Kobe University Repository : Kernel Title 新生仔ラットの低酸素虚血負荷におけるHemo oxygenase-1蛋白mRNAの発現について Author(s) 田口, 和裕 Citation 神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe University, 60(1): 33-40 Issue date 1999-06 Resource Type Departmental Bulletin Paper / 紀要論文 Resource Version publisher URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00042528 Create Date: 2015-02-01 3 3 新生仔ラットの低酸素虚血負荷における Hemeo x y g e n a s e -1 蛋白及び mRNAの発現について 田口和裕 :神戸大学大学院医学研究科小児科学 (但当:中村 肇教授) 連絡先:干 7 3 70 8 1 1 司 呉市西中央 2-3-28 呉共済病院小児科 旧日和裕 TEL:0823-222 1 1 1 FAX:0823-2ト1 5 9 7 “ (平成 1 1年 1月初日受付) 要 約 寄は，依然として脳性麻癖，精神発達遅滞，てんかん 1，九周産期の低酸素性虚血性 などの主要原因である ; Hemeoxygenase (HO) はヘムを分解し1::::'リ 脳障害に対する適切な治癒法を考える上では.体の ベルジン，一酸化炭素，鉄を生成する反応を触媒する xygenase 防御機構の解明は不可欠である。 Heme o 酵素である。その l sozymeの一つである HO-1は ， (HO) はヘムを分解しピリベルジン，一酸化炭素， 通常の状態のラット脳では，限られた傾城の神経細胞 1こ は ， 鉄奇生成する反応を触媒する静素である [3，九日 0 にわずかに存在するのみである。しかし，様々な刺激 ラットとヒトにおいて，それぞ、れ 2つの l sozymeが により日 0 1発現は強力に賦活される。我々は，新生 存在し，別々の議伝子からつくられる [5， 6 ， 7 ， 九 1の 仔ラットの低酸素虚血モデルの脳告用いて日 0 はHO-l，構成型は HO-2と呼ばれ，中瓶神経系におい mRNAと掻自の発現壌を経時的に調べ， HO-l滋白 ては，神経細胞内に HO-2が広範に発現している O が結穀側の大脳皮質，海馬，視床の 色部，外包におい 方. HO-1は限られた神経系細胞に発現しているに過 て，低酸素虚血負荷後 3時間から 3 6時間で増加してい ぎないへしかし， HO-1発現は様々な刺激に反応し ることを明らかにした。大脳では. HO-1譲白は結設 て強力に賦活され， 10， ヘ w h e a t shock p r o t e i n3 2 側の潟馬を含む部分において，最も多く発現しており， (HSP3 2 ) はHO-1と同一物質であることが確認され 低酸素虚血負荷後 1 2時間で最高値に漉した。日 0 1m ている[lZ， ヘ HOの触媒作用で生成されるピリルピン RNA盈は負荷終了時には， に増加し始めており， は，細胞内の複雑な防御機構の中で抗駿化物質として 負荷終了後 3 し，以後減少した。 働くと考えられている[J九このことは，グルタチオン HOl 日0 1 mRNA発 “ し，新生仔ラットの低酸 デルは，成獣ラットの虚血モデルよりも， やアスコルピン酸などの， …般的な抗酸化物質が低い レベ jレにある新生児期の神経細胞にとっては重要なこ とかもしれない[ヘ低般索虚血による障害発生は，活 HO-1発現が早期に誘導されると考えられた。これら 性酸素の増加と関連している[ヘ HO-lの作用により の結果から， HO-1による防御機構は，発途途上にあ 生成される抗酸化物質は，脳を酸化陣脅から防製する る新生仔脳においても低酸素戯曲負荷後の早期の段階 のに容与していると考えられる。新生児期において で機能し，周産期の低酸素性虚血性脳障害の予防に寄 1mRNAとHO-l蛋白が低酸業虚刷によりどの 日0 していると推測された。 ように誘導されるかを明らかにすることは重要である。 今回，我々は新生仔ラットの低酸議虚血モデル[17，則を 緒 嘗 用いて HO-1 mRNAとHO-1蛋白の発現監を経時的 l こ検討した。 