佐渡博物館研究報告第 8集 ( 1 9 8 1 ) アメフラシの紫汁におよぼす pH，光および熱の影響杵臼格 (新潟大学教養部) f ! Ee c t sofpH，l i g h tandheatonthe purple pigmentofAplysiak u r o d a i . I t a r uUSUKI (DepartmentofB i o l o g y， C o l l e g eofGeneralEducation，N i i g a t aU n i v e r s i t y ， N i i g a t a950-21) Abstraet Thep u r p l epigmento fA plysiakurodaishowsb l u ep u r p l ec o l o ri na c i ds o l u t i o n，g i v i n gas t e e p peako fl i g h tab 釦 r p t i o nwitht h emaximuma t4 9 5nmandabroada b s o r p t i o nwitht h emaximum a t5 6 5nm. Thec o l o rwaschangedt or e dp u r p l ei na l k a l i n es o l u t i o n，s h i f t i n gt h ea b s o r p t i o nmaxi- ，with a mumt o5 0 5nm. Thec o l o ro ft h epigmentwasf a d e dbye x p o s u r et oas t r o n gs u n l i g h t f a s t e rr a t ei na l k a l i n epHthani na c i ds i d e . Althoughf a d i n go ft h ep u r p l ec o l o ro c c u r r e da l s obyh e a t i n go ft h epigmenti nb o i l i n gwater bath， i taccompaniedwitha development o f orange-brown c o l o r and a r e i n f o r c e m e n to f4 9 5nm a b s o r p t i o ni na c i dp H s . Thep u r p l epigmentwasd i v i d e di n t oas e r i e so fc o l o r e df r a c t i o n s ，s uch a sorange，r e d， pink， p u r p l e and b l u e，by S ephadex G-25g e l chromatography d e v e l o p e d with ad i l u t e d s o l u t i o no f a c e t a t eb u f f e r . Largep a r t so ft h ef r a c t i o n so b t a i n e d were a mixture o ft h e components which showana b s o r p t i o nmaximuma t4 9 5 ，545or595ntninacidicpHs and at 505nm in common in a l k a l i n ep H s . Eacho ft h e pigment f r a c t i o n s wasfaded i nc o l o r by exposure t ot h es u n l i g h t ， withg r a d u a ldiminutiono ft h ei n t e n s i t i e so ft h el i g h ta b s o r p t i o n . Byh e a t ，however，bothofthe components showing a b s o r p t i o n maxima a t5 4 5nm and 5 9 5nm were c o n v e r t e dt ot h e4 9 5nm component ，althoughthel a t t e rwasdecomposedu l t i m a t e l ybyh e a t . がて消えてしまうが，色の消失速度は暗い洞窟の中でよ 1.はじめにりも，強い直射光のさす浜辺の方が迄かに早いように恩アメブラシは春から夏にかけて，岩浜に極く普通に見られる。これに触れると，紫色の液を放出するのでいかわれる。紫汁は単に海水で稀釈されて識別できなくなるのでは無さそうである。にも毒々しく，薄気味悪く感じられる。悪童達がやるよこのような観察の当否を確めるために，実験室内で多うに，アメフラシの背中の右側を棒で軽くつついて紫汁少の実験を行なってみた。もし観察の通りなら，紫汁はを放出させてみると，漉斗から噴出しつつある紫汁は美溶液の pHによって色調が変り，麗な青紫色なのに，海水中に広がった部分は淡い赤紫色色が早くなる筈である。予想通りの結果はすぐ出た。