KURENAI : Kyoto University Research Information Repository Title Author(s) Citation Issue Date URL ヘビ血液由来ホスホリパーゼA2阻害タンパク質に関する 研究( Abstract_要旨 ) 奥村, 幸治 Kyoto University (京都大学) 2000-03-23 http://hdl.handle.net/2433/181186 Right Type Textversion Thesis or Dissertation none Kyoto University 氏 名 藁 指 嘉 ( 薬 学) 学位 ( 専攻分野) 博 学 位 記 番 号 論 薬 博 第 6 2 7号 学位授与 の 日付 平 成 1 2年 3 月 2 3日 学位授与 の要件 学 位 規 則 第 4条 第 2項 該 当 学位論文題 目 へ ど血 液 由来 ホ ス ホ リパ ーゼ A2阻 害 タ ンパ ク質 に関 す る研 究 論文調査委員 教 授 川 寄 敏 祐 ( 主 士 事 査) 論 教 授 市 川 文 内 容 の 厚 要 教 授 伊 藤 信 行 旨 ホスホ リパ -ゼ A2( PLA2 )は,グ リセロ リン脂質の s n-2位のア シル鎖を加水分解する酵素である｡この酵素は食餌中の リン脂質の消化 あるいは生体膜中の リン脂質の代謝 に関わるとともに, プロスタグランジンなどの脂質 メディエーターの産 生 に至 るアラキ ドン酸 カスケー ドの開始酵素 と して重要な働 きを もっている｡ クサ リへ ど科 に属する中国マムシの血液は, PLA2と直接結合 して活性 を阻害す る 3種類の タンパ ク質 ( PLI α,PLI β,PLI γ )を含んでいる｡PLI αは,Ca2+依存性 CRD 0kDaのサ ブユニ ッ トのホモ三量体であり, 1分 ( car bohydr at eRe c ogni t i onDomai n)様 ドメイ ンと糖鎖 を もっ分子量 2 I型酸性 pLA2と結合 して活性 を阻害す る｡PLU は,PLI aや PLI rとは異なる構造の PLIであ り,糖鎖をもつ分子量 子の I 5 0kDaのサ ブユニ ッ トか ら成 り, 3分子の Ⅰ Ⅰ型塩基性 PLA2と結合 して活性を阻害す る｡ また, PLI γは分子量 2 5kDaと 2 0kDaの 2種類 のサ ブユニ ッ トか ら成 る糖 タ ンパ ク質 である｡PLI γは 1 分 子のヘ ビ毒 由来 Ⅰ型 PLA2 ,ヘ ビ毒由来 Ⅰ Ⅰ型 PLA2および-チ毒 Ⅰ Ⅰ Ⅰ型 PLA2と結合 して活性 を阻害する｡このよ うに,タンパ ク質 としての基本的性質 は明 らかとなって いるが,分子生物学的解析 はほとん ど行われてお らず, また,PLI βや PLI γについてはその一次構造やサブユニ ット構造 も 明 らかにされていない｡ 申請者 は,中国 マム シ血液 由来 pLl βと PLI rの全一次構造 を明 らか にす るとともに PLI αの発現系 を確立 し,PLI aと PLA2との相互作用の機構の解析を行 った｡ さ らに,毒を もたない シマヘ ビか らも 3種類の PLIと相同性を示す タンパ ク質 を精製 し,生化学的および分子生物学的解析を行 い,以下の成果を得た｡ 第 1章 へ ど由来 PLA2阻害 タンパ ク質の生化学的および分子生物学的解析 既 に明 らかにされている中国マム シ血液由来の PLI α( Ab s PLI α) のア ミノ酸配列 に基づ き, RTPCR を行い, これをプ ローブと して中国 マム シ肝臓 由来 c DNA ライブラ リーより c DNA を単離 した. これか ら予想 されるア ミノ酸配列を既に明 らかにされているもの と比較 したところ, 5残基のア ミノ酸置換が見 られた｡ 今回解析 した中国マムシか ら新たに PLI αを 精製 してそのア ミノ酸配列 を確認 し,さ らに,RTPCR産物のダイ レク トシーケ ンスを行 ったところ,今回得 られた c DNA に相当す る配列のみが得 られた｡中国マム シの分類 については議論 の余地があり, ここに見 られたア ミノ酸配列の違いは, 亜種 による違 いであると考え られ る｡ 次 に,中国マム シ PL岬 ( Ab s PLI β)を精製 し,その内部 ア ミノ酸配列 に基づいて c DNA をクロ-ニ ング し,その全一次構 造 を決定 した｡その結果,Ab s PL岬 は ヒ ト血祭由来 l e uc i ne r i c hα2 gl yc opr ot e i n( hLRG) と 3 3 % の相同性を もっことが わか った｡ この タンパ ク質 には hLRG と同様 に 2 4残基か ら成 る LRR ( l e uc i ne r i c hr e pe at )構造の 9回繰 り返 し構造があ り, C末端付近 には LRR構造 を もつ タンパ ク質 に特有の Cys残基パ ター ンが存在す るが, N末端付近 にはそのような配列 は存在せず,Pr o残基 に富む特徴的な配列がみ られた｡また,架橋実験 よりAb s PLI βはホモ三量体であることがわか った｡ Ab s PL岬 は 3分子 の PLA2と結合す ることか ら, 各 々のサブユニ ッ トが 1分子の PLA2と結合すると考え られた｡ LRR構 造 を もつ RNas eイ ンヒビターが馬蹄型構造を もつので, Ab s PLW のサブユニ ッ トも同様な高次構造を もっ と推定 される｡ このように Ab s PLI βは既 に構造が明 らかにされている PLI aや PLI r , さらに, アネキ シンファミリーに属する リポコルチ ン類 とは異 なる新規 な PLA2阻害 タンパ ク質であることが明 らか となった｡ -1 5 9 8 - 次 に,中国マム シ PLI r( Ab s PLI r )を精製 し,得 られた各サ ブユニ ッ トの内部 ア ミノ酸配列 に基づいて 2 5kDaと 2 0kDa サブユニ ッ トに相当す る c DNA を クローニ ング した｡その結果,各サブユニ ッ トは互 いに高 い相同性を示すが異なるア ミノ 酸配列 を もつ ことがわか った｡各 サ ブユニ ッ トにはウロキナーゼ受容体やヘ ビ毒 由来サイ トトキ シン/ニューロ トキ シン ファ ミリーが属す る Ly-6スーパ ーファ ミリーの タンパ ク質 に特徴的な三つ指構造の 2回繰 り返 し構造がみ られ, すでに明 らか にされているタイ コブラ由来 PLI rや エ ラブウ ミ- ど由来 pLI rなどと高 い相同性があることか ら,AbsPLI γはこれ ら と同様 にヘテロ三量体であることが推定 され る｡ PLIは自らの毒液 に対す る防御機構の一つの因子 として機能 していると考え られていたが, サザ ン-イブ リダイゼ- ショ ンの結果か ら,毒のない シマヘ ビに も PLIと類似の タンパ ク質が存在す ることが示唆 されたので, PLA2に対す る阻害活性 を指標 として シマヘ ビ血液 より 2種類の タンパ ク質を精製 した｡ これ らの タンパ ク質の特異性 を調べたところ, Ⅰ Ⅰ型塩基性 pLA2に特異的な タンパ ク質 と,Ⅰ型,Ⅰ Ⅰ型 ,Ⅰ Ⅰ Ⅰ型 pLA2を阻害す るタンパ ク質であ った｡精製標品の内部 ア ミノ酸配列 を も とに RTPCR を行 い, シマヘ ビ肝臓 由来 cDNA ライブラリーを用 いて c DNA クローニ ングと塩基配列の解析を行 った｡そ の結果,I I型塩基性 PLA2を特異的に阻害す るタンパ ク質 はAbsPL岬 と,I型,Ⅰ Ⅰ型,I I I型 PLA2を阻害す るタンパ ク質 は AbsPLI γと各 々相同性 を示す タンパ ク質であることがわか った｡ また, シマヘ ビ血液 にはAbsPLI αと免疫交差性を示す タ ンパ ク質の存在が示 されたので,次 に本 タンパ ク質を精製 しその阻害活性 を調べたが,種 々の毒由来 PLA2とは結合せず阻 害活性 を示 さなか った｡また,c DNA クローニ ングを行 ったところ,この タンパ ク質 はAbsPLI α と高 い相同性 を示 した｡さ らに, ノーザ ン-イブ リダイゼー ションの結果, これ らの 3種類の PLIは肝臓で発現 し,他の組織では発現 していないこと α様 タンパ ク質の生理的機能 は不明であるが, 毒腺や種 々の酵素を含む Duver noy腺 さえ もない シマ- ど がわか った｡ PLI に も PLIやその類似 タンパ ク質が存在す ることか ら,これ らの タンパ ク質 は,単 に毒液に対する自己防御機構の因子 として 機能す るだけでな く,他の重要 な生理的役割を も果た しているのではないか と考え られる｡ 第 2章 中国マムシ由来 PLA2阻害 タンパ ク質 と PLA2の相互作用の解析 PLI aと PLA2の相互作用の機構を明 らかにす るために, I I型酸性 PLA2をはぼ特異的に阻害す るAb sPLI aの大腸菌を用 s t agを N末端 に付加 したAbsPLI α( r PLI αf p) と天然型のア ミノ酸配列を もっ組換え型 AbsPLI α いる発現系を確立 し,Hi ( r PLI α) を得た｡次 に,r PLI αf pのア ミノ酸配列内に PLA2阻害活性のないシマヘ ビ由来 pLI α様 タンパ ク質 に特徴的なア ミノ酸残基を導入 した変異型 PLI αを作製 し, Ⅰ Ⅰ型酸性 PLA2に対す る阻害活性 を解析 した結果, PLI αの可変領域の As n- -1 4 6を中心 とす る複数のア ミノ酸残基が結合に関与す ることがわか った｡ 