問産期に低酸素・虚血によって引き起こされる脳陣 xygenase， l HSP-32，低酸素虚血，新生仔ラット，脳障害 キーワード:Hemeo ( 3 3 ) 3 4 法 方 Macintosh) を利用してフィルム上の HO-1蛋白 ( 3 2 kDa) のバンドの濃度を定量した。 4:ノザンプロッティング 1 新生仔低酸素虚血モデルラットの作成 脳組織から，全 RNAを酸性グアニジン・チシアネー 日齢 7の S prague-Dawl e yラットをエーテルにて evineの変法に基づ‘いて，左総頚動脈を結 麻酔し， L ト・フェノー jレ・クロロホルム法 (AGPC法)を用 索後切断した:ヘ皮膚を縫合し，母親のもとに 3時間 2 0 J。全 RNA(30μg/レーン)を， 2M いて抽出した : 戻し十分に回復させた後に， 8%酸素， 92%窒素を満 ホルムアミドを含んだ1.0%アガロースゲルにて電気 2時間の 泳動した後にナイロンメンブレン (Hybond-N+) に たしたプラスチック製の密閉容器中に入れ 低酸素負荷をかけた。ラットの体温は電熱のパットに 2 1 Jをもとに， 転写した。 Shibaharaらの報告 [ 7 . 0Cから 3 7 . 5Cに保たれていた。低酸素負荷終 より 3 ら+1196までのヌクレオチドからなる， 了後， ラットは再び母親のもとに戻した。頚動脈結紫， cDNAをRT-PCRを用いて作製した。ラット αーチュ プリン cDNAフ。ロープを内部標準として使用した。 0 0 低酸素負荷のいずれをも行っていない日齢 7のラット 十3 6 6か ラット HO-1 を対照として用いた。 これらのプローブを， ランダムプライミング法を用い 2:免疫組織化学 α_32PJdCTPでラベルした。メンブレンをハイ て [ 低酸素負荷終了後，仔ラットをエーテルで麻酔した ブリダイゼーション溶液 (ExpressHyb;アメリカ 4 ， O.lM/Lリ ン 酸 緩 衝 液 後 に ， 左 心 耳 よ り pH7. Clontech社製)とともに 6 8C， 3 0分間プレハイブリ (PB) で調製した 4%パラホルムアルデヒド (PFA) 麦 ， DNAプローブとともに 6 8C， ダイゼーションした f 0 0 溶液を用いて潅流固定した。脳を取り出し， PFA固 1時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリ 定された脳を線条体，海馬前方，背側海馬，小脳のレ ダイゼーションを行なったメンブレンは，室温下にて ベルで、冠状に切断した。パラフィン包埋後に 6μm 2xSSC，0.05%SDS溶液で 1 0分間 2回 ， 5 0C 0 . 1x 0 SSC，O.l%SDS溶液で 2 0 分間 2回 洗 浄 し た 。 メ ン ブ の冠状切片を作成しへマトキシリン・エオジン (HE) 染色を行った。脱パラフィン処理を行なった レンから出る放射線を X線フィルム (RXU:フジフィ 切片は， 1 .5%のヤギ血清を含んだリン酸緩衝食塩水 ルム社製)に感光させ現像した。現像したフィルムは (PBS) に浸した後に， 2 0 0倍希釈したウサギ抗ラッ ウエスタンプロッティングと同じ方法で定量した。 トHO-1ポリクローナル抗体(カナダ， S t r e s sGen社 結 製)にて 4Cで一晩インキュベートした。引き続き， 0 果 アビジンービオチン化した h orseradishperoxidase 統計で 2 1 0匹の新生仔ラットの左総頚動脈を結葉し を用いて酵素組織化学法 ( Vector 社製)を行なった。 3:ウエスタンプロッティング 切断した。そのうち， 5 9匹を免疫組織化学に使用し， 5 1匹をウエスタンブロッティングに， 8 0匹をノザンブ ウエスタンプロッティングの試料としては，低酸素 負荷終了後，所定の時間に各々 3匹以上の仔ラットを ロッティングに使用した。低酸素負荷中，ラットの皮 8倍量の 膚色は蒼白となり，ほとんどのラットがけいれんして (0.02% Tris-HC1， 0.04% EDTA，1% いた。全体のうち 2 0匹のラット 00.5%) が低酸素負 用いた。断頭後に，脳を取り出して分割し 緩衝液 TritonX-100，1m M PMSF) で懸濁した後に， 1 2， 0 0 0回転で、 2 0 分間遠心した。各々の操作は 4Cにて 荷中に死亡した。 免疫組織化学では，低酸素虚血負荷後 3時間で 0 H 行なった。