しこのさまはいかにも pH指示かし実験の過程で，紫汁は意外に多数の色の混合物から薬の色変りを見ているようである。放出された紫汁はや構成されていることや，加熱することによって光とは異に変ってしまっている。 -121ーさらに光によって徳なる特徴のある禄色過程をたどることを知った。ここで I I I . 結果はこれらの結果をあわせて報告する。紫汁の酸性水溶液はきれいな青紫色を呈するが，これ 1 1 . 材料および方法を中和すると赤紫色に変る。図 1に酸性とアノレカリ性に実験の大部分は佐渡臨海実験所で，一部は新潟大学教した紫汁の吸収スベクトノレを示した。この図から明らか養部で行なった。いずれの場合も，採集したアメフラシなように，紫汁は 4 5 0 から 650nmにかけて巾広い光吸収 (Aplysiakurodai) の紫汁腺を現場で切り取り，遮光を示し，酸性倶1]では 495nmに吸収極大を持つ小さな山した場に入れて実験室に持ち帰った。数個体分の紫汁腺と， 565nmに吸収極大を持つ大きな山を両く。海水のに約 1 0mlの 1 M 酢酸溶液〈または紫汁の 1 / 5容の pHに近いアノレカリ側では， 5 6 5nmを中心とする大き濃酢酸〉を加えて欽で紫汁腺を切り刻んで色素を抽出しな光吸収が消えて 505nmに吸収の中心が移る。すなわ OOOrpmで: 1 0 分間遠心して沈殿た。得た濃厚色素液を 2，ち，紫汁は酸性側では燈黄色から赤色に至る長波長光を物を除き，中和した上清を紫汁原液として随時蒸溜水ま強く吸収し，青色の短波長光と赤色光の一部を透過するたは pH緩衝液で稀釈して使用した。ために青味がかった紫色に見えるが，アルカリ側では緑 pH緩衝液として， 0.214のグリシン一塩酸 (pH1 . 0 - 色光の吸収が増大して短波長光および長波長光を良く透 4・ 0 )，酢酸一酢酸ナトリュウム (pH3 . 5 6 . 0 )，トリスー過するので，全体として赤味の勝った紫色になるのであマレイン駿一水酸化ナトリュウム (pH5 . 5 9 . 0 )およびる。グリシン水酸化ナトリュウム (pH8 . 5 1 3・ 0 )の混液アメブラシ ( A . kurodai) 以外にもクロヘリアメブ 1 M としを用意し，紫汁と混合した後の最終濃度を 0・ラシ (A ・parvula)，ジャノメアメフラシ ( A.d a c t y l o - B u r s a t e l l al e a c h i )も mela) およびトゲアメフラシ ( た。紫汁のスベクトル測定には，日立 1 0 1型分光光度計お紫汁を分泌する。これらのスベクトノレは酸・アルカリ側 2 4型を使用しよび日立ダブルビーム自記分光光度計 1 とも図 1に示したものと全く同じで，スベクトノレの上かた。らは種類差はないといえる。ただし，紫汁は冷凍保存し・ - λ 8 . 5 日 J 凶OZ︿国広O の白︿。。ー一一一 pH 4.0 司ζ 。 400 WO WAVE 600 LENGTH ， nm fp u r p l epigmento b t a i n e dfromAplysiak u r o d a i . F i g .1 . Spectrao Thewholepigmentwas t r e a t e d with1 / 5volum o fa c e t i ca c i d . After a c e n t r i f u g a t i o r ithep i g 古田n ts u p e r n a t a n twas， n e u t r a l i z e d，and s p e c t r a were measuredi n0 . 1M b i p h t h a I . a t eand. T r i s .f ¥ ' t a .leate.NaOHbu妊e r s . -122- 0 . 8 I i g h te f f e c t 0 . 6 。。 400 500 500 600 Fig.2. の比 (A565/A4 9 5) はついには逆転してしまう。つまても 565nmの吸収が次第に低くなり，酸性色は青紫から紫に変化する。従ってスベクトルの形は材料の新旧のり，紫汁は一様に分解されるのではなく，長波長の光を程度によって大きな影響を受ける。吸収する部分がまず変化するために全体の色調がアルカリ色に接近し，次いで、短波長側の吸収も低下するので色紫汁に対する光の影響を図 2の左側半分に示した。光全体が淡くなって行くのである。の影響を調べるには， pH と紫汁の濃度を調節した液を光の効果を調べるためには，雲のない良く晴れわたっ多数の試験管に分注し，対照群を暗室中に置き，実験群を白板を敷いた水槽に浸して温度の上昇を防ぎながら強た日を選ぶ必要があり，また，実験時刻も光強度との関い直射日光に一定時間さらす。紫汁は明らかに光により連でおのずから制限される。紫汁色素が光分解されるも槌色するが，その程度は酸性側でよりもアルカリ側で著のならば，同じように熱分解が生じてもそれ程不思議でしい。すなわち，アノレカリ側では赤紫色が次第に淡いピはないし，実験条件を一定に保つには加熱の方がむしろング色になり，スベクトノレの形があまり変らないままで便利でさえある。そこで紫汁を入れた試験管の口をサラ全体的に吸光度が低下して， 3時間後にはほとんど無色ンラップで蓋をして沸騰水浴中に浸し，熱の影響を調べになってしまう。