LABScreen の手引き

ワンラムダ社
LABScreen の手引き
∼操作・解析・トラブルシューティングの解説集∼
2014/12/16 rev.3
2014/12/16 rev.3
目次
1.HLA 抗体検査の臨床的意義 ........................................................................................................... 3
1.1 臓器移植における HLA 抗体検査 .......................................................................................... 3
1.2 造血幹細胞移植における HLA 抗体検査................................................................................ 4
2.LABScreen Single Antigen 製品概要 ........................................................................................... 5
2.1
LABScreen の使用目的・原理 ............................................................................................. 5
2.2
LABScreen の種類 ............................................................................................................... 6
3.検査の準備 ................................................................................................................................... 8
3.1 キット内容と保存方法......................................................................................................... 8
3.2 他に必要な試薬 ................................................................................................................... 8
3.3 必要な機器・器具 ................................................................................................................ 8
3.4 LABScan システム/LABScan 3D システム測定時に必要なファイル....................................... 9
3.5 検査の流れ .......................................................................................................................... 9
3.6 検体処理 ............................................................................................................................ 10
4.推奨プロトコル .......................................................................................................................... 11
5.LABScreen Single Antigen の判定に関して .............................................................................. 14
5.1 蛍光値（nMFI 値、Baseline）に関して ............................................................................. 14
5.2 施設カットオフラインの検討方法 ..................................................................................... 14
5.3 再検査の基準 ..................................................................................................................... 14
5.4 施設判定ルール（参考例） ............................................................................................... 14
5.5 施設報告ルール（参考例） ............................................................................................... 14
6.HLA Fusion 3 による LABScreen の解析 ...................................................................................... 15
6.1 LABScreen 解析カタログのインポート方法 ....................................................................... 15
6.2 LABScreen データのインポート方法 .................................................................................. 17
6.3 LABScreen Mixed 解析 ....................................................................................................... 19
6.4 LABScreen Single Antigen 解析 ....................................................................................... 21
7.LABScreen Single Antigen よくある質問（FAQ） ..................................................................... 32
7.1 陽性コントロールビーズ値（PC 値）が低い場合 .............................................................. 32
7.2 陰性コントロール値（NC ビーズ値）が高い場合 .............................................................. 33
7.3 プロゾーン様現象 .............................................................................................................. 34
7.4 HLA 自然抗体 ...................................................................................................................... 35
7.5 ネガティブコントロール血清 ............................................................................................ 36
7.6 DQ、DP 抗体が存在する場合............................................................................................... 37
7.7 自己抗体 ............................................................................................................................ 38
8.LABScreen Single Antigen 共通化プロジェクト ...................................................................... 39
9.付録：操作手順書 ....................................................................................................................... 40
2
2014/12/16 rev.3
初めに
本「LABScreen の手引き」は、LABScreen を使用されている方、使用予定の方が安心して試薬を使用できるよう
に、操作方法や解析、トラブルシューティングに至るまでの様々な重要なポイントをまとました。
LABScreen 検査で迷った際等に是非ご活用下さい。
1.HLA 抗体検査の臨床的意義
1.1
臓器移植における HLA 抗体検査
HLA 抗体検査は、抗体関連性の臓器拒絶を回避する為に非常に重要な検査であると言えます。
ドナー臓器の HLA 抗原に特異的に反応する HLA 抗体（DSA、Donor Specific Antibody）を患者が保有していた場
合、臓器拒絶のリスクが上昇すると言われています。移植前に DSA を保有している場合、移植後に急性拒絶が起
こる危険性があると考えられています。さらに近年では、移植後の慢性拒絶にも DSA の関与が強く示唆されてい
ます。
Dunn らによる最近の研究では、統計上の生存率が移植後 5 年目で、DSA 陽性患者では DSA 陰性患者に比べて優位
差をもって低下することが明らかとなっています。1)、図 1）
1) Dunn TB, et al. Revisiting traditional risk factors of rejection and graft loss after kidney
transplantation. American Journal of Transplantation 2011.
図 1：DSA と生存率の関係
3
2014/12/16 rev.3
1.2 造血幹細胞移植における HLA 抗体検査
DSA の存在は、移植した造血幹細胞の生着にも影響を与えています。特に DSA を保有する場合、有意差をもって、
生着不全となります。2)、3)、4）
、図 2)
臍帯血移植では HLA の 2 抗原ミスマッチまで、非血縁骨髄移植においても HLA の１抗原ミスマッチが許容されて
いるため、DSA の有無を事前に確認しておくことで拒絶のリスクを回避する事が重要と考えられています。この
ような背景から 2012 年の診療報酬改定により、全ての造血幹細胞移植術に対して、抗 HLA 抗体検査を実施した
場合、4000 点加算出来ることになりました。
2)Takanashi M, Atsuta Y, Fujiwara K, Kodo H, Kai S, Sato H, et al. The impact of anti-HLA antibodies
on unrelated cord blood transplantations. Blood. 2010; 116:2839–2846.
3)高橋聡. 臍帯血移植と HLA 抗体―東大医科研での経験からー.
4)高梨美乃子. 臍帯血移植における抗 HLA 抗体の影響.
HLA と抗体 3 号.2007.2
HLA と抗体 7 号.2008.7
好中球回復率
血小板回復率
無再発生存率
生存率
図 2：臍帯血移植における抗 HLA 抗体の影響 2）
Ab-negative：HLA 抗体陰性、Ab-positive：HLA 抗体陽性
Positive-vs-CB：臍帯血に対して特異的な HLA 抗体陽性（DSA 陽性）
2014/12/16 rev.3
4
2.LABScreen Single Antigen 製品概要
2.1
LABScreen の使用目的・原理
LABScreen は、LABScan システム（Luminex）を使用して検体（血清または血漿）中の HLA 抗体を検出する為の研
究用試薬で、精製した HLA 抗原がコーティングされたマイクロビーズです。簡便かつ高感度に HLA 抗体を検出す
る事ができます。
LABScreen ビーズと検体を反応後、PE 標識抗ヒト IgG 抗体で染色し、LABScan システム/LABScan 3D システムに
より蛍光強度を測定し、HLA 抗体を検出します。
5
2014/12/16 rev.3
2.2
LABScreen の種類
LABScreen は LABScreen Mixed、LABScreen PRA、LABScreen Single Antigen の 3 種類があります（図 1）。これ
らの試薬は、HLA 抗原型を 100%網羅しています。

LABScreen Mixed：ビーズに 3-5 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、
HLA 抗体の有無を確認可能。

LABScreen PRA：1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、HLA 抗体の有無、およその特
異性、％PRA*を確認可能。

