Red Cell EZ Type Rh DI

使用説明書
PakPlus® assay
REF
PAKPLUS
RUO
研究用試薬
保存
目次
使用目的 ......................................................................................................................................................................... 2
概要 ................................................................................................................................................................................ 2
測定原理 ......................................................................................................................................................................... 2
試薬 ................................................................................................................................................................................ 2
注意 ................................................................................................................................................................................ 3
警告 ................................................................................................................................................................................ 3
検体の採取 ..................................................................................................................................................................... 3
手順 ................................................................................................................................................................................ 3
キットに含まれるもの .............................................................................................................................................. 3
ご自分で用意するもの .............................................................................................................................................. 4
検査手順 ................................................................................................................................................................... 4
品質管理 ......................................................................................................................................................................... 6
結果の判定 ..................................................................................................................................................................... 6
測定限界 ......................................................................................................................................................................... 6
製品の特性 ..................................................................................................................................................................... 6
参考文献 ......................................................................................................................................................................... 7
PakPlus assay
1
303469.IFUJA REV C
使用目的
PakPlus assay は HLA classI 抗原と GP IIb/IIIa、GP Ib/IX、GP Ia/IIa、
た定性 ELISA キットです。
PIV のエピトープに対する抗体を検出するように設計され
概要
1-7)
多くの研究者によって様々な血小板グリコプロテイン上の血小板特異的抗原の存在が報告されています 。妊娠歴や輸血歴により血小
8-10)
板特異的抗原又は HLA class I 抗原に対する抗体ができると、新たに輸血された血小板を免疫的に破壊する可能性があります
。 被検
血清中にこれらの抗体があることを確認することにより適切な血液製剤の選択をするうえで参考になります。
The PakPlus assay のマイクロウェルに、血小板型が判っている O 型ドナー由来の GP IIb/IIIa、Ia/IIa をモノクローナル抗体で、HLA
class I 抗原と GPIb/IX、IV はアフィニティ精製して、固定しています。 この検査では HLA class I 抗原と血小板特異的抗原に対する抗
体を別々に検出します。 抗原の配置は記録用紙に記載されています。
測定原理
被検血清又は血漿を血小板及び HLA 糖たんぱく質を固定したマイクロウェルに添加します。抗体が存在すれば抗原に結合します。結合
しなかった抗体を洗浄して取り除きます。アルカリ性フォスファターゼ標識抗ヒトグロブリン(IgG/A/M)試薬を添加してインキュベー
トします。結合しなかった抗 IgG/A/M を洗浄して取り除き、PNPP 基質(p ニトロフェニルフォスフェート)を添加します。30 分のイ
ンキュベート後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応を停止します。吸光度計で発色物質の吸光度を測定します。
試薬
キットあたりの最大検体数:

PAKPLUS assay:
5 検体
全ての試薬はラベル記載通りに保存してください。
MS
TCW
SD
SB
ESS
AH
PN
PC
404553
マイクロウェル:血小板及び HLA 糖たんぱく質固定平底マイクロウェルストリップ。開閉可能なフォイルパ
ウチ入り。このまま使用できます。
403622
濃縮洗浄液(10x):トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液 塩化ナトリウム、Tween20、1%ア
ジ化ナトリウム含有。使用前に脱イオン水又は蒸留水で希釈します。希釈済みの洗浄液は室温で 48 時間又
は 2-8℃で 7 日間保存できます。
403831
検体希釈液:リン酸緩衝食塩液 ウシアルブミン、マウス血清、0.1%アジ化ナトリウム含有。このまま使用
できます。
403613
基質希釈液:ジエタノールアミン、塩化マグネシウム、0.02%アジ化ナトリウム含有。このまま使用できま
す。遮光保存。
403603
停止液:このまま使用できます。
404589
酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体:アルカリ性フォスファターゼ標識ヤギ由来アフィニティ精製抗ヒトグロブリ
ン(IgG/A/M)。0.1%アジ化ナトリウム含有。使用前に検体希釈液で希釈します。
403594
PNPP(p ニトロフェニルフォスフェート)基質:結晶粉末。使用直前に脱イオン水又は蒸留水で溶解し、基
質希釈液 SB で希釈します。遮光保存。
404601
陽性コントロール血清:ヒト血清 0.1%アジ化ナトリウム含有。使用前に検体希釈液で希釈します。
PakPlus assay
2
303469.IFUJA REV C
NC
PS
404577
陰性コントロール血清:ヒト血清 0.1%アジ化ナトリウム含有。使用前に検体希釈液で希釈します。
503019
プレートシール
注意


