで速やかに上昇しプラトーに達した (Fig. 2A)。細胞内 MKO
と MK-4 濃度は、観察した 72 時間後まで経時的に上昇し、どちらの濃度ともに MK-4 投与
群に比較して、何れの時間においても有意に高い濃度で推移した (Fig. 2B)。また、同細胞
を用いた MKO 投与における検討から、MKH-DMG 投与における高い細胞内 MK-4 濃度 (Fig.
2B) は、HCC 細胞内で MKH-DMG が加水分解して生成した MKH の内、GGCX の補因子と
して使われなかった MKH が抽出過程で MK-4 に酸化されたものであることが強く示唆され
た。したがって、HCC 細胞中の MK-4 と MKO の和を、細胞内に送達された MKH とみなす
ことができ、MKO+MK-4 の濃度時間曲線下面積 (AUC) を用いて HCC 細胞内への送達性の
強度を比較した。MKH-DMG 投与は MK-4 投与に比較しての MKH の AUC0-72h が約 9 倍大
きく MKH の送達性が 9 倍高いことが明らかとなった。
(2) MKH-DMG による HCC 細胞の増殖抑制効果
DCP 陽性 HCC 細胞である PLC/PRF/5、HepG2、Hep3B の細胞培養液に薬物 (MK-4 また
は MKH-DMG) を投与し、経時的に生存細胞数を Cell Titer-Glo Viability Assay 試薬
(Promega) を用いて測定した。PLC/PRF/5 細胞に対する MKH-DMG の増殖抑制効果を MK-4
と比較した (Fig. 3)。MKH-DMG は速やかに低投与量で増殖抑制効果を発揮し、MKH-DMG
投与 72 時間後の IC50 は MK-4 投与の約 1/12 であった。MKH-DMG は MK-4 の約 10 倍の強
い増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。HepG2 および Hep3B に関しても同様に、
MK-4 投与と比較して MKH-DMG 投与において強い増殖抑制効果を示した。MKH-DMG 投
与による細胞内 MKH 送達性が MK-4 投与の約 9 倍高いことから MKH-DMG による HCC 細
胞の増殖抑制は細胞中 MKH によることが強く示唆された。
A
B
Fig. 3. Effects of MKH prodrug on cell growth of PLC/PRF/5 cells. Cell growth-time profiles were
determined by Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay. Cells were treated with various
concentrations of MK-4 or MKH-DMG for up to 96 h. (A) MK-4 treatment. (B) MKH-DMG treatment.
(3) MKH-DMG が細胞周期に及ぼす影響
細胞増殖抑制機構を明らかにする目的で、細胞周期に及ぼす薬物(MK-4 または
MKH-DMG)の影響を検討した。PLC/PRF/5 細胞培養液に MK-4 または MKH-DMG を投与し、
細胞周期関連タンパク (Cdk4, Cyclin D1, Cyclin D3) の発現を Western blot 法で検出した。
MKH-DMG は Cdk4、Cyclin D1、Cyclin D3 を時間依存的に減少させ、MK-4 よりも強く抑制
した (Fig. 4)。次に薬物投与後の HCC 細胞を propidium iodide (PI) 核染色しフローサイトメ
トリー解析した。MKH-DMG は G1 期の増加、S 期の減少および Sub G1 期を増加させた。
MKH-DMG は Cycline D1 と cdk4 の強い抑制と大きな G1 基の増加から G1arrest による増殖
抑制効果が明らかになった (Fig. 5)。
Fig. 4. Effects of MKH prodrug on expression of cell cycle regulatory proteins in
PLC/PRF/5 cells. Representative results from three independent experiments are
shown.
Fig. 5. Effects of MKH prodrug on cell cycle arrest in PLC/PRF/5 cells. PLC/PRF/5 cells were treated with 60
μM MK-4 or MKH-DMG for 12 and 48 h. The DNA content (propidium iodide) and cell cycle were analyzed by
flow cytometry. Indicated % values were number of DNA in G1- or S-phase per number of whole DNA.
Representative results from three independent experiments are shown.
(4) MKH-DMG による HCC 細胞の apoptosis 誘導
PLC/PRF/5 細胞培養液に MK-4 または
MKH-DMG を投与し、72 時間後の Caspase3/7 活
性を検出した。MKH-DMG は MK-4 と比して低濃
度でカスパーゼ 3/7 活性を亢進し (Fig.6)、また
SubG1 画分が増加したこと (Fig. 5)、さらに
Hep3B 細胞に対し 100 μM の MKH-DMG 投与後
72 時間において、DNA の断片化が観察されたこ
とから MKH-DMG が DCP 陽性 HCC 細胞に対し
て apoptosis を誘導することが明らかとなった。
Fig. 6. Effects of MKH prodrug on cell
apoptosis of PLC/PRF/5 cells. Cells were
treated with various concentrations of MK-4 or
MKH-DMG for 72 h. Values on the left are
ratios of caspase activity (Caspase Glo 3/7
Assay) and viable cells (Cell Titer-Glo assay),
(5) MKH prodrug の脾-肝転移モデルマウスを用い
as determined by coupled analysis.
