末梢血単核球(PPBMC)からのiPS細胞誘導法 ( PDF:225KB)

CytoTune-iPS 2 .0 を用いた末梢血単核球（PBMC）からの iPS 細胞誘導方法ディナベック株式会社【材料】《細胞》・ヒト末梢血単核球（PBMC：下記密度勾配遠心法により調製）《ベクター》・ CytoTune-iPS 2.0 Cat. No. DV-0304 《試薬等》・霊長類 ES 細胞用培地(ESM)：ReproCell Cat. No. RCHEMD001 ・ StemPro-34 SFM (1X), Liquid：Life Technologies, Cat. No. 10639-011 ・ L-glutamine, 200 mM：Life Technologies, Cat. No. 25030081 ・ SCF (c-Kit Ligand) Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC2116 0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用 Stock concentration：100 µg/ml Working concentration：100 ng/mL ・ FLT-3 Ligand Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC9414 0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用 Stock concentration：100 µg/ml Working concentration：100 ng/mL ・ TPO (Thrombopoietin), Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC9514 0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用 Stock concentration：20 µg/ml Working concentration：20 ng/mL ・ IL6 Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC0065 0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用 Stock concentration：10 µg/ml Working concentration：10 ng/mL ・ Ficoll-Paque PREMIUM：GE ヘルスケアジャパン, Cat. No. 17-5442-02 ・ FGF2：PeproTech Inc., Cat. No. 100-18B D-PBS 100 µl に溶解（0.5 µg/µl）
。ESM 500 ml に 5 µl を添加して使用・ゼラチン：旭硝子株式会社 Cat. No.G0001-6 1
・ペニシリンストレプトマイシン（PS）
：ナカライテスク, Cat. No. 26253-84 ・トリパンブルー染色液：Life technologies, Cat. No. 15250061 ・マイルドホルム 10N：Wako, Cat. No. 133-10311 ・ D-PBS: Life technologies, Cat. No. C14190500BT ・ 0.25% Trypsin-EDTA (1X)：Life technologies, Cat. No. 25200-056 D-PBS で適宜希釈して使用・ 1-step NBT/BCIP（ALP 染色液）
：Thermo scientific, Cat.No. 34042 ・ ES 培地：ESM に FGF2 5 µl, PS 6 ml 添加した培地・ PBMC 培地の作製（下図の PBMC 用培地-Cytokine） StemPro-34 Nutrient を 4℃で終夜、融解融解後、StemPro-34 SFM ボトルに添加、優しく完全に混合 L-Glutamine を添加 5 ml PS を添加 5 ml ・ PBMC CM（complete medium の略）培地の作製（下図の PBMC 用培地+Cytokine） PBMC medium 100 ml SCF stock solution 100 µl FLT-3 stock solution 100 µl TPO stock solution 100 µl IL6 stock solution 100 µl 2-8℃で 30 日間、使用可能方法】 ≪PBMC の分離、培養≫ ① 採血（採血管 2 本分 9 mlx2 本） ② Ficoll-Paque PREMIUM を 4 ml ずつ 15 ml チューブ 5 本に分注 ③ 血液と D-PBS を 1：1.5 で混合 ④ ②で準備したチューブに 8 ml ずつ③で準備した希釈血液を Ficoll-Paque PREMIUM の上に
優しく添加 ⑤ 400 x g,18℃で 30 分間遠心する。
（加速、減速ともにブレーキ解除） ⑥ 遠心後、白く濁った中間層をピペットマンで回収 ⑦ 新しい 15 ml チューブに移す。1 本より 1 ml 程度回収。5 本分をまとめて 1 本にする。 ⑧ 回収した PBMC に対し D-PBS 9 ml を添加 ⑨ 100 x g, 18℃, 10 分間遠心 ⑩ 上清を除去 ⑪ D-PBS 12 ml を添加 ⑫ 100 x g, 18℃, 10 分間遠心 ⑬ PBMC CM 培地を添加（5 ml）し、懸濁 ⑭ トリパンブルー染色液を用いて細胞数をカウント ⑮ PBMC CM 培地を用いて 5 x 105 cells/well/ml で 24 ウェルプレートに播種 2
⑯ 37℃、5％ CO2 のインキュベーターで培養 ⑰ 翌日、0.5 ml の培養液を除き、0.5 ml の PBMC CM 培地を添加 ⑱ 37℃、5％ CO2 のインキュベーターで培養 ⑲ 翌々日、0.5 ml の培養液を除き、0.5 ml の PBMC CM 培地を添加 ⑳ 37℃、5％ CO2 のインキュベーターで終夜培養（翌日にベクター感染） ≪ベクターの感染≫ 細胞数のカウント ① カウント用のウェルをピペッティングにより懸濁し、培養上清を 1.5 ml エッペンドルフチ
ューブに移す ② 0.025％ Trypsin-EDTA 溶液を 1 ml 添加し、37℃でインキュベート（ 5 分） ③ 1.5 ml エッペンドルフチューブを遠心、5000 rpm 1 分 ④ 上清を除去 ⑤ 0.025％ Trypsin-EDTA 溶液を添加したウェルをピペッティングにより懸濁し、先ほどと同
じ 1.5 ml エッペンドルフチューブに添加 ⑥ 1.5 ml エッペンドルフチューブを遠心、5000 rpm 1 分 ⑦ 上清を除去 ⑧ D-PBS を添加 0.5 ml し懸濁 ⑨ トリパンブルーを用いて細胞数をカウント ⑩ PBMC CM 培地に各 MOI=5 になるようにベクター溶液を調製し、細胞へ添加目安：PBMC CM 培地 300 µｌ 500 µl に各ベクターを添加、混合後、細胞に添加 MOI は、生細胞と死細胞の合計した細胞数を用いて計算する ⑪ 感染 1 2 日目細胞を吸わないように終夜培養液 0.5 ml を除去し、PBMC CM 培地を添加(0.5 ml) 37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養重層用の MEF を準備する 3
⑫ 感染 3 日目感染細胞をピペッティング等で剥がして 6 ウェルプレートの MEF に重層する。 37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養目安として 2 x 104 1ｘ105 cells/well ⑬ 感染 4 6 日目細胞を吸わないように培養液を除去し、PBMC 培地を添加(2 ml) 37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養 ⑭ 感染 7 日目培養液 1 ml を除去し、ES 培地を添加(1 ml/well) 37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養 ⑮ 感染 8 日 21 日培地交換は、1 週間に 6 回行う（土日は 1 回、その他は毎日）培養液を除去し、ES 培地を添加(2 ml/well) 37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養 ⑯ iPS 細胞の状態から判断して、適宜、ピックアップやアルカリホスファターゼ染色等、目的
に応じた評価を行う。 ≪アルカリホスファターゼ（ALP）染色の例》 ① 培養液を除き、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回） ② マイルドホルム 10N を添加し、細胞を固定（1 ml/well） ③ 室温で 10 分、振とう後、マイルドホルム 10N を除き、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回） ④ 1-Step NBT/BCIP を添加（1 ml/well） ⑤ 室温で 20 分程度振とう後、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回） ⑥ ALP 陽性 iPS 様細胞コロニー数をカウントし、誘導効率を計算【注記】本プロトコールを用いることで、30 代成人由来 PBMC から 0.1％以上の効率で iPS 細胞の誘導できる
ことが確認されました。但し iPS 細胞誘導効率はドナーによって異なる可能性があり、本プロトコー
ルが常に 0.1％以上の誘導効率を保証するものではありません。 4

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