濁りや汚染が認められる試薬は使用しないでください。
検体希釈液と酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体を汚染しないよう注意してください。誤ってこれらの試薬にヒト血清または血漿が混入
すると酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体が中和し、誤った結果が出ることがあります。
使用期間の過ぎた試薬は使用しないでください。
キットに含まれるマイクロウェルやその他の試薬は他の検査システムと組み合わせて使用しないでください。
キット構成品を他の物で代用すると結果に一貫性が持てなくなり、誤った結果が出ることがあります。
希釈済みの酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体、希釈済の陽性及び陰性コントロール、溶解または希釈済みの PNPP が検査終了後に余っ
た場合は廃棄してください。
希釈液をつくる際は、ピペットの製造元の指示に従って適切に分注及びチップをすすいでください。
最後のインキュベーションで行う酵素基質反応は温度の影響を高く受けます。22-25℃に温度調節された環境で行ってください。
使用する機器や室温の違いによる、一定した有効なコントロール値を得るにはインキュベーション時間を長め又は短めに設定する必
要があります。最終インキュベーションの温度はコントロール値に影響するので、室温インキュベーション温度を定期的に監視する
ことが重要です。







警告

この製品で陽性及び陰性コントロールとして使用するヒト血清は FDA で承認された方法により HIV 抗体、HCV 抗体、HBs 抗原が
陰性であることが分かっています。しかしながら HIV、C 型肝炎ウイルス、B 型肝炎ウイルス、その他の感染性物質が存在しないこ
とを保証する検査方法はありません。従って、これらの試薬は感染症の原因になる可能性があるものとして取り扱ってください。
このキットの含まれる試薬の一部には保存剤としてアジ化ナトリウムを使用しています。
警告:アジ化ナトリウムは鉛又は銅製の排水管と反応し爆発性の金属アジ化物を生成します。流しに廃棄する際は、アジ化物が生
成しないように大量の水とともに流してください。アジ化ナトリウムは毒物で、飲み込むと毒性があります。
使用後は全てのキット構成品は地域の規定に従って廃棄してください。