上清を 12.5%SDS/ポリアクリルアミドゲ e u r o p i lが結紫側の大脳度膚，海馬，視 0 1陽性の n ルを用いて電気泳動を行ない， 転写メンブレン 床の一部に多数認められた。さらに，外包を含む白質 CImmobilon-P) に電気的に転写した。メンブレンは の一部においても HO-1の免疫染色が結索側で優位に 4%スキムミルクを含む PBSに浸漬した後に， 1 0， 0 0 0倍 認められた。海馬の各領域間においては HO-1の免疫 に希釈したウサギ抗ラット HO-1ポリクローナル抗体で 反応性に違いは認められなかった。大脳皮質では， インキュベー卜した。数回洗浄した後に， h o r s e r a d i s h 0 1免疫染色により外包に近い第 V層から第 V I層にお p e r o x i d a s eを結合したヤギ抗ウサギ IgG抗 体 ( 5， 0 0 0 いてより強い免疫染色性が認められた。逆に，非結索 倍希釈)でインキュベートした。抗原抗体複合体は 側では弱い HO-1発現が頼粒状に見られたのみであっ ECL化学蛍光システム(アメリカ， Amersham 社製) 6時間でも，結葉側で た(図 1)。低酸素負荷終了後3 H リコンビナントラット HO-1蛋白 はHO-1の免疫反応性が依然として優位に認められた。 (SterssGen社製)を対照として用いた。コンビュー HE染色においても，萎縮した核とエオジン好性の過 ターによる画像解析システム (NIHimage1 .5 5f o r 染色性の細胞質を持つ細胞が多数見られた。 HO-lの を用いて可視化し， ( 3 4 ) 3 5 撞は既に増加していて，負荷終了後 3時間で最高値 免疫反応性は，必ずしも細胞陣警の程度と相関しなかっ O-1議白は 3 2 た。ウエスタンプロッティングでは， H (対照の 3 . 6 倍)に達した。その後，発現麗は次第に減 kDaの一本のバンドとして認識され，低酸素・虚血負 少したが，負荷終了後 2 4時間でも依然対照レベルの 2 荷により H O-1蛋自の発現誘導が認められた。 HO-1蛋 倍を示した(図 5A，5 B )0 HO-l議白と HO-1 mRN 自発現監は結主主側の海馬のほとんどを含む Aの発現の時間的経過は基本的に一致していた。小脳 No3の部分において最も多く認められた(図 2A)o 低酸素虚血負荷終了直後では， H O-1議白の発現議は 対照とほぼ同じであった。負荷終了後 1 2時間では， H 0 1議白発現議は，最高傭(対照レベルの 2 . 8 倍)に達 1蛋白の発現量はしだいに減少し， した。その後，日 0 負荷終了後 2 4時間では対照とほぼ同じレベルにまで減 少した(図 3A，3 B )。ノザンブロッティングでは日 0 1mRNAは ， 1 .8 k bのバンドとして認識された。 皮質では低酸素虚血負荷後だけでなく負荷前でも H ラット αーチュプリン cDNAプロープを内閣性の定 されることがポされた口成獣ラットの虚血モデルでは， O-1 mRNAの発現震は H 麗的対照として用いた。 H 2 0分間の一過性前脳虚血により新皮質，海馬，視床に O 1 mRNAの おける神経細胞とグリア様細胞内の H 発現は幸子明に増加すると報告されている。日 0 1m 0 1蛋白と HO-lmRNAの発現議は多かった(デー タは示さず)。 考 察 この研究により，新生仔ラットの低酸素虚血モデル において，急速に H O-1 mRNAとHO-1資自が誘導 0 1蛍白と同様に No3の部分において最も多かった ( 図4 )。低酸素鹿血負荷終了直後に，日0 1 mRNA 図 1;低酸索負荷終了後 1 2時間のラットの脳の HO-1蛋自の分布を示す。方法に記載した通りに海馬前万背側のレ ベルでの冠状断切片を作成し免疫組織化学を行なった。結穀側の大脳皮質，海馬，視床の一部において， H 0 1陽性の n e u r o p i lが優位に認められる。 さらに，結主主側の外包の部分においても日 0 1の免疫染色性は優 位であった。非結紫側では弱い H O-1発現が頼粒状に認められた。 A . 非結殺側の大脳皮質の弱拡大像。 日結紫側の大脳皮質の弱拡大像。 C . 非結設側の大脳皮質の強 D . 結殺側の大脳皮質の強拡大像。 拡大像。 スケールは AとBは500μm，CとDは50μmを示す。 ( 3 5 ) 3 6 4 'J 宅 ，a e 司制調﹄ • l i g a 凶o n h y p o x i a r ncontrol 。 