LABScreen Single Antigen：1 ビーズに対しリコンビナント HLA 抗原が 1 種類のみ結合しており、HLA
抗体の抗原特異性の検出が可能。
なお、追加で開発された LABScreen Single Antigen Supplement を併用すれば、日本人に見られる HLA アリルの
ほぼ全てを網羅しているため（表 1）
、さらに高精度なアリルレベルでの DSA 測定が可能となります（図 2）。
* %PRA（Panel Reactive Antibody）
：全パネル細胞の何％が陽性となるかの値。%PRA が高い程、様々な抗原に対
する抗体を保有している指標となります。
製品名
LABScreen
目的
HLA 抗体のスクリーニング
（1 ビーズに 3～5 パネル）
Mixed
LS12M（ClassI&II&MICA）
LABScreen
20 種類のビーズ
%PRA*とおおよその特異性
（1 ビーズに 1 パネル）
PRA
LS1PRA（ClassI）
LS2PRA（ClassII）
LS12PRA（ClassI&II）
LABScreen
ビーズの種類
ClassI：55
ClassII：35
Single Antigen
LS1A04（ClassI）
特異性の検出、DSA の同定
（1 ビーズに 1 抗原）
LS1A04SP（ClassI+SupplementI）
LS1ASP01（SupplementI）
LS2A01（ClassII）
LS1ASP01（SupplementII）
LS2A01SP（ClassII+SupplementII）
ビーズの種類
ClassI：99、SupplementI：36
ClassII：97、SupplementII：18
図 1. LABScreen 製品の種類及び使用目的
6
2014/12/16 rev.3
表 1：LABScreen Single Antigen+ Supplement での日本人アリル頻度カバー率
図 2：各種 LABScreen による HLA 抗体測定レベル
7
2014/12/16 rev.3
3.検査の準備
3.1
キット内容と保存方法
未開封のキットは、-65℃以下で箱に表示されている有効期限まで保存できます。一度解凍したあとの保存
方法と有効期限は下記のとおりです。
内容
保存方法と有効期限
LABScreen beads mix
キットの箱全体を初回使用時まで-65°C 以下のフリーザーに保管して
ください。ラベルに記載された有効期限まで保管できます
一度解凍したビーズは再凍結しないでください。解凍したビーズは、
最長 3 ヵ月または有効期限（3 ヵ月以内の場合）まで 2 - 8°C に保管で
きます。
10 × Wash buffer
初回使用後は、Wash Buffer を最長 3 ヵ月または有効期限（3 ヵ月以内
の場合）まで 2°C～8°C に保管できます。
3.2
他に必要な試薬
下記はキットに含まれないので別途ご用意ください。
LABScreen では、毎回必ず陰性コントロール血清（LS-NC）を並行してテストして下さい。-20℃で有効期限まで
保管できます。
二次抗体（LS-AB2）は、凍結乾燥の粉末状態で届く為、滅菌蒸留水で溶解させます。滅菌蒸留水の量は、ロット
毎に異なる場合があるので、必ず製品バイアルで量を確認します。溶解した後は冷蔵で 6 ヶ月間保管可能です。
商品コード
LS-NC
品名
LABScreen
容量
negative control
1 検体の使用量
400 all（20 test）
20 all
PE conjugated Goat anti human
0.5 mg
×100 Stock を 1 all
IgG
（約 1000 test）
PBS
－
serum
LS-AB2
―
3.3
－
必要な機器・器具
製品名
製造元
LABScan システム
LABSCNXS3
One Lambda
（または LABScan 3D システム）
96 ウェルマイクロプレート
"UNIPLATE"
トレーシール
プレート遠心機
カタログ番号
（LABSCNXS4）
Whatman
7701-3250 (white)
One Lambda
SSPSEA300
どのメーカーでも可。1300g 以上回せるもの
プレートシェーカー
どのメーカーでも可
その他、ピペットやチップ等もご用意ください。
8
2014/12/16 rev.3
3.4
LABScan システム/LABScan 3D システム測定時に必要なファイル
測定に必要なファイルを下記 URL からダウンロードします。
使用している LABScreen 製品、ロットに該当する測定ファイルを選択して下さい。

LABScan システム（Luminex IS2.2/2.3）を使用の場合：テンプレートファイル
http://download.onelambda.com/pub/tray_info/Windows/Luminex_Templates_LX100_200/IS2_3/LABScreen/

LABScan システム（Luminex xPONENT3.1）を使用の場合：プロトコルファイル
http://download.onelambda.com/pub/tray_info/Windows/Luminex_Templates_LX100_200/Xponent_3_1/LABScreen/

LABScan 3D システム（Luminex xPONENT4.2）を使用の場合：プロトコルファイル
http://download.onelambda.com/pub/tray_info/Windows/Luminex_Templates_LABScan3D/Xponent_4_2/LABScreen/
3.5
検査の流れ
前処理
反応
洗浄
• 検体（血清または血漿）を凍結融解、転倒混和
• 8000g -10000gで10分間、超遠心
• ビーズ5ulと検体20ulを混合
• 遮光、室温（20 – 25℃）で振とうで30分間反応
•洗浄バッファー、遠心（1300gx5分 or 1500gx3分）
•フリッキング、タッピング、ドライボルテックス
（3回）
PE標識
洗浄
•100倍希釈した二次抗体を100ulずつ添加
•遮光、室温（20 – 25℃）で振とうで30分間反応
•洗浄バッファー、遠心（1300gx5分 or 1500gx3分）
•フリッキング、タッピング、ドライボルテックス
（2回）
9
2014/12/16 rev.3
3.6
検体処理
3.6.1
検体前処理（必須）
1. 検体（血清または血漿（ACD または K-EDTA 加血）
）は必ず凍結融解します。
2. 融解後は、しっかり転倒混和を行ってから遠心を行います。
（8000～10000g、10 分間以上）
。不純物が多い検
体は遠心速度、時間を増やします。
3. 上層、下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので、慎重に中間層から検体を回収して使用します。
3.6.2

再検査の為の検体処理（参考情報。各施設で検討して下さい。）
陰性コントロールビーズ値（NC 値）が高い場合：非特異物質の吸着操作

使用する試薬：Adsorb Out（製品コード：ADSORB、One Lambda）

Adsorb Out 処理プロトコル（メーカープロトコル）
1. （1 テストあたり）血清 30uL に対して Adsorb Out ビーズを 3 uL 加え、ボルテックスします。
2. 室温で 30 分間、振とうしながら反応させ、15000 rpm で 5 分間遠心します。
3. 上清を、ビーズを吸わないように慎重に新しい別の 1.5mL チューブに移します。
4. もし検体に Adsorb Out ビーズが混入した場合には、再度超遠心し、上清を移します。

陽性コントロールビーズ値（PC 値）が低い場合： DTT 処理による IgM 抗体の不活化

使用する試薬：DTT （dithiothreitol、メーカー不問)

DTT 処理プロトコル（第 4 回アメリカ組織適合性学会（ASHI）推奨プロトコル）
1. DTT 溶液（0.05M) 10 uL に対して血清を 90 uL 加えます。（DTT の終濃度は 0.005M）
2. よく混ぜた後、37℃で 30-45 分間反応させます。1300g で 10 分間遠心し上清を使用します。

プロゾーン現象*が疑われる場合：PBS（メーカー不問）による検体の希釈

希釈倍率は、検体によって異なるので各施設で検討して下さい。
*プロゾーン現象・・・過剰に抗体が存在することで、抗原・抗体反応が抑制される現象。偽陰性となる可能性あり。

