Journal Article / 学術雑誌論文 感染防御抗原とコード遺伝子 : 分子生物学 的解析研究の動向と進歩 : ムンプスウイル ス (<特集 : ウイルス病の制圧とワクチン>) 鶴留, 雅人; 菱山, 美智子; 山田, 章雄; 伊藤, 康彦 TSURUDOME, Masato; HISHIYAMA, Michiko; YAMADA, Akio; ITO, Yasuhiko 日本臨牀. 1987, 45(10), p. 74-78. http://hdl.handle.net/10076/13903 日本臨林第4 5巻・第 1 0号(昭和 6 2年 1 0月号)別冊 特集:ウイルス病の制圧とワクチン ムンプスウイノレス 人彦 雅康 留藤 鶴伊 菱山美智子 山田章雄 7 4( 2 2 7 4 ) [1 1]ヒト病原ウイルスの感染防御抗原 感染防御抗原とコード遺伝子 一分子生物学的解析研究の動向と進歩 1.ムンプスウイノレス 鶴留雅人本 菱山美智子村 山田章雄料 伊藤康彦牢 はじめに ムンプスウイルスはノ fラミクソウイノレス属に 属し，耳下腺炎や髄膜炎を主徴とする全身感染 との融合を指す)等の活性を示す. ウイノレスは， HN蛋白の HA活性を介して細胞の受容体に結 合する乙とにより，感染を開始する.その後， F 蛋白の膜融合活性によりエンベロープと細胞膜 症の病原体である. ウイノレスの外被(エンベロ との融合が起こり， ウイノレス核酸が細胞質内に ープ)には 2種類の糖蛋白が存在し，病原性発 、 性の機能について 侵入する. HN蛋白の N A活 J 現に重要な働きをしている.また，生体の特異 は，まだ十分には明らかでないが，受容体を破 的感染防御反応は，おもに乙れらの蛋自に対し 壊する作用がある乙とから，細胞からのウイル て向けられていると思われる. このウイノレスは， ス放出およびウイノレスの自己凝集の阻止に関与 比較的古くから研究の対象として扱われてきた すると考えられている. が ， f 也のノマラミクソウイ jレス，たとえばセンダ イウイルス等に比べると，分子生物学的な解析 2 . 蛋白のコード遺伝子と一次構造 ， H Nお ムンプスウイルスのゲノム RNAは は遅れているのが現状である.本稿では，両糖 よび F蛋白を含めて少なくとも 6種類の構造 蛋白について，今までに得られた知見を紹介し， 蛋白をコードしていると推定されるが，現在の これらの機能について考えてみたい. ・ 1.ウイルス糖蛋白 CHemagglutinin-Neura minidase;HN蛋白と Fusion;F蛋白) ところ，塩基配列の明らかになった領域はない. S e r v e rらのは， F蛋自に対するモノクロ一ナノレ 抗体を用いて F蛋白のアフィニティー精製を 行い， Flおよび F2サブユニットの N 末端の 1.一般的性状1) アミノ酸配列を決定した.図 12) I 乙示すように， HN蛋白は分子量 74 ， . _ ，8 0K で，赤血球凝集 Flサブ、ユニットの N 末端のアミノ酸配列を他 CHemagglutination;HA)活性およびノイラミ のパラミクソウイノレスのそれと比較すると，極 ニダーゼ CNeuraminidase;NA)活性を示す. F めて類似性の高いことがわかった.センダイウ 蛋白は分子量 65， . _ ，7 4K で，宿主細胞由来の蛋 イノレス等で=よく解析されているように， 乙の部 . _ ，6 1K)および F2 白分解酵素によって FlC58， 分は疎水性が強く， F蛋白の溶血活性や膜融合 C I 0 ， . _ ，1 6K)の両サブ、ユニットに解裂し，溶血， 活性の発現に重要な領域である.また， この疎 膜融合(本稿では，エンベロープと細胞膜との 水性領域は調べられたノずラミクソウイルスの F 融合を指す)あるいは細胞融合(細胞膜と細胞膜 蛋白の間でよく保存されており，乙れらのウイ *Masato TSURUDOME，Yasuhiko lTo :三重大学医学部・微生物学 本* Michiko HISHIYAMA，Akio YAMADA :国立予防衛生研究所・麻疹ウイルス 特集:ウイノレス病の制圧とワクチン 7 5( 2 2 7 5 ) 1 0 ムンフ。