原
著
各種エリスロポエチン誘導体による血管新生作用の
比較とその機序の解析
柳
川
貴
央
新潟大学大学院医歯学総合研究科
循環 器学分野
(
主任 :相溜義房教授 )
Biological Analysis of the Angiogenic Effect of Erythropoietin Derivatives
Takao YANAGAWA
Di
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【目的】エ リス ロポエチ ン (
EPO)の ホモ受容体 (
EPOR/EPOR)は主 に赤血球系細胞 に発現
し造 血 に重要 な役割 を果 た してい る.:j
j
J,造 血以外 の脳 ･肝 ･腎 では EPOのヘ テ ロ受容 体
(
EPOR/CD1
31
) が発現 し,EPO反応性 に組織保護作 用 を示す ことが報告 された.EPOの誘導
AEPO) と リシン残 基側鎖 をカル
体 と して糖鎖 に シアル酸 を欠 く自然物 で あるア シア ロ EPO (
バ ミル化 した人工物 で ある カルバ ミル EPO (
CEPO)が存在す る.EPO お よび AEPO はホモお
よびへ テロ受容 体 に親和性 を持つ が,AEPO は肝の ア シア ロ糖 タンパ ク受容体 で速 やかに代謝
nvi
voでの造 血能 を欠 く.CEPO はホモ受容体 との親和性 がないため造 血能 を欠 く.
され るため i
I
nvi
t
r
oにおいて r
hEPO に弱 い血管新生作用 を認め,虚 血 に弱 い I
CRマ ウスを用いた下肢虚 血
モデルで は r
hEPO よ り r
h
AEPO の方 がは るかに強 い下肢生 存効 果 を示 した こと,またモ ノク
hEPO のみ が eNOS IBCL-XL誘導
ロタ リン投与 によるラ ッ トの肺血管 内皮障害 モデルでは r
僅用 を介 して内皮障害抑制作用 を示 した ことか ら,血管 内皮 は赤血球系細胞 と同様 に EPO ホモ
受容体 を発現 してい ることがわかった,そ こで AEPO が もつ強 い血管新生作用の機序 を明 らか
にす る目的で,マ ウスの F肢虚血 モデル に対す る 3樺 の EPO誘導体の作用 を調べ た.
7
/BLマ ウスの左大腿動脈起始部 を結歎 して下肢虚 血モデル を作
【
方法 と結果】雄 8週齢の C5
'
1g
/kgの各種 EPO 誘導体 を投与 し,虚
成 した.虚血作成 当 日か ら 7日間連 日,虚血筋肉内 に 2,
血作成 の 7日後に レ-ザ - ドップ ラ-法 による血流 の 改善効果,筋 肉組織標本での新生血管数
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別刷請求先 :〒9
5巨 8
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0 新潟市 中央区旭町適 1-7
5
4
新潟大学医学部第 内科学教室
-
柳 川黄 塵
柳川 :各穫エリスロポエチン誘導体による血管新生作用の比較とその機序の解析
51
5
の計測,血中ヘモグロビン濃度および筋肉内での mRNA発現の定量 を行 った.造血 は r
hEPO
投与のみで観察 された.血流回復 および血管新生の効果 は r
l
l
AEPO >r
hEPO- r
hCEPO >
c
ont
r
o
lで あった.各種の血管関連遺伝子 mRNAの うち,治療効果 と一致 したのは I
L-6の
mRNA発現量のみであり,e
NOSの発現は AEPO および CEPO投与により抑制 された.
【
結論】EPO誘導体の血管新生作用は血管内皮に対する直接作用ではなく,線維芽細胞に対す
L-6等の産生促進作用を介 した間接効果であることが推測 された.
るI
キーワー ド :エ リスロポエチン,アシアロエ リスロボエチン,カルバ ミルエ リスロポエチン,血
管新生作用
は じめ に
の 中間産物 と して も体内に存在 し,一定の役割 を
担 ってい ることが推測 され る.AEPO は肝の ガラ
本邦 を含む先進諸国では心 ･脳 などの血管障害
ク ト-ス受容体 による代謝 を受 け,また一部 は尿
が死肉の過半数 を占めてい る.これ まで閉塞性動
nv
i
v
oでの造血活性 は きわ
中に排潤 され るため,i
As°) などの重症慢性下肢虚血患 者に
脈硬化症 (
めて弱 い,実際 ,EPO の クロ-ニ ングには重症再
対 して,血管新生療法 が行われて きた.その 手段
生不 良性 貧血患 者の尿 由来精製 EPO が用い られ
HGFな どを用いたサ イ トカイン治
と して VEGF,
BMI
)などによる細胞治
療 と骨髄単核細胞移植 (
た が, この 標 品 は i
nv
iv
oで の 造 血 活 性 を欠 く
AEPO で あることが後 に明 らか となった.