プロゾーン様現象が疑われる場合：補体成分の不活化

使用する試薬： 0.5M-EDTA（メーカー不問）

EDTA 処理参考プロトコル
1. 溶解した血清 90uL に、EDTA 3uL を入れます。
2. 室温にて 30 分間、振とうしながら反応させ、20000g で 10 分遠心し上清を使用します。
*プロゾーン様現象・・・検体中の補体成分が二次抗体の結合を阻害して偽陰性となってしまう現象。
主に LABScreen Single Antigen で報告されています。
10
2014/12/16 rev.3
4.推奨プロトコル
96 ウェルプレート法：データのばらつきが最も少ない為、推奨しています。（図 3 参照）

検体及び試薬の分注
① 96 ウェルプレートの最初のウェルに陰性コントロール血清（製品コード：LS-NC）20uL を入れます。使用す
る LABScreen 試薬毎に LS-NC を 1 ウェルずつ使用します。
② 2 番目のウェルから、前処理（凍結融解・超遠心）済みの検体 20uL を入れます。
③ ビーズを軽くスピンダウンし（蓋の裏に付いた液を落とす）
、数秒間ボルテックスします。キャップを開け、
10 回程度ピペッティングをして LABScreen ビーズをよく混合します。ビーズ数が多いため、しっかりとボル
テックス、ミキシングすることが大切です。使用後は、蒸発を防ぐためにしっかり蓋を締め冷蔵で保存して
下さい。ビーズは凍結融解不可です。
④ ビーズ 5uL を各ウェルに入れ、ピペッティングでよくビーズと検体を混合します。

一回目の反応：ビーズと検体の反応
⑤ トレーシールを貼り、アルミホイルなどで遮光し、室温（20-25℃）でシェーカーを用いて振とうしながら
30 分間反応させます。
⑥ 反応中に、蒸留水で 10 X Wash Buffer (製品コード：LSPWABUF) を希釈し、1 X Wash buffer を必要量だけ
調製します。希釈は、使用するチューブ等の目盛を用いての調製で問題ありません。1 X Wash buffer は 1
テストあたり約 1.1mL 必要です。

洗浄操作：⑦～⑪を 3 回繰り返し行う。
⑦ 反応後、各ウェルに希釈済みの 1 X Wash buffer を加えます。

添加量：1 回目は 150uL、2 回目、3 回目は 200uL を加えます。
⑧ 新しいトレーシールを貼り、1300g で 5 分間（または 1500g で 3 分間）遠心します。

3 回目の洗浄の遠心時に、100 倍希釈の二次抗体を用意します。1 テストあたり、二次抗体の Stock 溶
液（3.2 参照）1uL を、1 X Wash Buffer 99uL に加えます。
⑨ トレーシールを剥がし、しっかりフリッキングして上清を除去します。フリッキングは真下にしっかりと 1
回のみ行います。何度も行うとビーズをロスする危険があります。
⑩ フリッキング後はトレーを下向きにしたままキムタオルに 5 秒間押し付け軽く 5 回タップします。タッピン
グすることでウェル内の残存液を除去する事ができます。
⑪ ビーズのみの状態で、ウェルのビーズがほぐれる程度（約 2 秒～5 秒程度）ボルテックスします(ドライボル
テックス)。ほぐれると、青い点のようになっていたビーズが広がり見えなくなります。なおドライボルテ
ックスを長くし過ぎると、蛍光値が弱くなる場合があるので注意して下さい。
（図 4）
左図：フリッキング、中央図：タッピング、右図：ドライボルテックス（シール不要）
11
2014/12/16 rev.3

二次抗体によるラベリング
⑫ 3 回目のドライボルテックス後、希釈二次抗体 100 uL ずつ各ウェルに加えます。トレーシールを貼り、遮光
しながら室温（20°C～25°C）で振とうしながら 30 分間反応させます。
⑬ LABScan システムもしくは LABScan 3D システムの電源を入れておきます。

洗浄操作：⑮～⑯を計 2 回行う。
（遠心は 3 回）
⑭ 反応後、洗浄バッファーは加えず 1300g で 5 分間（または 1500g で 3 分間）遠心します。
⑮ フリッキング、タッピング、ドライボルテックスを⑨～⑪と同様に行います。
⑯ 各ウェルに 1 X Wash buffer を 200uL ずつ加え、トレーシールを貼り 1300g で 5 分間（または 1500g で 3 分
間）遠心します。
⑰ フリッキング～遠心（⑮～⑯）をさらに一回行った後、フリッキング、タッピング、ドライボルテックスを
⑨～⑪と同様に行います。
⑱ 1 X PBS を各ウェルに 80uL ずつ加えます。
以上でサンプル調整が終了です。