スウイルス 2 0 1 5 Phe-Ala-Gly-I le-Ala-lle-Gly-1Ie-Ala-Ala-L eu-Gly-Vaト Ala -Thr-Ala -Ala -G ln -Val-Thr- Val-Val Leu-Ala - 11 e - Ala-11 e- Gly-Val - センダイウイルス 1 Phe - Ala-Val 1 1e-11 e- センダイウイルス 2 Phe - Ala-Val Thr-Ile - - センダイウイルス 3 Phe - Ala-Val Thr-Ile - SV5 Ala NDV ← - - - Val Ala Val - Val Ala 1 1e Val Ala 1 1e Val - Ser - 1 1e Pro 図 1 ムンプスウイルスと他のパラミクソウイルスの F1サブユニットの N 末端のアミノ酸 S e r v e rら2) による) 配列の比較(←線部はすべてのウイノレスで一致している )( レスの存続にとって必要な領域であると考えら j イルス放出量は，親株に比べて格段に低下して れている. いた. 乙の変異株は， NA活性が強く細胞融合 3 . 蛋白の機能と病原性 活性のない親株とは異なり，細胞融合活性を示 センダイウイノレスやニューカッスル病ウイノレ した.なお，いずれの株も多段増殖をした. ス (NDV)の F蛋白は，その解裂と病原性ある 以上の知見から以下のことが考えられる. いは膜融合活性とが密接に関連しているが，ム 1 ) HN蛋白は， HA活性を介して細胞の受 ンプスウイノレスの F蛋白では，このような関連 容体に結合することにより， F蛋白による膜融 性は明らかで、ない.一方， Merzと Wolinsky3) 合に寄与するだけではなく， NA活性を介して によると， NA活性の弱いウイルス株ほど細胞 F蛋自による細胞融合を修飾(抑制)するものと 変性効果が強く，中枢神経ζ i対する病原性も強 思われる. い傾向があるという.乙乙で細胞変性効果とい 2 ) NA活性がなくてもウイルスの多段増殖 うのは，細胞融合(巨細胞形成)の乙とで，ウイ は十分に起こる乙とから，膜融合は細胞融合と ルス増殖の過程で合成された F蛋白による， は異なり， NA活性による修飾は受けないと思 細胞膜と細胞膜との融合を意味する.彼らの用 われる.この乙とは，膜融合と細胞融合の機構 いた株は，細胞融合活性の有無比関わらず多段 の相違を反映しているのかもしれない. 増殖し，また，いずれの株も F蛋白が解裂し 3 ) NA活性の低いウイノレス株は，一旦放出 ていることがその後発表された 4) 細胞融合活 されても細胞の受容体と再結合しやすいため放 性のない株に感染した細胞を蛋白分解酵素(キ 出量が少なく，その結果，蓄積したウイノレスに モトリプシン)処理して，特異的に HN蛋白を より細胞融合が起きやすくなるとも考えられる. のぞいてやると，細胞融合が起こる乙ともわか しかし， った 5) 興味深いことに，この処理では，細胞 らかでない.また，ウイルスが細胞外から作用 乙の放出と細胞融合との関連はまだ明 からのウイノレス放出量には変化が認められな して細胞融合を起乙す現象は，通常，濃縮した かった. Waxhamと Wolinsky6) は ， NAの阻 多量のウイ jレスが必要とされる極めて人工的な -deoxy-2， 3-dehydro-Na c e t yト 害剤である 2 ものであり，放出されたウイノレスが直接細胞に neuraminic a c i d(DANA)を用いて， NA活性 作用して細胞融合を起乙すことは考えにくい. のない変異株を選別することに成功した.乙の 今後の研究に期待されるところである. 変異株を，低温でトリ赤血球に結合させた後， 4 . モノクローナル抗体 (MAb)による解析 温度を上げてウイノレスを放出させたと乙ろ， ウ ムンプスウイノレスの HN蛋 白 や F蛋白に対 7 6( 2 2 7 6 ) 日本臨林 4 5巻 1 0号(10，1 9 8 7 ) 表 1 H N蛋白に対する MAbの抗体活性 ( U r v e1 l7lより改変) MAb No. 