近畿・中部地区医系大学知的財産管理ネットワーク新技術説明会平成26年9月30日心腎連関における可溶性Flt-1の産生低下とその治療戦略への応用奈良県立医科大学第一内科学教授斎藤能彦准教授上村史朗助教竹田征治背景１・慢性腎臓病（CKD）症例では高率に心不全を合併する（Cardio-renal syndrome type 4： CRS4) ・CKD合併心不全は重症化しやすく予後が悪い・CKD合併心不全への既存の治療薬は効果が少ない J Card Fail 2002; 8: 136 従来技術の問題点・慢性腎臓病（CKD）に合併する心不全の発症機序には血行動態的な機序が考えられていた・しかし、CKDから心不全発症につながる分子機序は不明であった・従って、分子機序に立脚した特異的治療法は存在しなかった・CKDのモデル動物の作成が困難で、創薬への妨げになっていた・CRS4のモデルマウスは存在しなかった背景 2-1 PLGF,Flt-1,solubleFlt-1の基礎・PLGFはVEGFのファミリー・受容体であるFlt-1に結合し、炎症反応、血管新生を誘導・solubleFlt-1はFlt-1の細胞外ドメインからなるアイソフォームで、PLGFに結合するがシグナルを伝えない・Soluble Flt-1はPLGFの内因性拮抗物質として働く背景 2-2 背景３ CKDでsFlt-1の産生は低下 Copies/GAPDH ヒト腎生検組織 sFlt-1/GAPDH Kidney 0.8 P<0.05 0.6 0.4 * 0.2 2.5 0.0 2 Control 5/6 NR Copies/GAPDH 腎不全マウスでのsFlt-1産生 Lung 15 * 10 5 0 Control 5/6 NR 1.5 HD症例血清によるsFlt-1の産生抑制 1 0.5 0 1 2 3 CKD stage 4 慢性腎不全の病態の特徴健常人 PLGF 慢性腎臓病 sFlt-1 sFlt-1 PLGF PLGF相対的活性亢進慢性腎不全の病態の特徴を兼ね備えたモデルマウスの作成 S-Flt-1特異的欠損マウス • sFlt-1はEx13とEx14の間での選択的スプライシングで生成される • Ex13とEx14を直接繋げた transgeneを作成し knockinした。 Ex13 Ex14 変異体 Flt-1 stop sFlt-1 sFlt-1mRNA発現量 Ex13 Ex14 sFlt-1 KO腹腔内マクロファージは活性化している sFlt-1 KOに心不全を作成・sFLt-1 KOマウスは、それだけでは心不全を発症せず大動脈縮窄モデル TAC model ・圧負荷を加えて、心不全易発症性を検討 sFlt-1 KOの心不全易発症性の証明左室の収縮力の低下生命予後(K-M 解析） CRS4モデル（sFlt-1 KO+TAC処理）のその他の特徴・左室駆出率の低下（収縮力の低下）・心室重量の増加・心室壁の増加・心室線維化の増悪・心室へのM1マクロファージの浸潤増加・上記変化は慢性腎臓病に合併する心不全の変化と似ている新技術の特徴・従来技術との比較１・sFlt-1 KOマウスは腎機能は正常であるが、慢性腎臓病で観察されるPLGF/Flt-1系の相対的活性化を示している・sFlt-1 KOマウスにTAC処理を施したマウスはCRS4のモデルとして、実験に供することが可能となった・過去においては腎不全モデルにさらに心不全モデルを作成することは、侵襲的であり、かなり困難を極めた・慢性腎不全における心不全易発症性の機序の発見（相対的PLGF/Flt-1系の活性化が関与） Flt-1シグナリングとレスキュー実験の経路 PlGF sFlt-1 VEGF レスキュー実験 Flt-1 1. リコンビナント sFLt-1 MCP-1 2. 抗PLGF抗体心不全・線維化 3. 抗MCP-1抗体レスキュー実験の結果左室駆出率による改善度リコンビナント sFlt-1 抗PLGF抗体抗MCP-1抗体 EF (MCP1 Ab) 100 % 80 60 40 20 0 WT KO WT KO WT KO Control TAC TAC+MCP-1 リコンビナントsFlt-1、抗PLGF抗体、抗MCP1抗体の持続投与で、TACによる左心機能の低下を防ぐことができた。創薬への応用新技術の特徴と従来技術との比較２・sFlt-1のCRS4に対する治療薬の可能性を示した・PLGF・Flt-1系を創薬標的にすることが可能となった想定される用途 CRS4の治療薬としての観点から • 創薬 – sFlt-1の誘導体の開発 – 内因性sFlt-1産生促進剤の開発 • 対象疾患 – 慢性腎不全合併心不全の治療薬に応用 – 慢性腎不全にともなう動脈硬化に応用実用化に向けた課題・慢性腎不全モデルマウスにTAC処置を行いリコンビタントsFlt-1の治療効果の確認・中動物（ウサギ）でCRS4モデルを開発し、sFlt-1 の効果を確認・WHHLウサギ（動脈硬化モデルウサギ）にリコンビナントsFlt-1を投与し、腎不全に伴う動脈硬化の治療効果を確認企業への期待 • GCPグレードのリコンビナントsFlt-1作成 • sFlt-1誘導体の開発 • 内因性sFlt-1産生促進剤の探索本技術に関する知的財産権・発明の名称： CRS4の治療及び／又は予防のための組成物、CRS4モデルマウス及びバイオマーカー・出願番号：特願2013-258220 ・出願人：奈良県立医科大学・発明者：斎藤能彦、上村史朗、竹田征治問い合わせ先奈良県立医科大学大学産学官連携推進センター特任教授大野安男ＴＥＬ０７４４-２２-３０５１ (ex 2481) e-mail ： yohno＠naramed-u.ac.jp