LABScan システム/LABScan 3D システムによる測定に関して

すぐに測定できない場合は、シールを貼り冷蔵庫で保管します。蛍光値が弱くなるので、必ず 24 時間
以内に測定します。

ビーズ数が非常に多くビーズがウェル底に沈みやすいので、すぐに測定できない場合には、測定前にし
っかりとサンプルのミキシングを行います。

LABScan の蛍光値は、その日の条件（レーザー出力、気温等）に影響されます。より正確に蛍光値を測
定するために測定前に必ずキャリブレーションを行います。
12
2014/12/16 rev.3
蛍光値（
）
nMFI
→HLA 特異性
図 3：LABScreen Single Antigen のプレート法とチューブ法の比較
蛍光値（
）
nMFI
→HLA 特異性
図 4：LABScreen Single Antigen におけるドライボルテックス時間の影響
13
2014/12/16 rev.3
5.LABScreen Single Antigen の判定に関して
5.1 蛍光値（nMFI 値、Baseline）に関して
LABScreen 検査は、使用分野、使用目的に応じて当然結果の解釈や治療方針等は異なるので、必ず
各施設で判定基準・判定ルールを作成して下さい。なお、判定の際の蛍光値（nMFI*）を絶対視せ
ず、あくまでも抗体量の目安として参照して下さい。
*nMFI（Baseline）
：補正された蛍光値、normalized Mean Fluorescence Intensity の略。ビーズに対する非特異
反応と抗原に対する非特異反応を差し引いた値。
nMFI ＝検体の各ビーズ値－検体の NC ビーズ値－（ NC 血清各ビーズ値－NC 血清の NC ビーズ）
5.2
施設カットオフラインの検討方法
1. カットオフラインは、NC 血清の反応値（バックグラウンド値）よりも十分に高くなるように設定します。バ
ックグラウンド値は、メーカーの NC 血清を用いて 3-5 回の再現性試験を行って測定して下さい。もしくは、
5-10 種類の「輸血暦、移植暦の無い健常男性ドナー」由来の NC 血清を使用して、バックグラウンドの平均
値を算出することも出来ます。
2. 5-10 程度の予め特異性が分かっている陽性血清あれば、設定したカットオフラインで検出できるかを検証し
て下さい。
3. 必要に応じて、他の抗体検査法の過去の結果と LABScreen のカットオフが適合するか検証して下さい。ま
た、%PRA が高く（特異性の幅が広く）
、タイピング情報があるサンプルがあれば、自己の HLA アリルのビー
ズの反応値をカットオフの目安として使用することも出来ます。
5.3
再検査の基準：メーカーでは以下のいずれかの場合に該当する場合、再検査する事を推奨しています。
1. ビーズカウントが 50 以下
2. PC 値が 500 以下
3. NC 値が 1500 以上
4. PC/NC 値が 2 以下
5.4
施設判定ルール（参考例）必ず各施設で判定基準、判定ルールを作成して下さい。
① コントロール値の確認：NC 値 500 以下、PC 値 3000 以上、PC/NC 値 10 以上であることを確認する。範囲外な
ら、再検査する。
② 基本的には HLA Fusion 3 の自動判定で x6 以上を陽性とする。ただし、必ず nMFI 値を確認する。
③ nMFI 値で約 1000 以上を陽性カットオフとするが、抗体特異性や反応グラフのショルダー（蛍光値が大きく
下がるビーズ）をもとにカットオフの妥当性を必ず検討する。
5.5
施設報告ルール（参考例）必ず各施設で判定基準、判定ルールを作成して下さい。
① 基本情報の記載：患者情報、性別、感作歴（妊娠歴、輸血歴、移植歴）、HLA タイピング情報、検査日、実施
者、使用製品・使用ロットなど。
② コントロール値の確認：ビーズカウント数、PC 値、NC 値、PC/NC 比
③ 検査結果の詳細情報：抗体特異性（抗原レベル、アリルレベル）
、DSA の有無、nMFI 値、バーチャルクロス
マッチ結果など
14
2014/12/16 rev.3
6.HLA Fusion 3 による LABScreen の解析
6.1
LABScreen 解析カタログのインポート方法
6.1.1 解析用 PC がインターネットに繋がっていない場合
1. HLA Fusion 解析時に必要なカタログファイルは、インターネットに繋がっている別の PC を使用して下
記よりダウンロードして下さい。
カタログ ID の読み方：製品コードと NC 血清ロット_ビーズロット_revision
例： LABScreen Single Class I、NC 血清ロット 14、ビーズロット 8、revison2＝「LS1A04NC14_008_02」
http://download.onelambda.com/pub/tray_info/Windows/HLA_Fusion_Catalogs/LABScreen/
2. ダウンロードしたファイルは、USB 等を使用して、解析 PC の C ドライブに保存して下さい。
3. HLA Fusion を起動し、画面の上部のタブより Utilities ＞Update Reference ＞Update Reference File
を選択します。
4. 新しい画面が表示されますので、左側のファイルより、C ドライブを選択します。画面左下のCatalog
にチェックを入れて、右側よりカタログファイルを選択し、Import Catalog ボタンをクリックします。
5. 新しい画面が開き、左側のカラムにカタログが表示されますので、Close を押します。
以上でカタログのインポートが完了です。
15
2014/12/16 rev.3
6.１.2 解析用 PC がインターネットに繋がっている場合
1. HLA Fusion を起動し、画面の上部のタブより Utilities ＞Update Reference ＞Update Reference File
を選択します。
2. 新しい画面が表示されますので、画面左下のCatalog にチェックを入れて、Auto Update ボタンをク
リックします。
3. 別画面が表示されますので、画面左下の Not in Fusion DB をチェックし、画面左上の LABScreen をチ
ェックし、画面右下の Import ボタンを押します。完了すると緑色のゲージが一番右側まで行きます。
Close を押します。
16
2014/12/16 rev.3
6.2
LABScreen データのインポート方法
LABScreen 解析用データは、LABScan（Luminex）の測定用 PC の以下の場所に自動的に保存されています。