検体の採取
血液検体は血漿の場合は ACD 又は EDTA で、血清の場合は抗凝固剤を使用せず無菌的に採取し、検体の不適切な保管や汚染により疑陽
性又は疑陰性の結果となる機会を最小限にするため新鮮なうちに検査を行ってください。すぐに検査を行わない検体は 2-8℃で 48 時間
まで保存できます。また-20℃以下で 2-3 年凍結保存ができます。しかしながら、凍結/融解の繰り返しによる失活を避けるため、凍結前
に小分けにしてください。霜取り機能付きの冷凍庫は使用しないでください。
血清または血漿は赤血球から分離してから保存してください。
検体に粒子や凝集がある場合は、疑陽性となり二重測定の不一致につながることがあります。検体に粒子がある場合は検査前に遠心によ
り取り除いてください。
この検査には全血清または血漿を使用してください。検体を通常の ELISA 陰性ヒト血清以外の物で事前に希釈すると、結果に影響を及
ぼすことがあります。
微生物汚染、溶血、脂肪血、黄疸、加熱により不活化された検体は正しい結果が得られないことがあるので避けてください。
手順
キットに含まれるもの
バイアルにはラベル記載よりも多めの試薬が入っています。希釈液を調整するときは適切な器具で計量してください。
1.
2.
3.
4.
6本
1本
1本
1本
2x8 マイクロウェルストリップ、枠付き
50mL 濃縮洗浄液
14mL 検体希釈液
14mL 基質希釈液
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5.
6.
7.
8.
9.
10.
1本
1本
3本
1本
1本
6枚
14mL
80μL
50mg
0.3mL
0.7mL
停止液
酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体
PNPP 基質
陽性コントロール血清
陰性コントロール血清
プレートシール
ご自分で用意するもの
検体、コントロール希釈用チューブ、試薬希釈用チューブ(酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体の希釈にはポリプロピレン製チューブを
使用します)
2.
スポイト
3.
10-100μL、100-1000μL 調節可能マイクロピペット、ディスポーザブルチップ
4.
タイマー
5.
OD 値 405 又は 410nm 及び 490nm 測定可能なマイクロプレートリーダー
6.
脱イオン水又は蒸留水
7.
吸水用ペーパータオル
8.
マイクロプレートウォッシャーまたは洗浄用器具
9.
血液検体から血清または血漿を分離するための遠心機
10. 37℃水槽又はインキュベーター
1.
検査手順
1.
全ての試薬を室温に戻します。
2.
濃縮洗浄液を希釈して洗浄液を調整します。濃縮洗浄液 1 に対し 9 倍量の脱イオン水又は蒸留水を加え、よく混和します。
3.
検体数を確認します。キット同梱の CD から記録用紙をプリントアウトし、各検体に 2 本のウェルを割り当てます。記録用紙に各
検体名を記入します。
検体とコントロールの準備
4.
5.
次の通りに希釈し、よく混和します。
検体希釈液量
検体量
陽性コントロール
150μL
50μL
陰性コントロール
600μL
200μL
検体
600μL
200μL
マイクロウェルストリップを枠ごとパウチから取り出します。使用しないストリップは枠から取り外し、すぐにパウチにしまい、
密封します。
注意:キットには枠が 1 つしか入っていません。全てのストリップを使い終えるまで枠を捨てないでください。
注意:枠は左上の A1 の位置から始めてください。全てのストリップが正しく枠にはまっていることを確認して下さい。誤りを防ぐため
に各ストリップに番号を振ります。検査を行う場合は、プレートの同じ位置から分注を開始するようにして下さい。
6.
300μL の希釈済み洗浄液を全てのウェルに添加し、室温で 5-10 分間放置します。
7.
洗浄液を洗浄機で吸引するか、流しでひっくり返して捨て、吸水紙上に裏返しに置きます。ウェルの底に泡が残っていると次の段
階で添加した試薬が正しく反応しません。スポイトなどでつついて泡を消してから次の手順に進みます。乾燥を防ぐため裏返して
吸水紙の上に置いておきます。
8.
手順 4 で希釈したコントロールと検体 50μL を記録用紙に割り当てた通りに分注します。
注意:ブランクウェルには検体や試薬を入れないでください。
注意:複数の検体を同時に検査する場合、コントロールは1セットのみです。誤りを防ぐため、各ストリップに番号を振ってください。
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9.
マイクロウェルをプレートシールで封をして、37℃の水槽で 30-35 分間インキュベートします。ドライインキュベーターを使用す
る場合は 10 分間延長します。
10. 酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体 1 に対し検体希釈液 100 で希釈します。ポリプロピレン製のチューブを使用します。
ストリップ数
2本
6本
酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗
体
20μL
60μL
検体希釈液
2.0mL
6.0mL
注意:酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体は粘性があります。チップ内で試薬を 2-3 回吸い上げてなじませ、検体希釈液中でよくすすぎ、混
和して下さい。
11. 洗浄操作
a)
b)
c)
d)
e)
各ウェルの内容物を洗浄機で吸引するか、流しでひっくり返して捨てた後に吸水紙上に裏返しに置きます。
希釈済みの洗浄液 300μL を分注します。
a.と同様に内容物を捨てます。
b と c を繰り返し、合計 3-4 回洗浄します。
吸水紙に叩きつけ、完全に洗浄液を取り除きます。乾燥を防ぐため吸水紙上に裏返しに置きます。
注意:最後の洗浄操作後、全ての洗浄液を完全に取り除くことが大事です。ウェルの底に泡が残っていると次の段階で添加した試薬が
正しく反応できません。スポイトでつついて泡を消してから次の手順に進みます。
12. 手順 10 で希釈した酵素標識抗ヒト IgG/A/M 抗体をブランク以外の各ウェルに 50μL 分注します。
13. マイクロウェルをプレートシールで封をして、37℃の水槽で 30-35 分間インキュベートします。ドライインキュベーターを使用す
る場合は 10 分間延長します。
14. PNPP 基質のバイアルを開け、0.5mL の脱イオン水または蒸留水を添加して溶解します。ふたを戻してよく混和します。使用直前
まで光の当たらないところに保管します。
15. 溶解した PNPP 基質 1 に対し基質希釈液 100 で希釈します。
ストリップ数
2本
6本
溶解した PNPP
40μL
120μL
基質希釈液
4.0mL
12.0mL
注意:よく混和して下さい。使用直前まで光の当たらないところに保管します。
16. 洗浄操作
a) 各ウェルの内容物を洗浄機で吸引するか、流しでひっくり返して捨てた後に吸水紙上に裏返しに置きます。
b) 希釈済みの洗浄液 300μL を分注します。
c) a と同様に内容物を捨てます。
d) b と c を繰り返し、合計 3-4 回洗浄します。
e) 吸水紙に叩きつけ、完全に洗浄液を取り除きます。乾燥を防ぐため吸水紙上に裏返しに置きます。
すぐに次の手順に進みます。
17. 手順 15 で希釈した PNPP 基質 100μL をブランク以外の全てのウェルに分注します。
18. マイクロウェルを光の当たらない室温(22-25℃)で 30 分間インキュベートします。
注意:PNPP 基質添加後のインキュベーション時間と温度は重要です。設定したインキュベーション時間と温度は変更しないでください。
1 枚のプレートの中で基質を添加してから停止液を添加するまでの時間が各ウェルで同じになるように、滞りなく分注を行ってく
ださい。
19. 100μL の停止液を、基質を分注したのと同じ順序で各ウェルに分注します。ブランクウェルには 200μL の停止液を分注します。
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20. 405 又は 410nm、参照波長 490nm で各ウェルの吸光度(OD 値)を測定します。すぐに測定を行えない場合は、暗所に保管し 30
分以内に測定してください。
21. 各検体とコントロールのウェルの OD 値からブランク値を差し引きます。多くの ELISA リーダーは自動的にブランクを差し引くよ
う設定されています。
22. 結果を記録用紙に記録します。
品質管理
The PakPlus assay は品質管理のために陽性コントロール、陰性コントロールを組み込んでいます。技術的誤りや試薬の不備がない
か確認するために、これらのコントロールは検査のたびに使用してください。
有効性の基準:
平均 OD
陰性コントロール
≦0.175
(IIb/IIIa rows)
陽性コントロール
≧1.000
二重測定により得られた二種類の OD 値は、その値の平均値の 20%以内に入ることを確認してください。この値から外れた検体は
再検査してください。
注意:二重測定の不一致は試薬または検体の入忘れ、試薬添加量のばらつき、インキュベーション中の温度のばらつき、最終インキ
ュベーション中の光への偶然の暴露、ウェル間のコンタミネーションなどにより起こります。二重測定を行わないと、検査の
誤りがあった場合それを見落とすことにつながります。
結果の判定
対応するグリコプロテインの陰性コントロール値の平均値の 2 倍以上の OD 値を示した検体は陽性と判定されます(各グリコプロテ
インに 2 本の陰性コントロールを使用します)。
測定限界