療の 2つがある 1)2).BMIによる血管新生の機序
もう一つの EPO 誘導体で あるカルバ ミル EPO
は不明であったが,移植細胞 中に含 まれ る赤芽球
(
CEPO) は,EPO の リシ ン残 基 を カルバ ミル化
と骨髄 マクロプア-ジとの 協調作用 によって,管
31へ テ ロ 2量 体
した人工物 で あ り,EPOR/CD1
髄 内で恒常的にみ られ る骨髄 内血管新生 と同様の
の発 見 に責献 した 6). cEPO で は EPO の高親 和
もので あることが明 らか となった 3)射 .これ ら-
性 結 合 サ イ トと EPOR との結 合角度 にずれ が生
達の研究のなかで,EPO それ 自体 に も弱 い血管新
じるため,EPOR/EPORホモ 2量体 との結合能 を
生作 用があることを兄いだ した.しか し,マ ウス
欠 きヘテロ 2量体 とのみ親和 性を有す ると推測 さ
下肢虚 血 モデル に対す る EPO単独投 与 では,毛
れる 7
)
.
細 血管数の増加が認め られ るものの細動脈の発達
下肢の生存曲線 を観察す る目的で虚血 に弱 い自
を伴 わないため新生毛細血管 はやがて萎縮 し,i
n
vt
i
r
oの血管新生 で も EPO による毛細血管様構 造
マ ウスを用 いて治 療 モデル実験 を行 った ところ,
r
hEPO投与の効果 が低 いのに対 し,r
hAEPO 投与
形成能 はきわめて微弱であることが判明 した 4).
では新生血管数の増加 ･下 肢 血流の改善およびそ
シアル酸 はカルボキ シル基 をもつ酸性 単糖類で
の結果 と しての下 肢 脱 落 の抑 制 効 果 が認 め られ
あ り,ガラク ト-スは分 子表面 に分布す る水素原
た8
)
.この作用 は,同種 マ ウスか ら採取 した骨髄
子 が極性 によ り陽性 に荷電 す る中性 単糖類 で あ
細胞 の筋 肉 内投与 (
BMI
) よ りも強 力で あった.
る.ヒ トの腎臓か ら分泌 され る EPO は 3つの N型糖鎖 と 1つの 0型糖鎖 を もつ 1
6
5ア ミノ酸残
また,AEPO 投与では造血の克進 が観察 されなか
った.
基か らなる糖 タンパ クで あ り,貧血 ･低酸素応答
次 に AEPO に よる血管 新生 の メカニズ ムを推
性 に腎臓か ら血 中へ放 出 され る EPO の糖鎖 は末
測す る目的で,モ ノクロタ リン誘発 によるラッ ト
端 がすべて シアル酸 で終止 してい るため体内では
の肺血管内皮障害 モデル を用いて,EPO と AEPO
強 く陰性 に荷電す る 5).シアル酸 は体内で徐 々に
の効果 を比較 した 9).r
h
AEPO の持続静脈 内投与
脱 落 して ア シア ロ体 (ア シア ロ EPO :AEPO)
hEPO の 1
/1
0程度 であ り,追
では,血 中濃度 は r
とな り,糖鎖末端 にガ ラタ ト-スが露 出 して正 に
血作 用 は r
hEPO のみ に見 られ た.肺 高血圧 の原
荷 電 す る.AEPO は また同時 に EPO の糖鎖成 熟
因 となる血管内皮障害 による小動脈の壁肥厚 に対
5
1
6
新潟 医学会雑誌
第1
2
3巻
第1
0号
平成 2
1年 (
2
0
0
9
)l
o員
す る改善効果 は r
hEPO投与群 で有意 に観察 され,
hEPO と r
餌l
EPOの比較時の溶媒投
前回行 った r
肺組織 の 内皮 に由来 す る PECA -1お よび抗 ア
与群 と同様 で あることを確認 し,各 種 EPO誘導
ポ ト- シス分子である BCL-ⅩLの mRNAの 上界
体の効果の比較検討 を行 った.
M
がr
hEPO投 与群 での み観察 され た.また eNOS
および ET一旦の誘導作用は EPO >AEPO であっ
た9
)
,
C5
71
i
l
Jマウスを用いた下肢虚血の治療モデル
チ ャール ズ リバ ー (
Yokoha
ma,
J
a
pa
n) よ り雄
hCEPO の肺血管 内皮障害 に対す る効
そ こで,r
果 を同 じモデル を用 い,血管 内皮 にお け る EPO
8適齢 の C57
/BLマ ウス (
20-25g) を購 入 し実
験 に用 い た.す べ ての実験 手順 は Gui
def
o
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受容体の発現様式 を検討 した,また,血管 新生 に
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対す る EPO 誘導体の作用 を詳細 に検 討す る目的
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7
/BLマ ウスの下肢虚血 に対 す る治療実験
で,C5
Be
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da
,
MI
)) に基づ き無菌的に行われた.マウ
を用 いて,分子生物学的解析 を含めた詳細 な解析
ス をケ タ ミン (
6
0mg/
kgBW) お よび キ シ ラジ
を行 った.