た HCC に対する in vivo 効果評価
Balb/c nu/nu マウスを Vehicle 群 (n=15)、MKH-DMG 群 (n=15)、Sham 群 (n=8) に群分
けし、Vehicle 群と MKH-DMG 群の脾臓に PLC/PRF/5 細胞を移植した。Vehicle 群、Sham 群
は水のみを投与した。MKH-DMG 群は HCC 細胞の脾臓移植 6 日前から MKH-DMG を飲水
投与し、HCC 細胞投与後 50 日の肝重量、癌の面積、血漿中の DCP 濃度を測定した。
MKH-DMG 投与によってマウスの肝重量および肝癌化面積はどちらも Vehicle 群に対して
有意に低値となり肝臓における癌の増悪度は低くなった (p<0.05) (Fig. 7A, B)、また、血漿
中での DCP レベルは、ほぼ完全に抑制した (p<0.01) (Fig. 7C)。この結果、MKH-DMG は優
4
2
80
60
40
20
0
M
KH
-D
M
G
Ve
hi
cle
M
KH
-D
M
G
400
200
0
0
Ve
hi
cle
600
M
KH
-D
M
G
6
C
100
Cancer ratio, %
Liver weight, g
B
Ve
hi
cle
8
A
DCP in plasma, mAU/mL
れた増殖抑制効果を in vivo で発揮することが明らかになった。
Fig. 7. MKH prodrug-mediated suppression of HCC cell metastasis and growth were assessed in male
Balb/c nu/nu mice. (A) Total liver weight. (B) % of calculated cancer area by ImageJ software. (C) DCP
levels in plasma. Central horizontal line, mean; error bar, SD.
(6) MKH 送達性と増殖抑制効果に及ぼす MKH エステル型 prodrug の promoiety の影響
MKH エステル型 prodrug の HCC 細胞に対する MKH 送達には、1) prodrug 自身の HCC 細
胞への取り込み過程と 2) HCC 細胞内での加水分解過程が MKH の細胞内送達性の律速過程
であることが考えられる。MKH 送達における各過程の寄与を明らかにし、更に優れた MKH
送達性を有する MKH エステル誘導体の探索を行った。
MKH prodrug の promiety がカチオン性の MKH-DMG、中性の MKH acetate (MKH-ACT)、
アニオン性の MKH succinate (MKH-SUC)について、PLC/PRF/5 細胞への取込みを検討した。
MKH prodrug 自身の取込みは MKH-SUC>MKH-DMG> MKH-ACT の順となり、細胞内 MKO
と MK-4 の和による MKH 送達量は MKH-SUC>MKH-DMG> MK-4>MKH-ACT の順に多くな
り、HCC 細胞内への優れた MKH の送達性は、MKH
prodrug 自身の高い細胞内への取込みと、細胞内で
の速やかな MKH への再変換性に起因していること
が明らかとなった。
PLC/PRF/5 細胞に対する増殖抑制の IC50 値は
MKH-DMG で 32 μM、MKH-SUC で 16 μM であり
MKH-SUC は優れた増殖抑制効果を有することが
明らかになった。この増殖抑制効果は MKH-DMG
と同様に MKH を効率よく HCC 細胞内に送達する
ことで増殖抑制効果を発揮したと考えられた。
Fig. 8. MKH delivery with MKH prodrug to
PLC/PRF/5 cells. Intracellular concentrations of
MK-4, MKO and the sum of these following 50
【結論】MKH の prodrug である MKH-DMG は HCC
細胞に対して効率的な MKH 送達を可能にし、HCC
μM
MK-4,
MKH-ACT,
MKH-DMG
MKH-SUC treatment for 24 h.
に対して優れた増殖抑制効果を発揮することが in vitro と in vivo で明らかになった。
MKH-DMG は MK-4 の約 1/10 低用量で効果を発揮できることから、MK-4 の当量の投与量
において長期投与における高い安全性が期待できると同時に高い効果が期待でき再発予防
剤として有望である。In vitro の検討において、MKH-SUC が MKH prodrug として効率よく
機能し、更に有望である。In vivo での投与形態における availability および増殖抑制効果の
評価が必要であり、これからの課題である。
or

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