Human 制御性T細胞のマルチカラー解析 L E G E N D A p p l i c a t i o n N o t e v o l . 1 大阪大学免疫学フロンティア研究センター 実験免疫学 西川 博嘉 杉山 大介 はじめに マルチカラーフローサイトメーターを用いた解析により、様々な細胞分画における特異的な分子発現の解析が可能となった。 しかし正確な解析 には、CD4/CD8といった各々の細胞マーカーによるT細胞分画の正確な同定と対象分子の発現レベルに応じた適切な蛍光色素の選択が欠か せない。本アプリケーションノートでは、私達の研究室で行っているヒト制御性T細胞の解析方法についてTIPSを含めて紹介したい。 ヒト制御性T細胞の染色 CD4+制御性T細胞（Treg）は自己に対する免疫応答を抑制し、 自己免疫寛容において中心的役割を担うT細胞集団である。1995年特異的 マーカーとしてIL-2レセプターα鎖（CD25） が見出され、 その後Tregのマスター遺伝子である転写因子Foxp3が同定され、 それらの分子発現に よりTregが定義されている。 しかし、 ヒトではFOXP3-CD4+ナイーブT細胞の活性化によってもFOXP3の発現が誘導されることが明らかになり、 Tregの定義が混乱していた。 ナイーブ T細胞のマーカーの一つであるCD45RAとFOXP3の発現を組み合わせて解析することで、FOXP3+T 細胞を次の3つの分画に分けることができる❶CD45RA+FOXP3lowCD4+T細胞（ナイーブ型Treg）、❷CD45RA-FOXP3highCD4+T細胞 （エフェクター型Treg） 及び、 ❸FOXP3陽性細胞であるが免疫抑制活性を持たないCD45RA-FOXP3lowCD4+T細胞 （non-Treg） （Miyara, et al., immunity. 30, 899-911, 2009）。 ここではマルチカラーフローサイトメーターを駆使したこれらのヒトTreg解析方法を示す。 a） 6カラー染色法 ● PerCP/Cy5.5 anti-human CD3 ● Zombie NIR™ Fixable Viability Kit ● PE anti-human FOXP3 ● FITC anti-human CD45RA ● PE/Cy7 anti-human CD4 染色 染色コントロール FSC-A FSC-A CD3 PerCP-Cy5.5 持たない。 CD45RA-FOXP3lowCD4+T細胞 （non-Treg） FITC CD45RA 〈FOXP3陽性細胞〉 ❸ FOXP3陽性細胞であるが免疫抑制活性を 〈CD4陽性細胞〉 FOXP3 PE 〈FOXP3陽性細胞〉 FITC CD45RA 〈CD3陽性細胞〉 SSC-A SSC-A FCS-H FSC-A 〈リンパ球〉 SSC-A 〈生細胞〉 APC-Cy7 Viability Dye 〈単一細胞群〉 CD4 PE-Cy7 FOXP3 PE APCにて 目的分子を染色 ❶ CD45RA+FOXP3lowCD4+T細胞 （ナイーブ型Treg） 胸腺から供給されたばかりのFOXP3陽性 細胞。 免疫抑制活性をもち、 抗原刺激により エフェクター型Tregとなる。 ❷ CD45RA-FOXP3highCD4+T細胞 （エフェクター型Treg） 抗原刺激により活性化され、分化した FOXP3陽性細胞。強い免疫抑制活性をもつ。 ヒトPBMCをマルチカラー染色したデータを示す。 a）b） それぞれの解析では、 FSC-AとFSC-Hによりdoublet細胞を除去した後にviability dyeを 用いて細胞の生死を判別する。 このようにして得られた生細胞からFSC-AおよびSSC-Aによりリンパ球集団を分離する。 さらにCD3およびCD4 染色によりCD4+T細胞集団をゲートして、 CD45RAおよびFOXP3発現を検討する （Sugiyama, et al., PNAS. 110, 17945-17950, 2013） 。 さらに、 FOXP3+CD4+T細胞における分子発現も検討できる。 a） 6カラー染色ではCD4+T細胞をCD45RA/FOXP3発現により分画できるが、 使用できる色素が限定されるため、 これらの細胞分画の分子発現は一種類しか検討できない。 またCD8やCD25をアッセイする場合はこれらの 分子検討はできない。 しかし、b）8カラー以上の染色ではCD4+T細胞をCD45RA/FOXP3で分画したのち、 さらに3つ以上の分子を同時に 検討することができる。 L E G E N D A p p l i c a t i o n N o t e v o l . 