6mg/
kgBW)の腹腔内投与 によ り麻酔 した,
ン (
王
s
ne
rの方法 に準 じ左下肢の中間部 に皮膚 切開 を
方
法
加 え,血管 を露出 した 11).大腿動脈起始部 を結梨
ののちその末梢の伏在動脈 を結熱 し,その他の側
各種 EPO誘導体の造血細胞 に対 する活性の検討
EPO依存性赤白血病細胞株 AS-E2 (
中外製薬
よ り供 与 ) を剛 ､た
1
0).細 胞株
は1
0mg/
mlの
rhEPO の 存 在 下 に 20% FBS (I
nv由 o監en,
枝 を剥 離 して本 管 とと もに切除 した.虚 血後 の
Da
yOか ら Da
y6までの連続 した 7日間に 2/
!
jg/
hEPO または r
hAEPO または r
hCEPO
kgBW の r
2mlに した もの を虚血下肢筋肉
を溶 媒 で希釈 し 0,
Ca
r
l
s
ba
d,CA)添加 I
MDM (
I
nv
it
r
oge
n) で維 持
培養 を行 った.培養細胞 を溶媒で十分 に洗浄 した
内に授与 した.EPO誘導体 を含 まない溶媒 0
.
2
ml
を授与 した群 をコン トロ-ル とした
04c
e
l
l
s
/
miに調整 し,各濃 度 の EPO
の ち,2× 1
TB
吏虚血作成 7日後 に下肢血流測定 を目的に レ
誘導体 を添加 し 4日間の培養のの ちに細胞数 を測
r
LDI(
Moorl
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,
ーザ - ドップ ラー moo
定 した.
Wi
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mi
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e) を用 いて イメージを取 り
込み,その後
ラ ッ ト肺血管内皮障害の治療モデル
s
t
e
rラッ ト
既報 の方法 によ り 6-7適齢 の雄 Wi
屠
殺 して大腿二頭筋 を摘 出 し,その
-部 をホルマ リン固定 して組織染色 に用い,大腿
二頭筋の残 りか ら RNA を抽出 して mRNA定量 に
を用いたモ ノクロタ リン誘発による肺 血管内皮障
用いた.レ-ザ- ドップラ-で取 り込 まれたデ-
害 モデル を作成 した 9).前回は 2
.
S′
ug/
kg/da
yの
r
hEPO または r
h
AEPO または同 じ用量 の溶媒 を
or
LDⅠ解 析 ソ フ トに よ っ て両 側 下 肢
タ は,mo
左 内径 静 脈 か ら持続 静脈 内投 与 したが,今 回 は
2.
5,
ug/
kg/da
yの r
hCEPO または同 じ用量の溶媒
を左内径静脈か ら持続静脈内投与 した.EPO誘導
体 の投 与 はモ ノクロ タ リンの皮下注射後 か ら 21
日間行 った.r
hCEPO は r
hEPO お よび r
h曳EPO
Fl
uxを測定 し,虚 血作成 した左 下肢 Fl
u
xの健側
右下肢 Fl
uxに対 す る比 を虚血下肢 血流の代表値
として用いた.
標本の作製 ･染色 および画像解析
ホルマ リン固産後パ ラフィンに包埋 した標本か
と同様 に中外製薬 か ら供与 された.21日間の投与
ら厚 さ 6mm の連続切片 を作成 し,スライ ドグラ
複 ,両 心 カテーテル法 に よ り血行動態 を測 定 し,
ス上 に貼付 ･風乾 し保存 した.キ シレン ･無水 ア
屠 殺の後 に肺 の一部 を固定 して組織 標本 を作 製
ル コ-ル ･純 アル コ- ル を用いて脱 パ ラフ ィン化
し,組織学 的 に検討 した.また,一 部の肺 を用い
21℃
し,クエ ン酸緩衝液 に標本 を浸 した状態で 1
NAを定量 した.溶媒投与群 の各 デ - タが,
て mR
1
5分間のオ ー トク レーブ処理 をす ることで抗原
柳 川 :各種 エ uスロボエテ ン誘導体 による血管新生作糊の比較 とその機序の解析
5
1
7
の賦 活 化 を行 った 内因性 ペル オキ シダーゼ を阻
び ヒ ト正 常 細 胞 の mRNA発 現 豊 を既 報 の とお り
CD31
)
害 したの ち ウサ ギ抗 マ ウ ス PECAM -i(
ポ リク ロー ナル抗 体 (
Sa
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aCr
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eRT -PCR (
Q好r-PCR)汰
を用 いて定 義 した 12).表 1に QRT-PCRに用 い
Sa
nt
aCnl
Z,
CA) と反 応 させ ,ビオ チ ン標 識 ヤ ギ
た プ ライマ -配列 を示 す.動物 組轟摘 ゝら得 られ た
抗 ウサ ギ二次抗体 お よびベル オキ シダ-ゼ標識 ス
標本 で は実験 お よび測定条件 に よる誤 差 を緩 和す
トレプ トア ビジ ンと反 応 させ た後 ,DAB を用 い
L
SAB2キ ッ ト/HRP (
DAB),Da
n,
k
て発 色 した (
る 目的 で,各 mRNA コ ピ-数 の γーa
e
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d)の コ ピ-数 に対 す る比 を もって代
Gl
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up,De
nma
r
k)
.後 染 色 にマ イヤ - ･ヘ マ ト
表値 と した.ヒ ト純化正常細胞 で は,各 mRNA コ
キ シ リ ン液 を用 い た .顕 微 鏡 は 01
ympusBX6
0
/
F
lg総 RNA) を代 表 値 と した.QRTど -数 (
(
Ol
ympus
,
Tokyo,
J
a
pa
n) を用 いて 1
0
0倍で観 察
PCRに は Li
ght
Cyc
l
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r(Roc
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ndi
a
na
pol
i
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,王
N)
し,01
ympusT
Vシ ステ ム DP5
0を用 い て デ ジ タ
を用 い ,9
5℃ 1
0秒 ,6
2℃ 1
0秒 ,72℃ 1
3秒 を 1
ル 画 像 を作 成 した .筋 組 織 2
.