酸性溶液を光に晒すと，青紫色が僅かてみた。 5分ないし 1 5分で紫になり，次いで赤紫色を経て淡いピ図 2の右側半分に示したように，紫汁は熱によって槌 565nmに極大を色するが光による槌色とはかなり異なる。たとえば酸性ンク色に変る。スペグトルを見ると， 5 6 5nmの持つ光吸収の山が時間経過と共に著しく低下する一方，溶液では青紫色から赤紫，燈黄色えと変り， 495nmの山はあまり低くならないから両波長の吸光度大きな吸収帯は光の場合のように著明に低くなるが 495 90 n 司ム “ ， nm付近の光吸収はむしろ増大する。その様子は 565 nm付近を吸収する成分が熱変性して， 495nm付近に鋭い山を画く成分に転換したかのようである。アルカリ側でも，一様な吸光度の低下を示す光の場合とは違って， 415nmと 605nm付近に明らかな等吸収点を持ちながら 495nmの吸収極大が減衰する。 b l u e 上述のような実験から，アメブラシの紫汁には光や熱 p u r p l e に抵抗性を持つものと持たないものの，少なくとも二つの成分が含まれていそうなことが推測される。そこで， p u r p l e 水溶液中の色素の性質を変えないで、，これらを手軽るに p i n k 分離する方法のーっとしてセファデックスによるゲノレ漉過を試みることにした。 p i n k まず内径 2 511lm，長さ 1 mのガラス管にセファデッ p i n k クス G-25を均等に詰め， 5mM の薄い酢酸緩衝液を流してゲ、ルを充分に平衡させる。このゲノレの上に新鮮な red o r a n g e F i g .3 . F r a c t i o n a t i o no fp u r p l e pigment on Sephadex G-25column. S everalmlo f the c e n t r i f u g e dp u r p l epigmentwasa p p l i e dt o t h ecolumn and e lu t i o n was c a r r i e d out c e t a t ehu 在e r . with5m Ma 400 500 WAVE LENGTH，nm 。 6 p ink f r a c t i o I l orange f r a c t i o n ーーー-pH 4.0 6 . 5 8 . 5 0 . 4 1 1 . 0 b l u ef r 百c t i o n 0 . 4 i ¥ ¥ / ¥ ¥ J/ 0 . 2恥抗馬込 ' ' _ _ ' ' 司多ι ぺL 。て~-:;~ 、、よミ ; 三さき詣 600 400 500 WAVE LENGTH ， nm F i g .4 . E f f e c t so f pHons p e c t r ao ft h ef r a c t i o n a t e d pigmentcomponents. B u f f e rs o l u t i o n s a lc o n c e n t r a t i o no fh i p h t h a l a t e(pH4 . 0 )， a c e t a t e (pH6 . 5 )， were0 . 1M i n 五n Tris-maleate-NaOH(pH8 . 5 )andglycine-NaOH(pH 1 1 . 0 ) . -124ー濃厚紫汁の除蛋白遠心上清液数 mlを加えて，酢酸緩衝液で展開する。このようにすると紫汁がゲルの中を下方 ooaaT nvnu 凶 Ozd﹃田区O 回国︿に移動する間に，オレンジ・赤・ピンク・紫・青などの色を持つ多数の成分が連続的に分離してくる。その様子は図 3に模式的に示した通りである。分離した両分は 2 個所に吸収極大を持つものが多いが，スベグトル変化め様子から，単ーまたは単一に近い吸収極大を示すオレンジ色画分 ( 4 9 5nm)，ピンク色画分の一部 ( 5 4 5nm)，。 5 9 5nm) の三者が紫汁の基本的構成および青色画分 ( 単位成分であると考えても良さそうである。すなわち， 3 赤色は 495nm成分(オレンジ色〉に少量の 545nm成 5 7 pH 9 1 1 F i g .6 . Changes i nl i g h t absorbance o f the f r a c t i o n a t e d pigment components. E x p e r i mentalc o n d i t i o n sweret h e same a st h o s e i nF i g .5 . 分(ピンク色〉が，ピンク色の大部分は 545nm成分に少量の 495nm成分が，紫色は 545nm成分に 595nm 成分(青色)が混合して出来たものと解釈できそうである。また，紫汁全体の酸性色が示す 565nmの大きな光 45と 595nmの両成分が一緒になって生吸収の山は， 5 じたスベグトルであるといえる。いま，分画をしない紫汁全体について， pHを変化させながら酸性色の吸収極大である 565nmとアルカリ色図 4に代表的な分離画分に対する pH の影響を示しの吸収極大である 505nmの吸光度を追跡すると図 5の .0でも 6 . 