検査資材の微生物汚染、不適切なインキュベーション、不適切な洗浄、基質の光への偶然の暴露、試薬の入忘れ、記載された温
度要件から外れた場合、手順飛ばしにより誤った結果が出ます。
検体中の免疫複合体や他の免疫グロブリンの結合により非特異反応を起こし、偽陽性となる場合があります。
同種抗体の特異性のパターンに当てはまらない結果が得られた場合、判定保留になります。
この検査の結果で診断を行うことはできません。
この検査では低力価または低活性の抗体を検出できないことがあります。
記録用紙に記載のない特異性の抗体は検出できないことがあります。
b
b
a
b
a
a
HPA-4b(Pen )、HPA-6a(Ca )、HPA-6b(Ca )、HPA-7a(Mo )、HPA-7b(Mo )、HPA-8a(SRb)、HPA-8b(Sr )
などの GPIIb/IIIa 上の血小板特異的抗原が GPIIb/IIIa ウェルの血小板にあるかどうか、検討されていません。これらのシステム
に対する同種抗体がこの製品を使った検査で反応する可能性があります。
低頻度の HLAclassI 抗原に対する抗体はこの製品では検出できないことがあります。
リンパ球細胞傷害試験(LCT)で検出されない非細胞傷害性 HLA 抗体が検出されることがあります。
製品の特性
この使用説明書に記載された通りに正しく保管し使用した場合、この製品は HLA classI 抗原と記録用紙に記載された血小板特異的
抗原に対する抗体を検出します。
反応性と特異性を確認するために、the PakPlus assay の各ロットは出荷前に記録用紙に記載されたグリコプロテインと反応する抗
体を含むと分かっている検体、含まないと分かっている検体を使って確認検査を行っています。
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使用成績
比較された方法
PakPlus
assay
陽性
陰性
合計
陽性
97
13*
110
一致率:
陽性の一致率:
陰性の一致率:
比較された方法:
陰性
5
266
271
合計
102
279
381
95.3%
88.2%
98.2%
Reverse Passive Hemagglutination Assay
*比較された方法は抗体検出に丸ごとのインタクトな血小板を使用するので、血小板に発現しているどのような抗原に対しても陽性
11)
の結果を出す可能性があります 。the PakPlus assay では抗体検出の標的は独立したグリコプロテインですから、寒冷凝集素や
Lewis のような赤血球抗原に対する抗体は検出しません。
参考文献
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No 4: 113-4.
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2014-12-22
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