4mm2か ら 1
,
5
5
0
サ イクル と し計 3
5サ イクル施行 した.
pi
xel
/mm で RGB画 像 を 作 成 し, Ma
cSCOPE
(
Mi
t
a
ni
,Ft
i
kui
,
J
a
pa
n) を用 い,CD31陽性の血管
統計
内皮 の画像 か ら血管の総 数 を測定 した.同 じ画像
各群 の測 定値 は me
a
n± SD で嚢 記 し,多群 間
か ら筋 線維 数 も計 測 し,血 管総 数 /筋 線 維 数 を血
の比 較 (
ANOVA) は Fi
s
her法 に よ り差 の検 定 を
管数 の代表値 と した.
行 い,p<0.
0
5を もって有意 と した.
採血 サ ンプルの測定
結
果
採血サ ンプルの一部 を EDTA加採 血管 に分取 し,
自動 血 球 カウ ン ター :S
ys
r
ne
xF-8
20 (
S
ys
me
x,
Ro
be,J
a
pa
n) を用 いて血 算 を行 った.残 りの 血
ラ ッ ト肺血管内皮 障害 に対 す る効果
健 常 ラ ッ ト,モ ノク ロ タ リン誘 発 に よ る実験 的
液 は ガ ラス採血管 に採取 し,血清 を分離 したの ち,
肺 高血圧 に溶 媒 の み ･r
hEPO ･r
hAEPO また は
EL王
SA法 に よ っ て EPO を測 定 した .測 定 に は
r
hCEPO を授 与 した群 で の 造 血 効 果 を 図 1に示
Qua
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豆
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tEPOI
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R&D
す .r
hEPO投 与 でのみ血 中 Hb値 お よび 牌重 量 の
s
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ms
,Mi
nne
a
po
l
i
s
,US
A) を用 い た.EPO測 定
増 加 を認 め た.血清 中の薬剤濃度 は,EPO お よび
に用 い た ELI
S
AKi
tは, ラ ッ ト由来 EPO と ヒ ト
CEPO で約 5
0pg/ml
,AEPO で約 5pg/
mlで あっ
た.比 較 の ため に行 った EPO依 存 性 白血 病 細 胞
由 来 EPO を 同 時 に 検 出 で き , ヒ ト EPO ･
AEPO iCEPO も同等 に検 出で きた.
株 AS-E2は CEPO に 反 応 せ ず , EPO お よ び
AEPO に対 して は同程度 に濃度依存性増 殖 を示 し
ヒ ト正常心臓 細胞
HCAEC)
,冠動 脈 血
ヒ ト冠動脈 血管 内皮細胞 (
管 平 滑 筋細 胞 (
HCASMC) お よび心 線 維芽 細 胞
nv
i
voでの造 血 活性 は AS-E2の反応 とほぼ
た.I
同等 で あ った.
心臓 カテ-テル検 査の結栄 お よび肺細動 脈血管
(
HCF) は Ce
l
lAppl
i
c
a
鮎 ns(
Sa
mDi
e
go,CA) か
ら購 入 した.ヒ ト肺動 脈 血管 内皮細 胞 (
HPAEC)
肥 厚 の程度 を図 2に示 す .EPO投与 でのみ肺血管
は Lomz
a(
Wa
l
ke
r
s
vi
ne,MD) か ら購 入 した.い
圧 の上 昇 が抑 制 され た.肺 組 織 で の mRNA発 現
NAを抽 出 して
ず れ も培養 を行 わず ,その ま ま R
量 を図 3に示 す.血管 内皮 の抗 アポ ト- シス因子
QRTI
PCR法 に よって m訳NAの定量 を行 った,
内皮障害 に よる血管壁肥厚 とそれ に続 発す る右窒
で あ る BCL-ⅩL e
NOS,細 胞 接 着 因 子 (
血管内
,お よび ET-1
皮 の量 の指標 ) で あ る PECAM -1
mRNA の定量
摘 出 した ラ ッ ト肺組織 ･マ ウス虚 血下肢筋 お よ
は いず れ も同様 の 発 現 誘 導 を示 した.す な わ ち,
EPO授 与 で強 く誘 導 され ,AEPOで 弱 く誘 導 さ
51
8
新潟 医学 会雑 誌
表
第
1
2
3巻
第
1
0号
平成
2
1年 (
2
0
0
9
)l
o員
I QRT-PCR法 に用いた Pr
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rの塩基配列
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れ,CEPOで全 く誘導 されなかった.