2 6と,CRD様 ドメイ ンの C末端近傍の Tyr 以上の研究 は,毒- どの血液 由来 PLA2阻害 タンパ ク質の基本的性質 に加え,無毒ヘ ビの血液由来 pLA2阻害 タンパ ク質 αと PLA2の作用機構 を解析 した もので やその類似 タンパ ク質の基本的性質 を比較検討 し, さらに組換え技術を用 いて PLI あ り, .PLA2が関連す る病態の解析やその治療薬 としての応用の可能性 を示 したものである｡ 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 ホスホ リパ ーゼ A2( PLA2 ) はグ リセロ リン脂質の s n-2位の脂肪酸 エステルを加水分解 して遊離脂肪酸 と リゾ リン脂質 を産生す る酵素の総称である｡PLA2はその局在性,分子量 ,Ca2+要求怪,基質特異性などに基づいて,分泌型,細胞質型, Ca2 十非依存型および PAF-アセチル ヒ ドロラーゼの 4群 に分類 される｡ 分泌型 pLA2は動物肺臓のほか- ど毒 に多 く含 ま れ る｡ 一方, 毒 ヘ ビの血液 には, PLA2と結合 してその活性を阻害す る 3種類の PLA2阻害 タンパ ク質 ( PLA2 i nhi bi t or , PLI ),PLI α,PLI β,PLI γが含 まれている｡ これ らの PLIは毒液中の PLA2に対する自己防御機構の一つの因子 と考え られ ている｡ 本研究では,中国マムシ肝臓 由来の c DNA ライブラリーか ら,PLI α,PLI βおよび PLI γの c DNA のクローニ ングに成功 し, それ らの塩基配列 を決定す ることによ りタ ンパ ク質の全一次構造 を決定 した｡PLI αは 1 6 6個 のア ミノ酸 よ りな り, Ca2+依存性糖結合 ドメイ ン ( CRD) と類似の ドメイ ン構造を もつ 2 0kDaの糖 タンパ ク質であった｡PL岬 は 3 01個のア ミ ノ酸残基 よりなる 3 5kDaの タンパ ク質であ った｡ 本分子 は ヒ ト血清由来の l e uc i ne r i c h α2-gl yc opr ot e i n ( hLRG) と 3 3% の相同性を示 し,hLRG と同様 に,2 4残基 よ り成 る LRR( l euci ne r i c hr e pe at )構造の 9回繰 り返 し構造を もち,また, C一末端付近 には LRR構造 を もつ タ ンパ ク質 に特有の Cys残基パ ター ンが, N-末端付近 には Pr o残基 に富む特徴的な配列 がみ られた｡RNa s eイ ンヒビターなど LRR構造 を もつ他の タンパ ク質 は馬蹄型 の高次構造 を持っ ことが知 られているの -1 5 9 9 - で,PL岬 も同様 な立体構造 を持つ もの と推定 された｡PLI γは 2 5kDaと 20kDaの 2種 のサ ブユニ ッ トか ら構成 され るヘテ ロ 3量体 であ ることが示 された｡両 サ ブユニ ッ トはア ミノ酸 レベルで 2 6 . 5% の相同性 を持 ち,いずれ も 2 00個 のア ミノ酸残 基 よ り成 る｡これ らのサ ブユニ ッ トは Ly-6スーパ ーフ ァ ミリーに特徴的 な Cys残基パ ター ンの 2回繰 り返 し配列を持 ち, hr e ef i nge r構造 を持っ ことが示 された｡なお,ノーザ ン分析 の結果か ら,これ らの PLIはいず 特徴的な β-シー トか ら成 る t れ も,肝臓 で生合成 され,血中に移行す ることが示 され た｡ また,本研究で は毒 を持 たない シマ- どの血液中に も,PLI βと PLI γに相 当す る PLA2阻害 タンパ ク質が存在す ること, α と一次構造上 の高 い相同性 を持 ちなが ら, PLAZ阻害活性 を持 たない PLI α様 タ ンパ ク質の存在 も明 らか とな っ また, PLI た｡ これ らの結果 は, PLIが これ まで知 られていない新 しい生理的機能 を果 た している可能性 を示 している｡ 以上 の研究 は, ヘ ビ毒血液由来の PLA2阻害 タ ンパ ク質 の タ ンパ ク質化学的諸性質を明 らか にす るとともに, その機能 に 関 してい くつかの新 しい知見 を得 た ものである｡ よ って本論分 は博士 ( 薬学) の論文 と して価値 あるもの と認 める｡ 更 に, 2年 1月 1 8日論文内容 とそれ に関連 した口頭試問を行 った結果合格 と認 めた｡ 平成 1 -1 6 0 0 -
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