1 b） 8カラー以上の染色法 FSC-A FSC-A 〈CD4陽性細胞〉 CD3 Alexa Fluor 700 〈FOXP3陽性細胞〉 CD4 PerCP-Cy5.5 SSC-A FCS-H FSC-A 〈CD3陽性細胞〉 PE-Cy7 CD8 〈リンパ球〉 SSC-A 〈生細胞〉 APC-Cy7 Viability Dye 〈単一細胞群〉 CD4 PerCP-Cy5.5 FOXP3 PE Count FITC CD45RA 〈CD4陽性細胞〉 FOXP3 PE CD25 BV605 CTLA-4 APC PD-1 BV421 ● PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 ● PE/Cy7 anti-human CD8 染色 ● Brilliant Violet 421™ anti-human CD279（PD-1） 染色コントロール ● FITC anti-human CD45RA ● PE anti-human FOXP3 ● Brilliant Violet 605™ anti-human CD25 ● Alexa FluorⓇ 700 anti-human CD3 ● Zombie NIR™ Fixable Viability Kit 各種蛍光色素による染色パターンの違い 21.0% 15.6% 26.3% 9.3% 21.0% 15.6% PE APC BV421 BV605 Count Count 10.1% 6.8% 10.1% 6.8% PE-Cy7 CD4 9.3% PE-Cy7 CD4 26.3% PE CD25 BV421 FOXP3 ヒト末梢血単核球中のCD3+CD4+T細胞を各種蛍光抗体で染色し、 フローサイトメーターにて解析した。上図ではCD25を各々の蛍光色素で 染色し、 その染色パターンを解析したデータを示す。蛍光強度が強いPEあるいはBrilliant Violet 421による染色ではCD25は十分に染色され、 CD25陽性細胞は適切に同定できた。一方で、蛍光強度がやや劣るAPCあるいはBrilliant Violet 605による染色では、上記2蛍光色素に比べ CD25陽性細胞画分が少なくなった。 右図にFOXP3を2種類の蛍光色素で染色した結果を示す。 こちらは、 蛍光強度が同等に強いといわれている Brilliant Violet 421にて染色するよりもPEにて染色したほうが、 FOXP3陽性細胞分画が適切に同定された。 以上の様に評価したい分子の分子発現が弱い場合の蛍光色素の選択の重要性をCD25およびFOXP3を代表例として示した。 フローサイトメー ターにて解析する場合は、分子の発現レベルにより適した蛍光色素を使用する必要があり、中でもPEあるいはBrilliant Violet 421といった 蛍光強度の強い色素が、 発現レベルの低い分子を解析するのに適していると考えられる。 一方でFOXP3のように染色が難しい分子もあり、 各々の 分子での適切な蛍光色素の選択が正確なフローサイトメーターの解析には必須である。 執筆者紹介 氏名：西川 博嘉（にしかわ ひろよし） 所属：大阪大学 免疫学フロンティア研究センター 実験免疫学 特任准教授 経歴：1998年-2002年: 三重大学大学院医学研究科内科学専攻博士（医学） 2002年-2003年: 三重大学医学部附属病院 内科医員 2003年-2006年: Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Ludwig Institute for Cancer Research, リサーチフェロー 2006年-2010年: 三重大学大学院医学系研究科 病態解明医学講座がんワクチン治療学 講師 2010年-現 在: 大阪大学 免疫学フロンティア研究センター 実験免疫学 特任准教授 2012年-現 在: Department of Oncology, Roswell Park Cancer Institute, Adjunct Associate Professor 関連製品リスト（一部抜粋） カタログ番号 製品名 Clone Tregキット製品 One Step Staining Mouse Treg Flow™ Kit 136801 MF-14 （FOXP3 Alexa FluorⓇ 488/CD25 PE/CD4 PerCP） Mouse Treg Flow™ Kit 320018 150D Ⓡ （FOXP3 Alexa Fluor 488/CD4 APC/CD25 PE） 320019 320022 320121 320401 361801 PE anti-mouse/rat/human FOXP3 Flow Kit One Step Staining Human Treg Flow™ Kit （FOXP3 Alexa FluorⓇ 488/CD25 PE/CD4 PerCP） Human Treg Flow™ Kit （FOXP3 Alexa FluorⓇ 488/CD4 PE-Cy5/CD25 PE） Human Treg Flow™ Kit （FOXP3 Alexa FluorⓇ 488/CD4 PE-Cy5/CD25 PE） Rapid Human Treg ID Kit （FOXP3 Alexa FluorⓇ 488/CD4 APC/CD25 PE/CD3 PerCP/Cy5.5） サイズ 価格（円） カタログ番号 製品名 Clone サイズ 価格 （円） PerCP/Cy5.5-CD3 抗体製品 25 tests ¥100,000 25 tests ¥90,000 150D 25 tests ¥65,000 150D 25 tests ¥90,000 206D 25 tests ¥100,000 259D 25 tests ¥90,000 206D 25 tests ¥90,000 PE-FOXP3 抗体製品 126403 PE anti-mouse FOXP3 MF-14 25 μg ¥33,000 126404 PE anti-mouse FOXP3 MF-14 100 μg ¥65,000 320007 PE anti-mouse/rat/human FOXP3 150D 25 tests ¥33,000 320008 PE anti-mouse/rat/human FOXP3 150D 100 tests ¥65,000 320107 PE anti-human FOXP3 206D 25 tests ¥30,000 320108 PE anti-human FOXP3 206D 100 tests ¥62,000 320207 PE anti-human FOXP3 259D 25 tests ¥30,000 320208 PE anti-human FOXP3 259D 100 tests ¥62,000 FITC-CD45RA 抗体製品 304105 FITC anti-human CD45RA HI100 25 tests ¥9,300 304106 FITC anti-human CD45RA HI100 100 tests ¥21,200 BV605™-C25 抗体製品 302631 Brilliant Violet 605™ anti-human CD25 BC96 25 tests ¥43,000 302632 Brilliant Violet 605™ anti-human CD25 BC96 100 tests ¥78,000 102035 Brilliant Violet 605™ anti-mouse CD25 PC61 125 μl ¥41,000 102036 Brilliant Violet 605™ anti-mouse CD25 PC61 50 μg ¥49,000 APC-Helios 抗体製品 137221 APC anti-mouse/human Helios 22F6 25 tests ¥35,000 137222 APC anti-mouse/human Helios 22F6 100 tests ¥69,000 APC-CD357（GITR）抗体製品 100218 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD3 17A2 100 μg ¥44,500 300328 PerCP/Cy5.5 anti-human CD3 HIT3a 100 tests ¥65,000 300430 PerCP/Cy5.5 anti-human CD3 UCHT1 100 tests ¥65,000 317336 PerCP/Cy5.5 anti-human CD3 OKT3 100 tests ¥39,000 344808 PerCP/Cy5.5 anti-human CD3 SK7 100 tests ¥66,000 Alexa Fluor700Ⓡ-CD3 抗体製品 100216 Alexa FluorⓇ 700 anti-mouse CD3 17A2 100 μg ¥31,500 300324 Alexa FluorⓇ 700 anti-human CD3 HIT3a 100 μg ¥45,000 300424 Alexa FluorⓇ 700 anti-human CD3 UCHT1 100 μg ¥45,000 317340 Alexa FluorⓇ 700 anti-human CD3 OKT3 100 tests ¥45,000 344822 Alexa FluorⓇ 700 anti-human CD3 SK7 100 tests ¥45,000 PE/Cy7-CD4 抗体製品 100421 PE/Cy7 anti-mouse CD4 GK1.5 25 μg ¥12,200 100422 PE/Cy7 anti-mouse CD4 GK1.5 100 μg ¥29,700 100527 PE/Cy7 anti-mouse CD4 RM4-5 25 μg ¥12,200 100528 PE/Cy7 anti-mouse CD4 RM4-5 100 μg ¥27,500 116015 PE/Cy7 anti-mouse CD4 RM4-4 25 μg ¥16,000 116016 PE/Cy7 anti-mouse CD4 RM4-4 100 μg ¥36,000 317413 PE/Cy7 anti-human CD4 OKT4 25 tests ¥22,100 317414 PE/Cy7 anti-human CD4 OKT4 100 tests ¥45,000 344611 PE/Cy7 anti-human CD4 SK3 25 tests ¥29,000 344612 PE/Cy7 anti-human CD4 SK3 100 tests ¥57,000 PerCP/Cy5.5-CD4 抗体製品 100433 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 