以 Lの結果か ら,EPO誘導体の肺血管内皮障害
nv
i
v
oでの 直接 的 な血管 内皮保護作 用
に対す る i
の 強 度 は,EPO >AEPO >CEP0- 0で あ り,
EPO と AEPOの 力価 の違 いは薬物 の血 中濃度 の
差 で説 明で きた.また肺 血管 内皮 の EPO誘導体
に対す る効果は造血系細胞 とほぼ同等であった.
C5
7
/
BLマウスの下肢虚血モデルに対する効果
各種 EPO誘導体授与 による造血作用 は r
hEPO
でのみ観察 された (
図 4).レーザー ドップラー法
で計測 した血流 の健 常肢 に対す る虚 血肢 の比 で
群 で計測値 が一番高 かったが有 意 で はなか った.
EPO誘導体の投与 による血管新生作 用の強度 は,
AEPO >EPO- CEPOであった (
図 5)
.
虚 血 筋 内 の mRNA 発 現 量 を 図 6に 示 す .
PECAM-1には有意差 が見 られ なか った ものの,
発現豊の測定値 はAEPO>
EPO>CEPOで,組織 内
NOSの
新生 血管数 と矛盾 しない結果 で あった.e
発現 は EPO誘導体の投与 によ り強 く抑制 された.
王
L-6の発現量 は新生血管数 とほぼ一致 したパ タ
ーンを示 し,
CD1
3
1の発現量はこの鏡像を示 した.
t
RNAのプロフィール
ヒ ト正常心腹細胞に発現するm
は,虚血稚戒の 1日後 に著 しい血流の低下が見 ら
血管 は内皮 ･平滑筋 およびその周辺 にある線維
れ た ものが,7日後 には溶媒のみの投 与で も自然
_
作用によって維持調整 され る.そこ
芽細胞 の相 5.
断 髪が見 られた.EPO誘導体投与後,AEPO投与
で ヒ ト心臓 をモデルにこれ ら 3着の相互稚用 を推
柳川 :各種エ リスロポエチ ン誘導体による血管新生作用の比較 とその機序の解析
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図 l モ ノクロタ T
3ン誘 発 ラ ッ ト肺 血管 内皮障害 に対す る各種
EPO誘導体の持続静脈内投与による造血の変化
5雄 /
kg/da
yの持続静脈内投与 を 21日間行
各種 EPO誘導体 2.
った.血 中 Hb濃度 (
左上)および牌重義 (
右上)の増加 は EPO
投与でのみ見 られた :n-8 (
正常 ラッ ト)
,1
5(
溶媒投与群)
,8
(
EPO投与群 ),9 (
AEPO投与群)および 9 (
CEPO投与群 ).血
中 EPO誘導体濃度 (
左下)の内因性 EPO分泌 (
溶媒投与群)か
0p
g/ml
,AEPOで 約 5
らの 増 分 は ,EPO お よび CEPOで 約 5
正常 ラッ ト)
,7 (
溶媒投与群)
,7 ほPO
pg/
mlであった :n-8(
投与群),8 (
AEPO投与群)および 9 (
CEPO投与群).比較の た
めに各種 EPO誘導体の EPO依存性細胞株 ASE2に対す る増殖活
性 を示す (
右下):それぞれ n- 3.造血系細胞 は EPO と AEPO
に同程度 に反応す るが,CEPO には反応 しない.矢印 は 5および
5
0pg/ml
.白丸 :r
hEPO,黒丸 :r
hAEPO,菱形 :r
hCEPO.
測 す る 目的で,ヒ ト冠動 脈 内皮 ･冠動脈平滑筋 お
お り,この CD1
31が EPOR以 外 の α鎖 と会合 し
よび心線維芽細胞 に発現 す るサ イ トカイ ンお よび
て い ることを伺 わせ た 平滑筋 は EPORが発現 し
その受 容 体 の mRNA を定 量 し,ヒ ト肺 動 脈血管
て お らず (
mRNA コ ピー数 は ノイズ レベル ),こ
内 皮 と比 較 した (
図7
).線 維 芽 細 胞 で は EPOR
の CD1
31も明 らか に EPOR以外 の α鎖 と会 合 し
と CD1
31がほぼ 同 レベ ル で発 現 して い た が,内
L-6は主 に線 維 芽 細 胞 に
て い る と考 え られ た.I
皮 で は CD1
31が EPO の 5- 5
0倍 程 度 発現 して
)
1
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L-6受 容 体 α鎖 ) は 3
発 現 して い た.CI
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新潟 医学 会雑誌
第
1
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3巻
第
1
0号 平成 21年 (
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図望 モ ノク ロ タ リン誘 発 ラ ッ ト肺 血 管 内皮 障 害 に 対 す る各 種 EPO
誘導 体 の持続 静脈 内投 与一
に よ る心機 能 お よび肺 小 動 脈 血管肥厚
の変化
肺 高 血圧 症 の 発症 に よ る石室圧 の上昇 (
左 図 ) は EP
O投 h
j
によっ
正常 ラ ッ ト),1
5(溶媒投 与群 ),8(
EPO
てのみ改善 され た :n-8 (
投 与那 ),9(
AEPO投 与･
君羊) お よび
9(
CEPO投 与 群 ).肺 血 管 内皮 障
(
右図 ) も E
PO投 与 に よ っての み改善 さ
2 (溶 媒投 与 群 ),5(
EPO投 与群 ),7
れ た :n-4 (正常 ラ ッ ト),1
(
AEPO投 与群 ) お よび 8(
CEPO投 与群 ),
害 に よ る肺 小 動 脈 血管 肥 厚
者で同 レベル に発現 していた.線維芽細胞 と平滑
ことがわか る.