5 た。オレンジ色と赤色の両画分は， pHが 4 ような結果となる。同様に，分画して得た紫汁成分につでもスベクトルはほとんど変化せず，アルカリ側で吸収いて pHを変え，その画分の酸性側における吸収極大極大の位置が僅かに長波長側にずれるに過ぎない。しか波長で光吸収の変化を追うと図 6のようになる。両結果 .5の弱酸性でアルカリ色にし，ピンク色画分は pH6 を比較検討すると，紫汁全体の pHによる色調変化は移行し始め，アルカリ側では前二者と同じく 505nmに青色画分の変化に近似していることがわかる。したがっ吸収極大が移る。青色画分はさらに鋭敏で， pH4 .0でて紫汁の色は，主として青色成分が酸性色をとるかアルはきれいな青色を示すが pH6 .5では早くもピング色カリ色を呈するかによって大きく左右される筈で，このに変り， pH1 1 . 0の強アルカリでは黄褐色の沈殿を生ことからアメブラシの紫汁腺の内部もかなり酸性であろずる。うと推測される。つぎに分画して得た各成分に対する光と熱の影響を調熱の影響を示してある。この図から明らかなように，光 -a t505nm -- 5 1 : ヨ5 ¥ ﹂F 守、、﹃ンクおよび青色画分では 495nmをピークとする新たな吸収帯を形成する。このことは，ピンクと青色画分を構、、、ー。にあてるとどの画分も吸収極大の位置は変化せずに吸光度全体が減って槌色してしまう。加熱によっても各画分は周有の吸収極大における吸光度を減ずるが，同時にピ • i a ‘ 、 ‘! 、 ‘ 、、、、 ‘ ，、、 ‘ー ‘ r / 0 . 凶OZ4凶E Oω 図4 -ZEz----------' ・・・ : G a べてみた。図 7の左半分に直射光の影響を，右半分に加成する成分が，熱によりオレンジ色の成分に転換することを意味する。事実， 545nmと 595nmのスベグトル 3 5 7 pH 9 1 1 の山の低下に伴って 495nmの吸光度が増加するが，そ 13 の一方で 495nm成分も熱分解することは，オレンジお F i g .5 . Changesi nl i g h tabsorbanceo fp u r p l e pigmentunderv a r i o u spHc o n d i t i o n s .B u f f e r s o l u t i o n swere0 . 1M i nf i n a lc o n c e n t r a t i o n o fglycine-HCl(pH 1 . 0 4 . 0 )，a c e t a t e(pH 3 . 5 6 . 0 )，T r i s m a l e a t e -NaOH (pH5.5-9'0) e -NaOH(pH8 . 5 1 3 . 0 ) . andg l y c i n よび赤色画分のスベグトル変イ回当ら容易に知ることができる。このような成分の新成転換は見かけ上加熱約6 0 分で最高に達するが，同時に分解も生じているので熱転換が定量的に進行するものかどうかはにわかに結論できなし、。 -125ー 0 . 4 0 .2 0 . 6 0 . 4 r e df r a c t i o n ωOZ︿∞江O ω ∞︿ 0 . 4 p i n kf r a c t i o n 02 ハ 0 . 6 b l u ef r a c t i o n 0 . 4 ーダ : ユ¥ 。 ' ¥ ¥ 、ぬ 400 600 WAVE 400 500 LENGTH. nm 600 I I Fig.7. Lightdecompositionand heatd e n a t u r a t i o no ft h ef r a c t i o n a t e dp u r p l epigment components. Experimentwas c a r r i e do u ta t pH4.0 i n0 . 1M b i p h t h a l a t e b u f f e r . IV. 考白色の分泌物のためであって，紫色の着色物質そのもの察は無毒らしい。このほか臭物質も分泌物に含まれているアメフラシ類が刺戟されて乳白色または濃紫色の分泌物を放出することは古くから知られており，その研究もが，その研究は少なく，物質の由来も化学的性質も不明のままである。多い。分泌物のうち，乳白色のものは有毒で，その化学紫汁の主成分は，蛋白質に発色分子団が結合したもの的本態は食藻由来のテノレベン類である(安藤 1 9 5 2 )。濃である。蛋白質と発色分子団の結合は弱く，紫汁を塩酸紫色の分泌物は静脈注射するとかなり強い毒性を示すまたは酢酸で処理したり (Winkler1 959， N i s h i b o r i く Winkler1961 ) 。これは紫汁にまじって放出される乳 1 9 6 0 )，アセトン，アルコールまたはクロロホルムを作 -126ー用させると両者は容易に離れる ( Fontainee tRaffy V . 引用文献 d e r e re tHutter1 9 4 2，Christomanos1 9 5 5 )。 1 9 3 6，Le 1)安藤芳明. 1 9 5 2 : アメブラシの毒に関する知見. 