GK1.5 25 μg ¥16,200 100434 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 GK1.5 100 μg ¥44,500 100539 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 RM4-5 25 μg ¥16,200 100540 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 RM4-5 100 μg ¥44,500 126311 APC anti-mouse CD357（GITR） DTA-1 25 µg ¥19,000 126312 APC anti-mouse CD357（GITR） DTA-1 100 µg ¥45,000 116011 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 RM4-4 25 μg ¥17,000 311609 APC anti-human CD357（GITR） 621 25 tests ¥29,000 116012 PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD4 RM4-4 100 μg ¥43,000 311610 APC anti-human CD357（GITR） 621 100 tests ¥65,000 300529 PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 RPA-T4 25 tests ¥19,000 300530 PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 RPA-T4 100 tests ¥37,000 317427 PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 OKT4 25 tests ¥17,000 317428 PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 OKT4 100 tests ¥39,000 BV421™-PD-1 抗体製品 135217 Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD279（PD-1） 29F.1A12 125 μl ¥37,000 135218 Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD279（PD-1） 29F.1A12 500 μl ¥73,000 329919 Brilliant Violet 421™ anti-human CD279（PD-1） EH12.2H7 25 tests ¥37,000 329920 Brilliant Violet 421™ anti-human CD279（PD-1） EH12.2H7 100 tests ¥73,000 BV421™-& APC-GAPR（LRRC32）抗体製品 352509 Brilliant Violet 421™ anti-human GARP（LRRC32） 7B11 25 tests ¥39,000 352505 APC anti-human GARP（LRRC32） 7B11 25 tests ¥27,000 352506 APC anti-human GARP（LRRC32） 7B11 100 tests ¥62,000 APC-CD153（CTLA-4）抗体製品 死細胞除去製品 （Zombieシリーズ） 423105 Zombie NIR™ Fixable Viability Kit 100 tests ¥15,000 423106 Zombie NIR™ Fixable Viability Kit 500 tests ¥57,000 Treg解析用バッファー製品 421401 FOXP3 Fix/Perm Buffer（4x） 30 ml ¥12,000 FOXP3 Perm Buffer（10x） 25 ml ¥12,000 FOXP3 Fix/Perm Buffer Set 100 tests ¥24,000 349907 APC anti-human CD152（CTLA-4） L3D10 25 tests ¥20,000 421402 349908 APC anti-human CD152（CTLA-4） L3D10 100 tests ¥48,000 421403 BioLegend Japan 株式会社 トミーデジタルバイオロジー株式会社 東京都文京区根津1-4-6 SBビル8階 TEL：03-3823-9071 URL：http://www.biolegend.com/jp 〒110-0008 東京都台東区池之端2-9-1「エッジ」 ビル TEL.03-5834-0843／FAX.03-5815-0813
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