ob 6h 1 2 h 2 4 h 4 8 b ・ 7dI y s A f t e rHI 図 3A ;HO-1蛋白発現の時間的経過を示す。仔ラッ トの左頚動脈を結葉した後に，低酸素 (8% 酸素， 92% 窒素)負荷をかけた。低酸素負荷 図 2A; 日齢 7のラットに低酸素虚血負荷を加え，低 2時間のラットの脳における 酸素負荷終了後 1 終了後 o 時間 HO-1蛋白の発現をウエスタンプロッティン 4 8時間 7日に脳を取り出し，大脳組織全体 グにて検討した。大脳全体を，図 2Bのよう を 6つの部分に切り分けた。 N03の部分を， に 6つの部分に切り分けた。これらの大脳組 等量の蛋白試料 (80μg) に調製し， それを 織 (N0 1' "N0 6 ) と小脳皮質 (N07) を，等 SDS-PAGEとウサギ抗ラット HO-1抗体を 量の蛋白試料 (80μg) に調製し，それを S 用いて分析した。リコンビナントラット HO- 6時間， 1 2時間， 2 4時間， DS-PAGEとウサギ抗ラット HO-1抗体を用 1 蛋白を数量的対照として用いた。低酸素虚 いて分析した。 Lane1，3 ，5;結紫側 (No1， 血負荷を加えない対照仔ラットについても同 3，5 ) 0 Lane2，4，6;非結紫側 (N02，4，6 )。 様に検討した。 rHO-1p r o t .;リコンビナン Lane7;小脳皮質。同じ実験を 3回行ない同 トラット HO-1蛋白。 様の結果を得た。 B;棒グラフは，同じ実験を 3回行い，コンピュー B;大脳組織全体を，図のように 6つの部分に切 ターを用いた画像解析システムにて数量化し 1' "N0 6 ) り分けた。これらの大脳組織 (N0 たデータを示したものである。数量化したデー と小脳皮質 (N07) をウエスタンブ、ロッティ タを日齢 7の対照との比率で示した。 ングとノザンブロッティングに使用した。 HI;低酸素虚血負荷。 RNAの量は閉塞部位の再開通後 ロ 1 2時閣で最高値に達 しい，以後減少する.Q[臼ω22 側の大脳皮質，海馬，線条体において， HO-1発現は 血により大脳皮質，海馬の神経細胞とアストロサイト 2時間から 2 4時間で誘導され， 低酸素虚血負荷終了後 1 の両方において HO-1蛋白が著明に誘導され HO-1蛋白 負荷終了後 7日まで持続すると報告している凶。この 2時間で最高値に達し，以 の量は閉塞部位の再開通後 1 ・1 蛋白の時間的経過をウ 違いは， Bergeronらが HO らは，我々と同じ新生仔モデルを用いた実験で，結紫 ヘ 後減少する [23J。今回の新生仔ラット低酸素虚血モデル エスタンプロッティングで示さずに，免疫組織化学の に お い て も ， 低 酸 素 虚 血 負 荷 終 了 後 3時 間 で 結果より HO-1発現が低酸素虚血負荷終了後 7日まで HO-1 mRNA量は最高値を示し，負荷終了後 1 2時間 持続していると結論づけたためと考えられる。我々の でHO-1蛋白量の最高値を示した。一方， Bergeron 実験では，低酸素虚血負荷終了直後でも HO-1 mRN ( 3 6 ) 3 7 図 4 日齢 7のラットに低酸素虚血負荷を加え，低酸 素負荷終了後 3時 間 の ラ ッ ト の 脳 に お け る HO-1 mRNAの発現をノザンプロッティング 6つの 4 ' a 8E . ， ・ にて調べた。大脳全体を，図 2Bの様に 部分に切り分けた。これらの大脳組織 (No1-- No6) と小脳皮質 (No7)を本文に記載してい - 均a t l 岨・h ypo 由 図偶凪旬』 るように，等量の全 RNA試 料 (30μg) に調 。 製し，それをラット HO-1 cDNAプロープを ob 3b 6b Ub 1 4 b A f t e rHI 用いたノザンハイブリダイゼーションにて分析 した。ラット αーチュプリン cDNAプロープ 図 5A ;HO-1mRNA 発現の時間的経過を示す。仔 を内因性対照として用いた。 Lane1，3 ，5;結 ラットの左頚動脈を結葉した後に，低酸素 紫側 (No1，3，5 )0 Lane2，4，6:非結紫側 (8%酸素， 92%窒素)負荷をかけた。低酸 素負荷終了後， 0時間， 3時間， 6時間， 1 2 時間， 2 4時間に脳を取り出し，大脳組織全体 を 6つの部分に切り分けた。 No3の部分を等 (No2，4 ，6 ) 0 Lane7;小脳皮質 o 同じ実験を 5回行い同様の結果を得た。 