Luminex IS2.3 をご使用の場合：C:\My Batch\Output

Luminex xPONENT3.1/4.2 をご使用の場合：C:\ ProgramData\Luminex\xPonent31\OutPut
または C:\My Session
ファイル名は、
「測定の際に入力したバッチ名.csv」となっています。
測定 PC と別の PC で解析する場合は、上記のファイルを USB 等で移動させて下さい。
1. HLA Fusion 3.0
アイコンをクリックし、User Name、Password を入力し、ログインします。
初期画面左下の LABScreen をクリック後、画面左上にあるフォルダのアイコンをクリックします。
2. 解析したいバッチファイルを選択します。複数選択する場合は、
「Shift」または「Ctrl」キーを押しながら
選択して「開く」を押してください。その後、解析したいバッチファイルを選択します。もし、過去に解析
したファイルを再度読み込む時は、Include Imported にチェックして下さい。
3. 中央画面に、Session ID 、Catalog ID が自動入力されます。Catalog ID が合っているか必ず確認をしてく
ださい。Session ID に、特殊記号が含まれていると HLA Fusion で解析できないので、必ず半角英数字
とハイフン、アンダーバーのみを使用します。
カタログ ID の読み方：製品コード、陰性血清ロット_ビーズロット_revision
例： LABScreen Single Class I、陰性血清ロット 14、ビーズロット 8、revison2＝「LS1A04NC14_008_02」
17
2014/12/16 rev.3
4. 陰性血清（一番目の検体）の NS のボックスをチェックし、Import ボタン横の、Check Control ボタンを押
し、陰性血清の測定データとメーカーデータとを比較します。
5. 陰性血清の測定データがメーカーデータと乖離していた場合には、コンタミネーションが疑われます。問題
ない場合には、Import ボタンをクリックします。
メーカーデータ
測定データ
6. 画面右上にある「Navigator」に、インポートしたセッションが表示されるので、クリックします。
青字：未解析のセッション、黒字：解析済セッション
7. Summary が表示されます。各検体をダブルクリックすると解析画面が表示されます。
18
2014/12/16 rev.3
6.3
LABScreen Mixed 解析
6.3.1
解析手順
1. 画面左下 Statistics のコントロール値が施設基準と比較して問題ない事を確認してください。
2. 結果は HLA Class I 抗体、Class II 抗体および MICA 抗体の陰性／陽性が判定できます。MICA 抗体の結果
を確認するには、画面左下の MIC というタブをクリックします。
3. 判定は、Final Assignment の「Positive」、
「Negative」、
「Undetermined（判定保留）
」を確認します。判
定後、Save ボタンをクリックします。
赤色の横線：陽性カットオフライン。陽性カットオフ以上のビーズが一つでもあれば、Positive と判定されます。
緑色の横線：陰性カットオフライン。すべてのビーズが陰性カットオフライン以下であれば、Negative と判定されます。
グレーゾーン：陰性カットオフラインと陽性カットオフラインの間にビーズがある場合。Undetermined と判定されます。
カットオフラインは、各施設で各自検討して下さい。
HLA
HLA
Class I
Class II
②判定結果の確認
③判定結果の保存
① コントロール値の確認
19
2014/12/16 rev.3
6.3.2
LABScreen Mixed の判定：NBG ratio に関して
LABScreen Mixed では、NBG ratio という値を用いて陽性、陰性のカットオフを定めます。
NBG ratio は、NC ビーズに対して、各抗原ビーズがどれくらい反応したかの比率を表すパラメーターです。
NBG ratio = （検体各ビーズ値
－
検体 NC ビーズ値）/（NC 血清各ビーズ値－
NC 血清 NC ビーズ値）
NBG ratio のデフォルト値は、陽性カットオフ値が 1.5、陰性カットオフ値が 1.2 となっていますが、各施設で
の検討を基にカットオフ値を変更する事が可能です。
LABScreen Mixed のカットオフ値を変更する方法：使用する解析カタログ毎に設定する必要があります。
1. HLA Fusion にログイン後、Utilities＞Antibody Product Configuration＞Set Mixed Product Configuration
をクリックします。
2. 下記画面が開きますので、Catalog ID から使用するカタログを選択し、カットオフ値の変更を行います。
3. 陽性カットオフ（Positive Threshold）
、陰性カットオフ（Negative Threshold）の欄に、施設で検討した
値を手入力します。入力後は必ず Save を押します。
20
2014/12/16 rev.3
6.4
LABScreen Single Antigen 解析
6.4.1
解析手順
1. 画面左下 Statistics のコントロール値が施設基準と比較して問題ない事を確認してください。
2. オレンジ色の縦線（デフォルトのカットオフライン）にカーソルを合わせると、蛍光値が表示されますので、
各施設の蛍光値のカットオフ基準に合わせて、左右にドラッグしてカットオフラインを検討して下さい。
X8
X6
X4
自動判定におけるデフォルトの陽性カットオフラインは X6 です。HLA Fusion はビーズの反応を X8,X6,X4,X2
とグループ分けして解析します。解析のアルゴリズムは、nMFI 値（蛍光値）のショルダー（蛍光値が急に下
がる点）
、CREG（交差反応）
、エピトープ等に基づいています。カットオフの設定は各施設の基準に基づいて
行って下さい。変更する際には、各施設で定めた nMFI 値の他に、抗原特異性（CREG、患者の HLA タイプの
反応）等を参考に検討して下さい。
3. 画面下の CREG の表、Epitope Analysis Results から、抗原特異性を確認します。
下記の表は、2C、5C など、各 CREG を表しています。紫色の抗原が陽性と判定されたものです。CREG で反応
性が説明できる場合がありますので、カットオフ変更の際に参考にして下さい。
①
Mean(Raw)となっている場合は、設定の変
更を行って下さい。
② Utilities > Antibody Product
Configuration > Set Analysis
Configuration を選択し、Product Type
を LABScreen Single Antigen を選びます。
③ その後、画面下の下記のチェックボックス
にチェックして、Save して下さい。
抗原レベルで乖離している例
Epitope Analysis Results では「Spec」
：抗原特異性、「>=X6」
：陽性カットオフより高い反応のビーズ数、
「<X6」
：陽性カットオフより低い反応のビーズ数、
「Mean」=各抗原ビーズ値の平均の nMFI（蛍光値）が分か
ります。抗原レベルで反応が乖離しているものが無いかを確認します。
21
2014/12/16 rev.3
4. 抗原レベルでの特異性を確認する場合には、画面上部の Sort Ag ボタンより、グラフをローカス毎に並び替
えます。もとに戻す場合は、Refresh ボタンを押します。
5. 画面中央上部の □DNA にチェックすると、抗原表記がアリル表記に切り替わります。アリルによって反応
性が異なる場合がありますので、患者、ドナーのアリル情報がある場合は参照してください。アリルをアサ
インする場合には、6.4.2 を参照ください。
例：Cw10、Cw10 ⇔ C*03:02、C*03:04
6. 陽性と判断した抗原を Epitope Analysis Results より選択し、
>
ボタンで移動します。複数選択
する場合、
「Shift」キーもしくは「Ctrl」キーを押しながら選択します。取り消したい抗原がある場合は、
選択後、Remove を押します。
7. 解析後は必ず、画面右下の Save をクリックしてください。一度保存したデータを再保存する場合は、Confirm
ボタンをクリックしてください。
22
2014/12/16 rev.3
6.4.2
アリルレベルでの特異性をアサインする場合
1. 画面右下の Raw Data ボタンをクリックします。
2. 下記画面より、陽性ビーズのアリルをダブルクリックし、Close します。
ダブルクリック
3. 解析画面右下の Final Assignment のカラムに、陽性となったアリルが表示されます。
最後に画面右下の Save を押します。追加したアリルはレポートに反映されます。
追加されたアリル
23
2014/12/16 rev.3
6.4.3
DQ、DP 抗体の解析
DQ、DP 抗体は、デフォルト設定では、DQB1/DPB1 の反応性に基づいてソフトが自動判定しています。
DQ、DP 抗体を解析する際には、DQA1/DPA1 の特異性も確認します。
1. 解析画面右上の□DQA1/DPA1 にチェックを入れます。
2. DQA1/DPA1 に陽性反応に関係する特異性があった場合には自動で Epitope Analysis の画面に DQA1/DPA1 のア
リルが表示されます。前後で結果を比較して下さい。
3. 次に、画面上部の Sort Ag ボタンを右クリックし、Sort by DQA1/DPA1 をクリックします。
元に戻す場合は、Refresh ボタンを押します。
4. DQA1/DPA1 のアリル情報でグラフが並びかえされます。陽性と判定された抗原、アリルは紫色で特異性が表
示されるので、特異性を比較・確認します。元に戻す場合は、Refresh ボタンを押します。
5. 陽性と思われた DQA1/DPA1 アリルは、Epitope Analysis 画面で選択して、＞ボタンでアサインします。
24
2014/12/16 rev.3
6.4.4
DSA（Donor Specific Antibody：ドナー特異的抗体）の判定方法
患者がドナー特異的抗体を持っているかどうかを自動判定するためには、患者とドナーのタイピング情報を HLA
Fusion に入力する必要があります。
1. 解析画面上部のアイコンをクリックします。
2. Patient/Donor Flag から、Patient を選択します。Patient ID、First Name、Last Name を半角英数で記入
します。入力したら必ず画面右下の Save を入力します。以上で、Patient ID が解析中の Sample ID に紐付
きます。追加の編集は、画面左下の□Edit/Update にチェックします。
3. 次に、HLA Tests タブをクリックして、患者の HLA タイプ情報を入力し、必ず Save を押します。必要に応
じて、クレアチニン、移植歴、治療歴、クロスマッチのデータも隣接するタブから順次入力できます。
HLA アリル名の入力
HLA 抗原名の入力
4. General Info タブに戻り、画面下の Add New ボタンを押します。Patient/Donor Flag から、Donor を選択
し上記の 2、3 と同様の手順で入力します。以上で、患者情報、ドナー情報の入力が完了します。
Patient/Donor Information の画面を一旦 Close します。
5. 解析画面上部から、再度
アイコンをクリックし、画面右下の Associate Donor IDs クリックします。
登録したドナーID を左側から選択し、
> ボタンで右側に移動し、OK を選択し、Close します。
25
2014/12/16 rev.3
6. 解析画面に戻り、画面右下のＭマークを押すと、DSA 情報がチェックできます。
これらの情報は全てレポートに反映させる事ができます。（6.4.7 を参照）
患者タイピング情報
ドナータイピング情報
陽性と判定した抗体
陽性と判定した DSA
陽性判定外の DSA
26
2014/12/16 rev.3
6.4.5
DSA のモニタリング方法
HLA Fusion を使用すれば、DSA のモニタリングを簡便に行う事ができます。本機能を使用するには、