筋 は VEGFを発現 し,内皮 は PLGFを発現 してい
た.
それ 自体 は EPO および AEPO に濃度依存的 に反
ラッ トの肺血管 内皮障害 の実験 結果では,内皮
応す るが CEPO に反応 しなか った.この ことか ら
考
察
内皮の EPO 誘導 体 に対す る反応 は造血系 とほぼ
同様 で あ り, した が って内皮 は造 血 系 と同 じ く
EPO 反応性 の赤芽球系 白 血病細胞株 に AS-E2
と UT-7がある 1
0
日封.uT-7は CFU-GEMM レ
EPORの ホモ 2童体化 を介 して刺激 を受 けると言
ベ ル の 性 質 を も ち EPORの 発 現 鼠 は 少 な く
特 徴 的 に 見 られ る血管 新 生 作 用 (国 内特 許 第
CD1
31の 発現 巌 が 多いの に対 し,AS-E2は分化
4
2
0
0
5
0
9号 ) は血管 内皮 に対す る底接作用で は説
の 進 ん だ CFU-eレベ ル の 性 質 を も ち大 量 の
明で きない.
える.それゆ え,我 々が以 前に報質 した AEPO に
EPORを発現 し CD1
3まの発現 はほ とん ど見 られ
今回行 った虚 血 に強 い黒 ネズ ミを用いた下肢虚
31は GM -CSF･王
L-3･I
L-5の 共通
ない.CD1
血 か らの 自 然 回 復 モ デ ル で は ,治 療 効 果 は
β鎖 と して知 られ て い る.CD1
31は EPORを含
む これ ら少 な くとも 4つの α鎖 と最初 か らヘテ ロ
AEPO >EPO- CEPO で あ り,血 管 新生 に重 要
2量体 と して存在 してい ると考 え られ てい る.実
な役割 をはた してい る細胞 と して,内皮以外の細
胞 が 想 定 さ れ た , CEPO は EPO ホ モ 受 容 体
L-3や GM -CSFに 対 す る反 応 性 を もつ
際 ,王
(
EPOR
/
EP
OR)に親和性 を持 たず EPO へ テ ロ受
UT-7も反 応 性 を持 た な い AS-E2も,EP0 や
容体
AEPO に同程 度 に反応 す るが CEPO には夜 応 し
か ら,血 管 新 生 に重 要 な役 割 を果 た した細 胞 は
(
EP
OR/
CD1
3
1
)にのみ親 和性 を持 つ こと
な い こ とか ら,赤 芽球 系 の細 胞 に発現 して い る
EPO へ テ ロ受容 体 を発現 してい ると考 え られ る.
CD1
31は EPOR とヘ テ ロ 2量 体 を形 成 で きない
NA発現 解析 を行 った とこ
また虚 血肢 筋 での mR
柳川 :各穫エ リスロポエチン誘導体による血管新生作用の比較 とその機序の解析
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図 3 モノクロタリン誘発 ラッ ト肺血管内皮障害 に対す る各種 EPO
誘導休の持続静脈内投射 こよる肺に発現する mRNA量の変化
血管内皮に発現する抗 アポ トーシス因子である B
CL-ⅩL (左 L),
右 ヒ)
,血管内皮に発
血管内皮に発現する血管保護作用をもつ eNOS (
現する細胞接着因子 (
血管内皮の巌の指標)である PECAM -1
,およ
び血管内皮に発現する血管収縮物質である ET-1はいずれも同様の発
現誘導 を示 した く
各 mR
NAコピ-数の γ-act
i
nコピー数 に対す る
正常 ラ ッ ト),1
0(
溶媒投与群),7 (
EPO投 与節),9
比):n- 7 (
CEPO投与群)
.すなわち,EPO投 与で強
(
AEPO投与群)および 7 (
く誘導 され,AEPO で弱 く誘導 され,CEPO で全く誘導 されなかった.