A量は増加していて，日 0 1mRNAの誘導は 2時間 量の全 RNA試 料 (30μg) に調製し，それ の低酸素負荷中に既に始まっていることが示唆された。 を，ラット HO-1 cDNAプロープを用いた 新生仔ラット低酸素虚血モデルでは， HO-1蛋白発現 ノザンハイブリダイゼーションにて分析した。 が転写的に調節されていて，成獣ラット虚血モデルに ラット αーチュプリン cDNAプロープを内 比して早期に HO-1蛋白が誘導されることが，今回の 因性対照として用いた。低酸素虚血負荷を加 研究から明らかとなった。 えない仔ラットについても同様に検討した。 B 棒グラフは，同じ実験を 3回行い，コンピュー 最近の研究により， HO-1 mRNAとHO-1蛋白が Alzheimer 病患者の大脳皮質，脳血管で増加してい ターを用いた画像解析システムにて数量化し ることが明らかとなった [25，26)。成獣ラットの一過性の たデータを示したものである。数量化したデー e r i f o c a l are 全脳虚血モデルでは，閉塞側の海 馬の p タを日齢 7の対照との比率で示した。 d HI;低酸素虚血負荷。 aのアストロサイトとミクログリアで HO-1発現が誘 導される [27)が，今回の結果では HO-1の免疫反応性と 細胞障害の聞の関連は明らかとはならなかった。これ とが，今回の研究により明らかとなった(データは示 までの本モデルを使用した研究 [17，18)でも指摘されてき さず)。この免疫反応性は，結葉側と非結費量側の両方 たが，今回使用した新生仔ラット低酸素虚血モデルで で認められた。今回使用したラットモデルでは椎骨動 は，神経細胞の障害の範囲に個体差が認められ，細胞 脈は結葉しなかったことより，小脳皮質では， HO-1 障害と HO-1発現との関連性を確認することは難しい 発現は常に起こっていて，低酸素虚血負荷によって誘 と考えられた。 導されたものではないと推測された。 発達に伴う HO-1蛋白発現量の変化については，仔 小脳皮質では，低酸素虚血負荷後だけでなく負荷前 でも HO-1mRNAとHO-1蛋白の発現量は多く， Pur ラット脳のグリア様細胞，神経細胞，内皮細胞で， k i n j e * 田胞において HO-1蛋白が優位に発現しているこ 円0 1蛋白が発現し，生後 7日目で発現量は最大値を ( 3 7 ) 3 8 Chem.2 6 3:3 3 4 8 3 3 5 3，1 9 8 8 . [ 6J McCoubrey，W. K. J r .， Ewing，J .F .， Maines，M.D . : Humanhemeoxygenase2 c h a r a c t e r i z a t i o nande x p r e s s i o no fa f u l l l e n g t hcDNAande v i d e n c es u g g e s t i n g t h a tt h etwoHO-2t r a n s c r i p t smayd i f f e r by c h o i c e o f polyadenylation s i g n al . とると報告されている。一方，成獣ラット脳において は，通常の状態では非常に低いレベルでしか HO-1は 発現していないことが明らかとなっている [28]。今回の 結果では，非結紫側で認められた弱い HO-1の免疫反 応性は，生後 7日目で構成的に発現している HO-1に よるものと考えられる。ウエスタンプロッティングで， HO-1発現量が結紫側と非結紫側で違いがあることか Arch. Biochem. B i o p h y s . 2 9 5 ら，低酸素虚血負荷で，結紫側に HO-1蛋白が優位に 1 9 9 2 . [ 7J Shibahara，S .，Yoshizawa，M.，Suzuki， 誘導されたと推測された。 HO-1誘導の生物学的意義については，依然議論さ H.，Takeda，K.，Meguro，K.，Endo，K . : F u n c t i o n a la n a l y s i so f cDNAs f o r two t y p e so f human heme oxygenase and e v i d e n c ef o rt h e i rs e p a r a t er e g u l a t i o n .J . Biochem.