該当 Sample のテストデータが解析済みである事（6.4.1 を参照）

Patient ID と Sample ID が紐付けされている事（6.4.4 を参照）

患者情報、ドナー情報、その他必要情報が入力されている事（6.4.4 を参照）
以上の条件を満たしている必要があります。
1. HLA Fusion の画面上部から Patient Info > Ab Tracking をクリックします。
2. Patient ID、Donor ID を選択します。
3. 日付を指定し、Find をクリックします。
4. データが画面中央に表示されます。モニタリングするデータにチェックします。全て選ぶ場合は、
include を右クリックでし、Select All を選択します。（しばらく時間がかかる場合があります。）
5. 必要に応じて Creatinine、Transplant、Treatment にチェックします。
6. □DQA/DPA をチェックします。最後に□ Track DSA にチェックを入れます。
画面下に HLA Class I、ClassII
の DSA のモニタリングのグラフが表示されます。
7. 画面右下の Graph Function をクリックし、Set Time Scale Interval (Days)を選択して、横軸の目盛
り間隔を調整できます。
8. グラフのエクスポートは、グラフを右クリック後、Export Graph > Line (Time Scale）を選択します。
27
2014/12/16 rev.3
6.4.6
LABScreen Single Antigen と Supplement の結合解析方法
1. 6.2 と同様に Import ファイルを行いますが、データのインポート時に、LABScreen Single Antigen 及び
Supplement のデータを同時に読み込み、チェックします。
2. Combined タブを選択し、NC 血清にチェックを入れて、Import をクリックします。
3. 解析画面上部の、□DNA にチェックを入れ、アリル毎の反応性の違いを確認します。
4. 基本的な解析方法は、通常の LABScreen Single Antigen と同様です。
（6.4.1 を参照）
28
2014/12/16 rev.3
6.4.7
レポートの作成
1. 画面上部にあるメインメニューの「Report」をクリックします。
2. 画面左部分で、レポート作成したいデータの検索を行います。データ解析した日付で検索する場合、Session
Date を選択して、Find ボタンを押します。その後、Generic Antibody＞Antibody Custom を選択します。
3. 画面右に Set Up ボタンが表示されますので、クリックします。
4. レポートに出力したい項目にチェックを入れます。ただし、患者情報やドナー情報等入力されていない情報、
Save していない解析結果等は出力されません。Report 名を入力して画面右側の Save を押して保存します。
レポートタイトル
(英数字半角 20 字まで入力
患者ＩＤ、名前
DSA 以外の陽
性抗体を黒丸
で囲みます。
アサイン
した抗体
DSA を赤丸で囲みます。
ドナー情報、DSA の有無
NC、PC 値、%PRA など
反応グラフの表示
29
2014/12/16 rev.3
5. 画面中央の Sessions タブより、解析したいデータにチェックを入れます。セッション名の横の
+
ボタン
を押すと、さらに詳細情報が表示されます。一つの検体だけ選択する事もできます。
6. View Report をクリックすると、下記の様なレポートが表示されます。
7.
画面左上のアイコンより、PDF で保存または印刷できます。
30
2014/12/16 rev.3
31
2014/12/16 rev.3
7.LABScreen Single Antigen よくある質問（FAQ）
7.1 陽性コントロールビーズ値（PC 値）が低い場合があるのですが、原因は何でしょうか？この
時どのように対処すべきでしょうか？

LABScreen には、ヒト IgG がコーティングされた陽性コントロールビーズが予め混合されおり、蛍光二次抗
体（抗ヒト IgG）がしっかりと結合しているかどうかを確認する事ができます。

PC 値が低くなる原因としては、二次抗体の劣化や、サンプルに含まれる IgM 等の阻害物質による二次抗体と
ビーズの結合阻害の影響が考えられます。通常であれば、7000- 8000 程度反応しますが、それよりも明らか
に低い値であれば注意が必要です。

全ての検体で陽性コントロールが低い場合は、二次抗体の劣化が疑われますので、新しい二次抗体をご使用
ください。二次抗体は、粉末の状態で届きますので、それを添付文書で指定された量の滅菌蒸留水（たいて
いは 1mL で希釈しますが、ロットによって異なる事がありますのでご注意下さい）で溶解後、冷蔵保存で 6
カ月以内に使用して下さい。

特定のサンプルだけ陽性コントロールが低い場合は、サンプル中に含まれる IgM による反応阻害が疑われま
すので、DTT*処理を行って下さい。DTT 処理のプロトコルは、アメリカ組織適合性学会（ASHI）で推奨され
ている方法です。
*DTT：ジチオトレイトール (dithiothreitol)
DTT 処理プロトコル（第 4 回 ASHI）
1. DTT 溶液（0.05M) 10 uL に対して血清を 90 uL 加えます。（DTT の終濃度は 0.005M）
2. しっかり混ぜた後、37℃で 30-45 分インキュベートします。
3. 1300 g で 10 分間遠心します。
32
2014/12/16 rev.3
7.2 陰性コントロール値（NC ビーズ値）が高い場合があるのですが、原因は何でしょうか？この
時どのように対処すべきでしょうか？

LABScreen には、何もコーティングさしていないラテックスビーズが予め混合されおり、ビーズ自体に対す
る非特異結合が無いかを確認する事ができます。

NC 値が高い原因としては、サンプル中にラテックスに対する抗体がある場合や、その他のタンパク質等の胸
雑物等の影響で非特異反応している事が考えられます。

免疫グロブリン療法を行っている場合には、非特異反応が高くなる可能性がありますので、30 日以上間隔を
あけてから LABScreen アッセイして下さい。

ビーズに対する非特異結合を除去するためには、Adsorb Out（商品コード：ADSORB）の使用をお勧めしてい
ます。Adsorb Out は、何もコーティングされていないビーズであり、このビーズとサンプルを先に反応させ
ることで非特異反応を除去します。ただし、全てのサンプルで非特異反応が低下するとは限りません。
Adsorb Out メーカー推奨プロトコル（1 テスト当り）
1. サンプル血清を新しい 1.5mL チューブに 30 uL 入れます。
2. Adsorb Out の入ったチューブをボルテックスします。
3. Adsorb Out ビーズを、血清を分注したチューブに 3 uL 加え、蓋を締めて軽くボルテックスします。
4. 室温で 30 分間、振とうしながらインキュベーションします。
5. 15000 rpm で 5 分間、超遠心します。
6. 上清を新しい別の 1.5 mL チューブに移します。この時、チューブ底の Adsorb Out ビーズを吸わない様
に注意します。使用したビーズは再利用できません。もし Adsorb Out ビーズが混入してしまった場合
には、再度超遠心して、上清を移します。

タンパク等による非特異反応が疑われた場合には、FBS 処理を行うとバックグラウンドが下がる場合があり
ます。
FBS 処理プロトコル（参考情報）
1. 血清 100 uL に対して FBS 3 uL を加えます。
2. 37℃で 20-30 分インキュベートし、10,000g で 20 分遠心します。
3. 中間層の血清を別のチューブに移し、LABScreen Assay に使用します。
33
2014/12/16 rev.3
7.3 プロゾーン様現象とは何でしょうか？プロゾーン様現象はどのように対応したら良いでしょ
うか？

プロゾーン様現象とは、血清中の補体成分がビーズと抗体の反応を立体的に阻害して偽陰性となってしまう
現象です。LABScreen Single Antigen ビーズにおいてプロゾーン現象が報告されています。1）
、2）
1)黒田ゆかり，小田秀隆，浅尾洋次，他：LABScreen Single Antigen におけるプロゾーン現象への補体の関与．日
本組織適合性学会，18（1）
：56―57, 2011.
2) 小島裕人，藤井直樹，二神貴臣，他：Luminex 法におけるプロゾーン様現象．日本組織適合性学会，18（2）
：157,2011.