L-6の 発現 巌の み が治療 効 果 と一 致 す る応
ら,I
維 芽細胞 に発現 し,また内皮 お よび平滑 筋 に大量
答 を示 した が ,CD1
31は AEPO群 で減 少 して お
に発現 して い る CD及
31は EPOR以 外 の α鎖 と会
り,標 的細胞 の CD1
31が AEPO に反応 して do
wn
合 して い る ことが推 測 され た.問題 の I
L-6は主
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e
gui
a
t
i
o
nされ た こ とが推 測 され る.驚 い た こ と
NOSの発現 は各種 EPO誘導 体 に よ り著 しく
にe
L-6受容 体 は 3者 に均
に線 維 芽 細 胞 に発 現 し,I
等 に発現 してい た.血管 内皮 の生存 と増殖 に関 わ
減 少 していた
るV
EGFは平滑 筋 と線維芽細胞 に発現 し,血管平
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) にお
血 管 の形成 は個 体 発生 (
滑 筋の推持 に重 要なP
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GFは血管 内皮 が発現 して
この ことは I
L-6の受 容 体 を発 現 して い る
いて も生後 (
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s
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s
) において も内皮 ･平
いた
滑筋 ･線維芽細胞 の 3者 の クロス トー クが重要で
3種 の血管構成 細 胞 が,相 互 に維 持 や増殖 を担 い
あ る.そ こで ヒ ト血 管 構 成 細 胞 に お け る mRNA
あ って い る ことを伺 わせ る.今後 ,線維 芽 細 胞 が
発現 プ ロフ ィール を解 析 した.EPORは内皮 と線
実 際 に EPO へ テ ロ受 容 体 を介 して I
L-6分泌 を
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左学会訓話
節1
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3巻 邦 1
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j即) レーザ ー ド ノブ ラー法で汁=州した血流の惟常服 に対す る戊
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れ た もの が.7E
｣後には溺 媒のみの授 与 で も自然剛 如 く
見 られ.gpo
誘群 体投 与の効架 が七芯差 をもって剛 察 され なか ったが.AEPO投与
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が批 ㌍ され 血管 新生 作 榊の 感度 は,
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的)
,7 (
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図 6 C5
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/BLマ ウス下肢虚血モデル に対す る EPO誘導体の投与 によ
る虚血筋内での mRNAの誘導
血流測定後 に虚 血肢大腿筋か ら RNAを抽 出 し,各種 mRNA発現量
を比 較 した (
各 mRNAコ ピー数 の γ-a
c
t
i
nコ ピ-数 に対 す る比 ):
n- 4 (
虚血作成 前 ),6 (
溶媒投 与群 ),5 (
EPO投 与群 ),6 (
AEPO
投与群)および 5 (
CEPO投与群 ).PECAM 一旦には有意差 が出なかっ
たが,測定値 は AEPO >EPO >CEPO で あった.肺血管 内皮障害 モ
デル とは逆 に EPO誘導体投与 によ る e
NOSの強 い抑制 が観察 され た,
I
L-6の 測 定 値 は AEPO >EPO- CEPO で あ り,CD1
31発 現 墓 は
I
L-6の鏡像 をとった.
行 うか どうか,また内皮 および平滑筋 が I
L-6反
EPOR ･CD1
31･CD1
2
6 ･GP1
3
0は いず れ
応 性 にそれ ぞれ PLGFや VEGFの分 泌 を克 進 さ
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pe-Ⅰの サ イ トカ イ ン受容 体 に属 し,J
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L-6はそれ ぞれ 2分 予 ずつ
せ るかを,i
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t
r
o培養系 を用いて確認す る必要が
ある.
L-6は,炎症 ･修復 ･血
前炎症性サイ トカイン I
管新生 などの生体防御反応 に関わるマスター分子
の 1つである.I
L-6は血管平滑筋の増殖 と運動能
を誘導 し1
4
)
1
5
)
,血管 内皮前駆細胞 による血管新生
をi
nvi
t
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voで も血管新生 や腫
癌 血管 の発育 に中心 的 な働 きをしてい が
7ト 1
9)
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L-6 ･I
L-6
Rα鎖 (
CD1
26)II
L-6
R β鎖
(
GP1
3
0,CD1
3
0)による 6量体 を形成す ることで
GP1
3
0か ら主 に s
t
a
t3お よび MAPK経 路 を介 し
て転写 制御 を行 う 21).造血 にお け る EPORか ら
の主 なシグナル経路 が s
t
a
t
5および MAPK経路で
あるの に対 し,造血以外の臓器 における EPORか
3
0の シグナル経 路
らの シグナル経 路 は この GP1
興味深 い ことに,I
L-6は血管内皮 に対 し s
t
a
t-3
とほぼ同等 で ある 22).線維芽細胞 は主 な I
L-6発
を介 して e
NOSを低 下 させ る作 用 が あ り 20),
現細胞 で あ ると同時 に自 ら I
L-6
Rを強 く発現 し
我 々の一連の実験結果 をよく説明す る,
てお り,おそ らく Ⅰ
L-6を介 したオ- トク ライン
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新潟 医学会雑誌
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図 7 ヒ ト正常心臓細胞 に発現す る mRNAの プロフ ィール
ヒ ト冠動脈 の 血管 内皮
(
EC).血 管平滑 筋 (
S
MCト
線維 芽細胞
(
F
BL) お よび肺動脈の 血管 内皮
Aを抽 出 し,各種 サ イ トカイ ンおよび その受容 体 の mRNA発現 騒 くコピ-数/I
'
L
gt
O
t
a
l
RN
A)
か ら RN
を測定 した.線維 坪細胞 では E
P
ORと CD1
3
1がほぼ 同 レベルで発現 していたが,内皮 で は CDユ
3
1が
EP
Oの 5-5
0倍 程 度 発現 して お り,この CD1
3
まが E
P
O沢以外 の α鎖 と会 合 して い る ことを伺 わせ
P
ORが発現 して お らず (
mR
NAコ ピ…数 は ノイズ レベル),この CI
)
ま
3
1も明 らか に
る.平 滑 筋 は E
EP
OR以外の α鎖 と会合 してい ることになる.I
L-6は 日 こ線維芽細胞 に発現 していた.CDi
2
6(
l∴6
I
受容体 α鎖) は普遍 的 に発現 していた.線維芽細胞 と平滑 筋 は VEGFを発現 L,内皮 は PL
GFを発現
していた.