(Tokyo) 1 1 3:2 1 4 2 1 8，1 9 9 3 . [8J Sun，Y.，Rotenberg，M.0 .，Maines，M.D . : Developmental e x p r e s s i o n o f heme oxygenase isozymes i nr a tb r a i n . Two HO-2mRNAa r ed e t e c t e d .J .Biol .Chem. れる余地が残されている。これまでも述べてきたよう に ， ビリルピンは酸化ストレスに対する防御機構とし て働いている可能性が強い。シナプス網が未だ完全に 形成していない新生児期では，低酸素虚血負荷で誘導 された HO-1が，様々な酸化ストレスに対する防禦に 貢献していると推測された。 これらの結果から， HO-1の酸化ストレスに対する 防御機構は，脆弱な周産期の脳においても低酸素虚血 負荷後の早期の段階から機能しており，脳障害予防に 9 9 0 . 2 6 5:8 2 1 2 8 2 1 7，1 [9J Ewing，J .F .，Weber， C . M.， Maines， 寄与している可能性が示唆された。 謝 辞 M.D.: B i l i v e r d i n r e d u c t a s e i s h e a t r e s i s t a n tandc o e x p r e s s e dw i t hc o n s t i t u t i v e andh e a ts h o c kformso fheme oxygenase この研究は文部省科学研究助成(第0 9 4 7 0 2 4 1号)の i nb r a i n .J . Neurochem. 6 1 1 0 1 5 1 0 2 3， 1 9 9 3 . 援助を受けたものである。 文 1 3 2 0， 口O J Maines，M.D . : Newdevelopmentsi nt h e 献 [ 1J Larroche， J . C . : Development o f t h e c e n t r a l nervous system，Developmental pathology o ft h e n e o n a t e， c h a p . 1 9， Excerpta Media， Amsterdam-London NewYork，p 3 5 5 4 4 5，1 9 7 7 . r e g u l a t i o n o f heme metabolism and t h e i ri m p l i c a t i o n s .C r i t .R e v .Toxicol .1 2:2 9 1 3 1 4，1 9 8 4 . [ l 1J Maines，M.D . : Heme oxygenase: f u n c t i o n，m u l t i p l i c i t y，r e g u l a t o r y mechanisms， andc l i n i c a la p p l i c a t i o n s . FASEBJ . 2: . J . : Neurologyo ft h e newborn， [2J Volpe，J Sanders，P h i l a d e l p h i a，p 2 0 9 2 3 5，1 9 8 7 . 口2 J Keyse，S .，T y r e l l，R.M.:Hemeoxygenase 也 9 8 8 . 2 5 5 72 5 6 8，1 .，Schmid，R . : [3J Tenhunen，R.，Marver，H.S The enzymatic c o n v e r s i o no f heme t o i s t h e major 32-KDa s t r e s s p r o t e i n b i l i r u b i nbymicrosomalheme o x y g e n a s e . e r o x i d e and UVAr a d i a t i o n，hydrogen p .Acad.S c i .USA.6 1:7 4 8 7 5 5， P r o c .Natl 1 9 6 8 . . 