特に新鮮血清の場合、補体の活性が高いので注意する必要があります。プロゾーン様現象を防ぐためには補
体を不活化する必要があります。

補体の不活化に関しては、DTT 処理、EDTA 処理など様々な報告がありますがメーカーとして明確な推奨プロ
トコルは残念ながら存在しませんので、各施設でご検討いただく必要があります。
（3.6.2 参照）

ただし、熱による非働化処理に関しては非特異反応が強くなる事から推奨しておりません。DTT 処理に関し
ては、ASHI で推奨されている下記のプロトコルを参照ください。
DTT 処理プロトコル（第 4 回 ASHI）
1. DTT 溶液（0.05M) 10 uL に対して血清を 90 uL 加えます。（DTT の終濃度は 0.005M）
2. しっかり混ぜた後、37℃で 30-45 分インキュベートします。
3. 1300 g で 10 分間遠心します。

また、LABScreen Single Antigen だけの検査結果を絶対視せず、他法（LABScreen Mixed/PRA、Flow PRA、
CDC クロスマッチ等）の検査結果と比較し総合的に判断する事が大切です。
34
2014/12/16 rev.3
7.4

HLA 自然抗体とは何でしょうか？HLA 自然抗体には意義があるのでしょうか？
感作歴（妊娠歴、輸血歴、移植歴）が全くない健常人でも HLA 抗体が検出された場合に、
「HLA 自然抗体」と
呼び、通常の HLA 抗体（アロ抗体）と異なると考えられています。両者の明確な区別は難しく、HLA 自然抗
体リスト（表 2）や、日本人の抗原頻度等の情報（表 3）を基に判断するしかありません。
また、HLA 自然抗体の意義に関しては、明らかになっていませんので、検査結果から除外せずに報告し、必
要に応じて「自然抗体の可能性あり」等の追加コメントがあると理解し易いでしょう。ただし、報告ルール
は各施設でご検討ください。

近年、臓器移植において患者が補体依存性 HLA 抗体を持つ場合に臓器の生着率が悪いという事が分かってき
ました。1）～3） C1qScreen と LABScreen を組み合わせて使用すれば、検出された抗体が臨床的に意義の
高い補体依存性抗体かどうかを判別する事ができると考えられます。ただし、補体非依存性の抗体に意義が
無いというという事では無く、今後さらなる研究・データの蓄積が大切と考えられます。
１）Thammanichanond, D.,Mongkolsuk T, Rattanasiri S, et al. Significance of C1q-fixing Donor-Specific
Antibodies After Kidney Transplantation. Transplant Proc, 2014; 46(2):368–71.
2）Kheradmand, T., Anthony TL, Harland RC, et al. Antibody-mediated rejection in ABO compatible husband
to wife living donor liver transplant and review of the literature. Hum Immunol. 2014.
3）Kubal CA, Mangus RS, Saxena R, et al. Crossmatch-positive liver transplantation in patients
receiving thymoglobulin-rituximab induction. Transplantation. 2014;97(1):56–63.

LABScreen Single Antigen だけの検査結果を絶対視せず、他法の検査結果と比較し、総合的に判断する事が
大切です。
表 2：メキシコの健常人に見られた HLA 抗体（Class I）
Mex：メキシコ人集団における HLA 抗原の有無、Jap：日本人集団における HLA アリル頻度
35
2014/12/16 rev.3
7.5
ネガティブコントロール血清は、メーカーの製品を使用すべきですか？

はい、メーカーであるワンラムダで販売している製品（LS-NC）をご使用することを推奨しています。

理由は、ワンラムダのネガティブコントロール血清は、LABScreen ビーズの各製品、各ロットで事前に検証
されている為です。結果は全てデータシートに記入されており、解析ソフトで解析する際は、メーカーQC
データと実際に行ったネガティブコントロール結果を簡便に比較する事ができます。
（6.4.1 参照）

これによって、操作方法にミスがないか、コンタミネーションがないかどうかを確認できます。
LABScreen ネガティブコントロール血清のデータシート
URL:http://www.onelambda.com/product-attachment.aspx?c1=antibody-detection&c2=labscreen-sup-sup
-&c3=ancillary-products-controls-&c4=3&c5=18&c6=90
メーカーデータ
測定データ
36
2014/12/16 rev.3
7.6

DQ、DP 抗体が存在する場合、どのような事に注意すれば良いですか？
近年、移植後の DQ 抗体や DP 抗体が拒絶の兆候として見られるという報告があり、DQ、DP 抗体の重要性が高
まってきています。
1.
Willicombe M, et al. De novo DQ donor-specific antibodies are associated with a significant risk of
antibody-mediated rejection and
2.
transplant glomerulopathy. Transplantation. 2012;94(2):172-7.
Devos JM, et al. Donor-specific HLA-DQ antibodies may contribute to poor graft outcome after renal
transplantation. Kidney Int 2012;82(5):598-604.
3.
Nelson KA, Youngs D, Marks MH, et al. Acute humoral rejection is associated with antibodies to HLA-DP
(Abstract). Am J Transplant 2005; 5(Suppl 11): 245.
4.
Jianxin Qiu, Junchao Cai,1 Paul I. Terasaki, et al. Detection of Antibodies to HLA-DP in Renal
Transplant Recipients Using Single Antigen Beads.

LABScreen Single Antigen Class II （製品コード：LS2A01）の DQ、DP 抗原ビーズには、それぞれ（DQA1/DQB1）
、
（DPA1/DPB1）がコーティングされており、実際には 1 ビーズにα鎖、β鎖の 2 種類の抗原が存在します。
通常は、DQB1 や DPB1 の抗原の方が、DQA1 や DPA1 よりも多型性に富んでいる為、DQB1 や DPB1 に対する抗体
が検出されやすい傾向にありますが、DQA1 や DPA1 に対する抗体も検出される事があります。

そのため、解析する際には必ず、DQA1 や DPA1 に対する特異性の解析も行う事をお勧めします。解析ソフト
HLA Fusion 3 では、DQA1 や DPA1 を容易に解析する機能があります。□DQA1/DPA1 にチェックを入れると、
DQA1、DPA1 を含めて自動で再解析を行います。
（6.4.3 参照）

ただし、DQ、DP ローカスに関してはそもそもドナー、レシピエントのタイピング情報が無い場合が多く、DSA
であるかどうかを判定できない場合があります。DR ローカスとの連鎖情報を元に DQ のタイピング情報をあ
る程度推測する事も出来ますが、必要に応じて DQ、DP のタイピングを追加実施する事をお勧めします。な
お、LABType DQ（製品コード：RSO2QT）
、LABType DP（製品コード：RSO2PT）は、DQA1/DQB1、DPA1/DPB1 を
中～高解像度でタイピングする事ができます。
37
2014/12/16 rev.3
7.7 自己抗体（患者の HLA に対する HLA 抗体）が検出されたのですが、どのように考えればよい
のでしょうか？