遊離した発色分子団は有機溶媒で抽出できるが，水溶液科学， 2 2:87-88. とは異なる特異性の高い吸収スベクトノレを示すようにな 2 ) Chapman，D . J . and D .L .Fox 1 9 6 9 : B i l ep i g - るので，発色団の化学的研究には有機溶媒による抽出が mentmetabolismi nt h e 担 a・hare A p l y s i a .J . 多く用いられ，生物学的研究には酸処理による分離が多く使われる傾向がある。 Exp. Mar.B i o l . Eco ， . l4 :7 1ー7 8 . A. 1 9 5 5 : Natureo ft h epigment 3 ) Christomanos，発色分子団として，赤色の A plysiorhodin，紫色の o fAplysiad e p i l a n s .Nature， 1 7 5 :3 1 0 . A p l y s i o v i o l i nおよび青色の A p l y s i o a z u r i nの存在が 4 ) .Fontaine， M.e tA. Raffy 1 9 3 6 : Etudes p e c t r o ・知られているく Winkler1 9 5 9， Rudiger 1 9 6 7 ) 。これらは胆汁色素に属し，葉緑素の分解産物である m eso- chimique de l 'A p l y s i o p u r p u r i n e .C . R .S o c . e s o b i l i v e r d i n ~;こ極めて近い構造を持つ b i l i r u b i nや m ， . lP a r i s ，1 2 1 :7 3 5 ー7 3 6 . Bio なかでも A p l y s i o v i o l i n は比 5 ) Le d e r e r，E .e tC .Huttrer 1 9 4 2 : Quelqueso b s e - 較的良く研究されており，この物質はアメブラシが食べ r v a t i o n ss u rl a pigments de l as e c r < 己t i o nd e s ものと考えられている。 hycoerythrinが僅かに化学修た紅藻に含まれている p u n c t a t a ) .Trav.S o c .Chim. A p l y s i e s(Aplysiap 飾されてできたもので， Bio ， . l2 4: 1055-1061. アメブラシにとってはー穫の 6 )N i s h i b o r i ，K.1960: Studies on the pigments 排継物であると考えられている (ChapmanandFox 。 fmarinea n i m a l s .I X . Pigmentso ft h es e a . s l u g 。 1 9 6 9 ) Aplysiak u r o d a i .Publ .S e t o Mar. Biol . La b .，胆汁色素は 4個のピローノレ核がさまざまに修飾され 8 :327-335. て，赤・黄・緑・紫・青などに着色した物質になること 7 )Rudiger， W. 1 9 6 7 : むb e rd i e Abwehrfarbstoffe が知られている。本報告でも紫汁からオレンジ・赤・ピンク・紫・青などの多数の色が分離すること，および， vonAplysia.Arten ，1 .A p l y s i o v i o l i n ，einneuar・青やピンク色の成分は加熱することによってオレンジ色 t i g e rG a l l e n f a r b s t o 妊. H oppe-S ey l e r ' sZ .P h y s i o l . 348: 129-138. Chem.，の成分に転換することを示した。同じような変化はアメ . 1959: I n t r a s p e c i f i cv a r i a t i o ni n 8 ) Winkler，L ブラシの体の中でも起こっているのであろう。紫汁中の色の異なる多数の物質は互いに構造が近似していて，連 t h ep u r p l es e c r e t i o no ft h eC a l i f o r n i as e ahare，鎖的な部分変化でつながっているのかも知れない。いず Aplysiac a l i f Q r n i c aC o o p e r .P a c i f i c .S ci .，1 3 : れにしても，一見温和に見える直射日光が濃紫色の紫 357-361. 汁物質をいきなり無色の物質に転化し，激烈に見える .1 9 6 1 : Preliminary t e s t so ft h e 9 )Winkler，L 1000C前後の熱が化学的には小さな部分反応をひきお t o x i ne x t r a c t e d from C a l i f o r n i as e ah a r e so f こす，という質的に異なる効果が明らかになったわけ t h egenusA p l y s i a .P a c i f i cS c i .， 1 5 :211-214. で，紫汁におよぼす光と熱の作用様式を追究することによって更に興味深い知見が得られるかも知れない。 -127ー