抗 アイソタイプ ELISA HI 体 価 a NI Nlb HLI 中和 つ 中 qJAτ ム ハ '''''''''''''' qJQU D 戸 A V ワ 中 A21 U つ 山 q J - b d せつムワ山 守d n0 庁 iQU 月 iATAV 円 i 司i 寸i UQUA 斗 ・ 1i QUAHUQU 唱I Q u q J A H V 巳dAHVAHV ハ HUAHVAHvqJ 12qL215qLFb2 ワ山つ ω 1 0 1 04 1 05 1 05 <5 <5 <5 <5 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <10 <10 <10 <10 <4 <4 <4 <4 IgG2a IgG1 1 05 1 05 <5 <5 <4 <4 <4 <4 2 8 0 1， 2 8 0 1， 1 6 1 6 IgG1 IgG2a IgG1 IgG1 IgG1 1 06 1 06 1 06 1 05 1 05 1， 2 8 0 2， 5 6 0 2， 5 6 0 1， 2 8 0 1， 2 8 0 2 5 6 2 5 6 2 5 6 1 2 8 1 2 8 く4 <4 2 5 6 6 4 1 2 8 1， 2 8 0 2， 5 6 0 5 6 0 2， 6 4 0 1， 2 8 0 5 1 2 0 2 4 1， 5 1 2 2 5 6 2 5 6 IgG1 IgG1 IgG2a 1 05 <5 <5 <5 6 4 1 6 6 4 3 2 1 6 6 4 3 2 0 3 2 0 6 4 0 6 4 3 2 1 2 8 、 っ qL25 IgM IgG2a IgG1 IgG1 4 5 10 A 1 05 ノイラミニダーゼ、の基質としてフェツインを用いた. ノイラミニダーゼ、の基質としてノイラミンラクトースを用いた. a b 表 2 F蛋白に対する MAbの抗体活性 ( O r v e1 l7lより改変) MAb No. 1， 1 0 3 2， 0 4 9 1 0 9 2， 2， 1 1 7 1 5 5 2， 1 5 9 2， 3 6 9 5， 4 1 4 5， 4 1 8 5， 4 3 9 5， 5 1 9 5， 5 2 5 5， 抗体価 アイソタイプ ELISA IgG1 IgG1 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG2a IgG2a IgG2a IgG2b IgG2a 5 1 0 1 04 1 04 1 04 1 05 5 10 1 05 1 06 1 06 1 05 1 05 106 HI Nla HLI <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 1 0 <1 0 <1 0 1 0 <1 0 <1 0 2 0 8 0 4 0 <1 0 <1 0 <1 0 中和 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 ノイラミニダーゼの基質としてフェツインを用いた. a する MAbに関しては，いくつかの報告がある 種類の抑制能の有無で，表 1のように 4つのグ が ， Orve1 l7)によるものが代表的なものであろ ループに分けられた.なお， ( 3 )のグループに ， ウイノレスの生物活性に う.彼の得た MAbの は基質の違いにより NIを示さない MAbが含 対する抑制能(抗体価で表した)を，表 17)およ 3 )のグ まれる. ウイノレス中和能は HIを示す ( び 表 27) に示す.なお， MAbの 量 は ELISA ノレープの MAbが最も強く， ウイノレスの HN蛋 で の 抗 体 価 で 表 し で あ る . HN蛋自に対する 白と細胞の受容体との結合を阻害する乙とが， MAbは ， HA活 性 の 抑 制 (H I ) ， NA活 性 の 抑 有効な中和に結び、ついていると思われる.