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Thought h eHO-l i s o z y m ei sl o c a l i z e di ns e l e c t e d h ee x p r e s s i o n n e u r o np o p u l a t i o n sande x p r e s s e da tab a s a ll e v e li nt h enormalr o d e n tb r a i n，t o fHO-1 i ss t r o n g l ya c t i v a t e dr e s p o n s et ov a r i o u ss t u m u l i . We i n v e s t i g a t e dt h eq u a n t i t a t i v e c h a n g e si nHO-1 mRNAandp r o t e i no v e rt i m ei n ar a t model o fp e r i n a t a lh y p o x i c i s h e m i c )b r a i n damage and f o u n di n c r e a s e d HO-1 p r o t e i nl e v e l si nt h ei p s i l a t e r a ls i d eo ft h e (HI c e r e b r a lc o r t e x，t h ehippocampus， ap a r to ft h ethalamusandt h ee x t e r n a lc a p s u l e from 3 3 6 t h e amount o f HO-1 p r o t e i n was t h eh i g h e s t on t h e h r sa f t e r HI i n s u l t .I nt h ec e r e b r u m， l i g a t e ds i d ei nt h ep a r tt h a tc o n t a i n e dmosto ft h eh i p p o c a m p u s .Theamounto fHO-1p r o t e i n i n c r e a s e dt o a maximum a t1 2h r sf o l l o w i n g HI i n s u l t . The l e v e lo f HO-l mRNA was r e a c h e d a maximum a t 3h r sf o l l o w i n g HI i n s u l t and t h e n i n c r e a s e d by t h ee n do f HI， d e c r e a s e d .Thet i m ec o u r s eo ft h eHO-1p r o t e i ni n d u c t i o nwase s s e n t i a l l yc o n s i s t e n tw i t ht h a t o fHO-lmRNA.I nt h enewbornh y p o x i c i s c h e m i cr a tmodel，HO-le x p r e s s i o ni si n d u c e da tan e a r l i e rs t a g ecomparedt ot h a ti nt h ea d u l ti s c h e m i cr a tmodel .T h e s ed a t as u g g e s tt h a tt h e HO-l d e f e n s emechanism a g a i n s to x i d a t i v es t r e s sb e g i n st o work a tt h ee a r l ys t a g e so f HI h i smechanismmayc o n t r i b u t et op r o t e c ta g a i n s t i n s u l ti nt h ev u l n e r a b l ep e r i n a t a lb r a i n，andt b r a i n damage r e s u l t i n g from a c o m b i n a t i o no fh y p o x i a and i s c h e m i ad u r i n gt h ep e r i n a t a l p e r i o d . ( 4 0 )
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