システムを持 っていると考 えられ る.EP
Oは線 維
血 管 新 生作 用 で は AEP
Oが圧倒的に強 い活性 を
芽細胞 の E
PORを介 して このオ - トク ライ ンの
Oお よび AEPOに対す る濃
赤芽 球系細胞 の EP
示 す . した が っ て ,E
PO とAEPOの活性の差異 は
EPOR/EPORホモ 2量 体 に対 す る差 で は な く
EPOR/
CD1
3
1へ テ ロ 2量 体 に対 す る差 で あった
ことが推定 され る.EP
Oには 3つの NI
:
B型
糖鎖 が
度 依 存 性 は同等 で あ り,CEP
Oに は反応 しない.
あ り,それぞれが 3- 4個 の シアル酸 に由来す る
O誘導 体 に対 す る振 る舞 い もこれ
ぬ管 内 皮の EP
カル ボキ シル基 の ク ラス タ- を形 成 す るの に対
とほぼ同等で あった.これ に対 しおそ らく線維芽
し,CD1
3
1は F
J
PO結 合 ドメ イ ンに 1つ の N-型
引 き金 をひ くことで血管新生 に強 く介入 していた
可能性 が ある.
nv
i
v
o
細 胞 を介 した間接 作 用 の結 果 と思 われ る i
柳川 :各種エ リスロポエチン誘導体による血管新生稚用の比較とその機序の解析
は Ⅳ型糖鎖 が存在 しないが,側鎖 に カル ボキ シ
5
2
5
癖に有 効であれば,有用な内科的治療法 となり得 る.
ル基 をもつアスパ ラギン酸 拍 ) およびグルタ ミン
酸 (
E)の出現頻度 が高 く,3次構造 では [
D1
5
7,
謝
E1
5
8,E2
26] および [
E1
97,E2
0
0,E2
0
4] がそれ
本研究においてご指導を賜 りました第-八
内科学教等
辞
ぞ れ カル ボ キ シル 基 の ク ラス タ- を形 成 す る.
講師 鳥羽 健先生,同 講師 嫡 晴雄先生に深謝いた
EPO の 3つ の N型 糖 鎖 は EPOR/CD1
31の 3つ
します.
の カル ボキ シル 基 ク ラス タ- との 間 で斥 力 を生
文
じ,AEPO の 3つ の N-型糖 鎖 は逆 に引 力 を生 じ
献
る可 能 性 が あ る, も しそ うで あ れ ば ,EPO と
AEPO で WS
貰ⅣSモ チ - フ との相 互 作 用 に差 が
生 じることが うま く説明で きる,
閉塞性動脈硬化症 やバ ージャー病 の垂症例 は下
肢 切断 にいたることが多 く,有効 な治療法の開発
が必要 で ある.外科 的再建 の適応 が な く,かつ内
科 的治療 が無効で あった症例 を対象 と して各種の
血管新生療法 が試み られてい るが,有効かつ安全
な治療法 がな く,これ までの ところサ イ トカ イン
療 法 は旨検試験 で無効 と争j
断 され るか,多数例 の
解析 でか ろ うじて有意差 が出 たが,強 力な血管新
生作用 を示す もの は未 だない.
自家の骨髄細胞や末梢血細胞,あ るいは精製 し
た CD34陽性細胞や体外増幅 した間葉系細胞 を異
所性 に虚血臓署 内へ移植す る方法 は, 一
部の症例
に対 し確実 に有効 な治療法で あるが,患者への侵
襲 が大 き く,また限 られ た施 設 で しか行 えない.
これ に代 わ る方法 と して低侵 襲の対 外増幅 自己赤
芽球移植法 を開発 し最童症例 に も効果 があること
を観察 してい るが,この 方法 では培養 にコス トが
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EPO誘導 休 には組 織 ･細胞保護 効 果の他 に血
管新生作用が認め られ る.この うち,自然型 EPO
は血管新生作用が弱 いのみ な らず 多血症 による心
不全の悪化が開港 とな り,また CEPO では抗原性
の変 化 によ る抗 体 の 出現 な どの問題 が懸 念 され
る.一方,AEPO は体 内に存在す る自然物 であ り,
多血症 を誘発せず,またマ ウスの 下肢虚血モデル
で BM王に匹 敵 す る血管 新 生 効 果 が観 察 され た.
今
後検討 を要す るが,AEPO が慢性虚 血患者の治
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新潟 医学会雑誌
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生作用 に関す る研究 .新潟医学会雑誌 1
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平成 21年 1月 5日受付)
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