これ )，これら 3 制 (Nl)および溶血活性の抑制 (HLl は HA活 性 を 持 つ ほ か の ウ イ ル ス の 場 合 と 同 特集:ウイルス病の制圧とワクチン 7 7( 2 2 7 7 ) 様である. HIを示さず NIのみを示す ( 4 )のグ HN蛋白の NA活性が細胞融合を抑制する乙と ループの MAb，また， HIも NIも示さない ( 2 ) のグループの MAbも中和能を示した.これら について述べたがi著者らは， MAbを用いて， HN蛋白と細胞融合に関する別の所見を得た 8) の MAbはウイノレスと細胞との結合を阻止でき すなわち単層細胞培養において，すべての細 ないと思われるが，いずれも比較的強い HLI 胞が感染する濃度でウイルスを吸着させ， を示すので，おそらく，結合後に起乙る膜融合 間後に培養上清中 KMAbを加えて，その後に (F蛋自による)に影響するために，ウイルスが 起こる細胞融合を抑制するかど、うかを調べてみ 細胞に侵入できないものと想像される. F蛋白 た.その結果， HN蛋自に対する 6つの MAb に対する MAbは，比較的弱い HLI以外には のうち， 3つが細胞融合の抑制 (FI)を示した. F I ウイルスに対する抑制能を示さなかった(表 2 ) . 著者らの得た MAbl乙関しても，以上と同様 の結果が得られている 8) ととろで，前項では， 6時 の強さと， HI， NIおよび中和の強さとには関 連が認められなかった. F Iが際だつて強い MAb は Orve1 l7)の ( 4 )のグループの MAbと似た'性 図 2 HN蛋自に対する MAbによるウイノレス感染拡大の抑制 (Tsurudomeら@による〉 a，b，c，:F1を示す MAb ，:F1を示さない MAb d，e，f 7 8( 2 2 7 8 ) 日本臨林 4 5巻 1 0号(10，1 9 8 7 ) 質を持ち，中等度の NIを示した.細胞融合が 始まってからでも，この MAbを加えることで 融合の進行は抑制された.なお， F蛋自に対す る 3つの MAbを得たが，いずれも FIを示さ なかった.次に，ウイルス感染の拡大に対する MAbの効果を調べてみた.実験は，細胞約 10 個当たり 1個のウイノレスが吸着する条件でおこ ない，ウイルス抗原の検出には直接蛍光抗体法 を用いた.図 28)に示すように， H N蛋白 ζ l対 する MAbのうち， FIを 示 す 3つの MAbを 添加する乙とにより，ウイルス抗原は，最初に 感染した細胞のみに封じ込められ，近傍の細胞 への感染拡大が抑えられる乙とがわかった. MAbを用いて得られた以上の知見からも， H N蛋白が細胞融合という現象に積極的な役割 を果たしている可能性は高いと考えられる. H N 蛋白は，細胞融合を抑制する N A活性以外に も，細胞融合に促進的に関与する未知の機能 (領域)を持っている可能性があり，特定の MAb がこの領域の近傍に結合することにより細胞融 合を抑制するのかもしれない. おわりに 以上のように，ムンプスウイノレスでは， F蛋 白が担っている細胞融合活性に対して， H N蛋 白が促進的にも抑制的にも関与していると思わ れる.他のパラミクソウイノレスでは， H N蛋白 が細胞融合を抑制するという例はない.センダ イウイノレスの H N蛋 白 が 膜 融 合 や 細 胞 融 合 の 発現に重要な機能を果たすという報告が一部の 研 究 グ ル ー プ に よ り な さ れ て は い る が9H1)， 一般ζ iパラミクソウイルスでは，細胞融合にお 1 2 8 4，1 9 8 5 . t al . :P u r i f i c a t i o n and 2 )8 e r v e r， A.C. e amino-terminal p r o t e i n sequence analys i so ft h e mumps v i r u sf u s i o np r o t e i n . 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