KOA-Facility利用報告書 ■利用者名株式会社ＤＮＡチップ研究所 ■課題名自己免疫疾患におけるスプライス•ヴァリアントの網羅的解析とその発現機序解明に関する研究【概要】１）本課題で得られた具体的な成果今回、全身性エリテマトーデス(SLE)および関節リウマチ(RA)患者におけるスプライス•ヴァリアントの網羅的解析とその発現機序解明を行った。分類基準を満たす活動性SLE3例、RA3例、HC6例のミクスチャーの末梢血を採取ののち、比重遠心法で単核球に分離した。表1 サンプルレーン総リードペア QFリードペア SLE-1 1 58,445,667 34,206,176 SLE-2 2 48,590,454 36,594,797 SLE-3 3 62,757,986 34,321,968 RA-1 5 63,071,805 30,885,159 RA-2 6 55,635,996 37,222,254 RA-3 7 59,621,823 33,441,897 HC 8 58,583,146 33,300,226 そこからtotalRNAを精製した。Illumina GAIIx を用いHigh throughput sequencing(mRNAseq)を行うため、ライブラリーの準備をし、クラスターを作成し、ペアエンドシークエンスを行った。計7レーン (SLE-1,2,3, RA1,2,3, HC)の検体およびコントロールとしてファイエックスを置いた。総リードペア、QFリードペアを表1に示す。いずれも5000-6000万リードのデータが取得されており、平均depthも30前後と十分なカバレッジを持つデータが得られた。各リードよりアダプタ配列を探索、トリミングののちTopHatによりヒトゲノムにマッピングを行った。ゲノム配列はUCSC hg19を使用した。エキソンごと、サンプルごとにリードカバレッジを算出。エキソン情報は、 UCSC RefGene (RefSeq由来)を参照した。サンプル特異的な領域の探索を行ったところ、一例としてHAUS5遺伝子のエクソン5領域にRA例で著明な発現低下が確認された。SLEおよび健常人プールにおいては上記の変化は認めなかった。HAUS5は、19番染色体に位置し、Augmin複合体を形成する分子のサブユニットで、紡錘糸形成過程における微小管形成に関与していることが報告されている。しかししながら RAを含めた自己免疫疾患におけるHAUS5の役割は明らかではない。本解析より得られたスプライス•ヴァリアントがRAにおいてどのような役割をしているかは、深いところであり、他のRAのmRNAにおいて同様のことが起こっているか確認中である。また各遺伝子ごとの発現量の解析を、各エクソンごとに行い、スプライスバリアントの生成がどのような分布になっているかについて引き続き詳細な解析を行っている。 2）社会・経済への波及効果の見通し本研究課題は、これまで全く手つかずであった領域に関して、最先端テクノロジーの導入によりようやく近づくことができている。予算はかかるかもしれないが、最先端の研究を進めていくことが、優秀な人材確保、新規薬剤開発等を進めていく上で必須であり、社会、経済におけるインパクトは多大であると考えている。今後も継続していくことが重要であると考えている。