原則として、自己に対する HLA 抗体は産生しませんので、自己抗体が検出された場合には、結果を注意深く
見直す必要があります。

検体の取り違えが無かったかを確認してください。

検査自体がうまく行われたかを確認して下さい。特にバックグラウンド値（NC ビーズ値）を確認し、施設の
定めた基準値以下である事を確認してください。

抗原レベルでの自己抗体の場合、HLA アリルレベルで違いが無いかを確認してください。HLA Fusin の解析
画面において、□DNA にチェックを入れると、ビーズのアリル情報が確認できます。
（6.4.1 参照）

近年、アリル特異的な抗体の存在が明らかになってきており、アリルレベルでの抗体検査の重要性が高まっ
てきました。患者、ドナーの HLA アリルが LABScreen Single Antigen ClassI、Class II に含まれていな
い場合は、LABScreen Single Antigen Supplement Class I、ClassII（LS1ASP01、LS2ASP01）で追加試験を
行う事をお勧めします。
38
2014/12/16 rev.3
8.LABScreen Single Antigen 共通化プロジェクト
LABScreen Single Antigen は、簡便に HLA 特異性を同定できる画期的な試薬であり、国内外で広く使用され
ているものの、その判定基準等に関して国内外のコンセンサスは得られていませんでした。
そこで、Emory 大学の Dr.Bray 先生を中心として、
「LABScreen 国際標準化プロジェクト」が行われました。
Phase 1 として、各施設間での独自のプロトコルで同一検体を測定した場合に、結果にどれほどのばらつき
が生じているかを検討しました。Phase2 にて、全施設で共通プロトコルを用いることで、ばらつきがどの程
度抑えられるかの検証が行われました。本プロジェクトの結果は、2011 年第 16 回国際組織適合性学会にて
結果報告され、プロトコルを標準化することで結果のばらつきが改善される事が分かりました。
そこで、日本においても 2012 年より「共有化プロジェクト」と題して同様の検討を行い、Dr.Bray 先生及び
日本国内の主要臓器移植施設 5 施設の先生方のご協力のもと、各施設間でのばらつきや、海外のデータとの
比較を行いました。本プロジェクトでは、Dr.Bray 先生より「LABScreen 国際標準化プロジェクト」で使用
したものと同一の血清をご提供頂き、メーカープロトコルに従って実施しました。その結果、日本国内の各
施設のデータは、非常にばらつきが小さく、世界のデータに遜色ないデータが得られました。
追加実験として、LABScreen Single Antigen が、各施設においてどれくらい日差再現性、同時再現性がある
も検討し、各施設内での日差再現性、同時再現性は非常に高い結果が得られました。共通のメーカープロト
コルを用いることで、精度の高いデータを得る事が可能であり、異なる施設間のデータや、国内と世界での
データの比較、議論は十分可能であるということが示されました。
上記「共有化プロジェクト」に関して、福岡赤十字病院橋口裕樹先生が 2014 年第 47 回日本臨床腎移植
学会にて「LABScreen Single Antigen 共有化プロジェクト
〜日本における Single Antigen、MFI の QC 報
告〜」として発表されています。
39
2014/12/16 rev.3
9.付録：操作手順書
実施日：
年
月
日
実施者名：
項目名
前処理
説明
確認欄
検体（血清または血漿）を凍結融解、しっかり転倒混和。
8000～10000 g で 10 分間遠心。不純物が多い検体は遠心速度、時間を増
やす。
遠心後、慎重に中間層から検体を回収。
試薬調整
96 ウェルプレートの最初のウェルに陰性血清 20 uL を添加。
2 番目のウェルから、前処理済みの検体 20 uL を添加。
LABScreen ビーズを軽くスピンダウンし、蓋の裏に付いた液を落とし、
数秒間ボルテックス。
キャップを開け、10 回程度ピペッティングをして LABScreen ビーズをよ
く混合。
ビーズ 5uL ずつ検体が入った各ウェルに入れ、ピペッティング。
1 回目の反
トレーシールを貼り、遮光し、室温（20-25℃）で振とう、30 分間反応。
応
反応中に、蒸留水で 10 × Wash Buffer を蒸留水で 10 倍希釈。
1×Wash buffer は 1 検体あたり全部で約 1.1 mL。
洗浄操作
①各ウェルに 1 × Wash buffer を加える。
1回
2回
3回
（合計 3 回）一回目洗浄：150uL、2・ 3 回目洗浄：200uL
トレーシールを貼り 1300 g で 5 分間（または 1500g で 3 分間）遠心。
★
②トレーシールを剥がし、フリッキングして上清を除去。
フリッキングは真下に力強く一回のみ行う。
③フリッキング後、トレーを下向きにしたままキムタオルに 5 秒間押し
付け軽く 5 回タップし、残液を除去。
④ビーズのみの状態で、ビーズがほぐれる程度（約 2 秒～5 秒程度）ボ
ルテックス。かけすぎない様に注意。
二次抗体の
3 回目の遠心時（★）に、1 テストにつき 100uL の希釈二次抗体を作成。
調整
1 テスト当たり、1uL の二次抗体を 1 × Wash Buffer 99uL に加える。
二次抗体の
洗浄操作終了後、希釈二次抗体 100uL を各ウェルに加える。
反応
トレーシールを貼り、遮光し、室温（20-25℃）で振とう、30 分間反応。
LABScan システム、または LABScan 3D システムの電源を入れる。
40
2014/12/16 rev.3
洗浄操作
インキュベーション後、洗浄バッファーは加えず、そのまま 1300 g で 5
（合計 2 回）分間（または 1500g で 3 分間）遠心。
0回
1回
2回
①真下に力強く一回のみフリッキングして上清を除去。
②フリッキング後、トレーを下向きにしたままキムタオルに 5 秒間押し
付け軽く 5 回タップし、残液を除去。
③ビーズのみの状態で、ビーズがほぐれる程度（約 2 秒～5 秒程度）ボ
ルテックス。かけすぎない様に注意。
④1 × Wash buffer 200uL を各ウェルに添加。
1300g で 5 分間（または 1500g で 3 分間）遠心。
洗浄終了後に、1 × PBS 80uL を各ウェルに加える。
測定機器の
LABScan システムのマニュアルに従い、ウォームアップ、プライム、ア
設定等
ルコール洗浄、蒸留水によるプローブ洗浄等を行う。
専用の補正ビーズを用いてキャリブレーションを行う。
使用した試薬、ロット、サンプル名等の情報を基に、測定用バッチを作
成し、測定を開始する。
すぐに測定できない場合は、シールを貼り冷蔵庫で保管して、24 時間以
内に測定する。
時間がたった場合には、測定直前に各ウェルをしっかりとピペッティン
グ等で混合する。
測定終了後、LABScan システムを、サニタイズ、洗浄操作 3 回以上行っ
た後、シャットダウンする。
41
2014/12/16 rev.3
42
2014/12/16 rev.3
日本総代理店
2014/12/16 rev.3
ROLM-14-0364

Download Report