北海道産野生キノコの アンジオテンシン変換酵素阻害活性

−資料−
北海道産野生キノコの
アンジオテンシン変換酵素阻害活性
津田真由美 原田 陽*1 青山 政和*2
斎藤 直人 関 一人 兼俊 明夫*3 林 隆章*3
Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory
Activities of Wild Mushrooms in Hokkaido
Mayumi TSUDA Akira HARADA Masakazu AOYAMA
Naoto SAITO Kazuto SEKI Akio KANETOSHI
Takaaki HAYASHI
Key Words:Angiotensin converting enzyme,enzyme inhibition,fungus,peptide
アンジオテンシン変換酵素,酵素阻害,菌類,ペプチド
1.はじめに
高血圧症は生活習慣病の代表的なものの1つで,心
臓病や脳卒中などを招く原因となりやすい。高血圧
症の大部分を占めるといわれる本態性高血圧症では,
レニン−アンジオテンシン系がその重要な因子と考
えられている。レニン−アンジオテンシン系におい
て,アンジオテンシンⅠ変換酵素(ACE)は生体内
でアンジオテンシンⅠを血圧上昇活性のより強い活
性ペプチドであるアンジオテンシンⅡへ変換するこ
とが知られている1)。ACE活性が阻害されると血圧が
降下することから,すでに数種類のACE阻害剤が血
圧降下薬として繁用されている。しかし,これらの
薬剤には副作用があり,また,作用時間が短いなど
の問題もあることから,新たな薬剤の開発が望まれ
ている2,3)。
これまで,植物4−8),食品9−14),キノコ15)でACE阻害
物質の検索が行われている。本報では,北海道産野
生キノコについてACE阻害活性を調べ,その活性物
質の性状を検討したので報告する。
〔J.HokkaidoFor.Prod.Res.Inst.Vol.14,No.2,2000〕
2. 材料および方法
2.1試料の調製
北海道内で採取した野生キノコと食用に人工栽培
されたキノコの136種類を試料とした。なお,薬用キ
ノコであるチョレイマイタケとブクリョウは輸入品
を使用した。シイタケは林産試験場保存株Le77−
2016),ツバナラタケは林産試験場保存株HFP−Am82−
10とHFP−Am82−1417),マンネンタケは市販株Ga86−
118)を使用した。
含水率80∼90%の子実体に,70%アセトン溶液と
なるようにアセトンを加え,一夜放置後ホモジナイ
ろ
ズした。抽出液を濾別後,残さをさらに試料の4∼5
倍量の70%アセトンで洗い,洗液を抽出液とあわせ
て減圧濃縮した。濃縮物をジメチルスルホキシド
(DMSO)に溶解し,試料溶液(濃度10,000μg/ml)
とした。
2.2 ACE阻害活性の測定
ACEはウサギ肺から精製されたもの(シグマ社製)
を,基質はhippuryl-L-histidyl-L-leucine(ペプチド研
北海道産野生キノコのアンジオテンシン変換酵素阻害活性
究所製)を,ACE阻害剤はカプトプリル(三共製薬)
3.結果および考察
を用いた。また,ウシ血清アルブミン(BSA)はシ
第1表にACE阻害活性試験の結果を示す。ノポリリ
グマ社製を用いた。
ュウタケ科,タコウキン科,マンネンタケ科,キシ
試験管に0.5Mホウ酸緩衝液(pH8.3)を0.1ml,
1.6MのNaClを含有するBSA溶液(2mg/ml)を0.25
ml入れ,氷水中に移した。さらに,酵素溶液(0.08
Unit/ml)0.05ml,試料溶液および蒸留水を加えて
全量を0.47mlとし,反応混合液とした。40mMの
基質溶液0.025mlを添加して,酵素反応を開始させ,
37℃で30分間振とうした後,10μg/mlのカプトプリ
ルを含有するアセトニトリル/メタノール/酢酸
メジ科,ヒトヨタケ科,スッポンタケ科などにACE
阻害活性が認められた。漢方で薬用キノコとして用
いられているチョレイマイタケとブクリョウには
ACE阻害活性が認められなかった。
北海道内の別地点で採取されたアシグロタケでは
採取地によるACE阻害活性の差異は認められなかっ
た。しかし,コショウイグチでは,旭川市近郊で採
(5:5:1)混液を1ml添加して反応を停止した。その
取した株の阻害活性は54%であったが,札幌市郊外
後,3,000rpmで5分間遠心分離して得られた上澄中
で採取した株には活性がなかった。同様にオシロイ
の馬尿酸をHPLC法 で定量した。試料溶液の阻害度
シメジやツリガネタケ,ウスタケなども,菌株によ
は,DMSOと蒸留水を添加したものを対照として求
つて活性に大きな違いが認められた。同じ種であっ
めた。
ても,菌株の違いや生育条件によって活性が異なる
2.3ブナシメジの栽培
と考えられる。したがって,人工栽培が行われてい
4)
供試菌株として,市販5菌株を用いた。ダケカンバ
びん
るハタケシメジやブナシメジでも,野生株の選抜や
(Betula ermanii Cham.)おが粉に,瓶当たり85gの
栽培条件の検討によって,より活性の高い品種を開
米ぬかを混合し ,水道水を加えて培地水分は63%と
発することが可能と思われた。
じゅうてん
した。これを850 ml容PP瓶に充填して高圧殺菌
スクリーニング試験の結果,500μg/mlの抽出物
(121℃,30分間)し,培地とした。培養は温度22±1
濃度で50%以上のACE阻害活性を示した14種15検体
か
℃,相対湿度70±5%で行い,まんじゆう形の菌掻き
操作の後,原基形成初期までは16±1℃,相対湿度85
の抽出物について,ACEに対する50%阻害濃度(IC50
±5%で,原基形成中期以降は16±1℃,相対湿度85
ウソクが最も高い阻害活性を示し,そのIC50は150
±5%,照度3501x(12時間/日)の条件で栽培した。
2.4ACE阻害物質の分離
ブナシメジのACE阻害物質の検索は予備的検討か
ら,水抽出物について行った。
ブナシメジの含水率を90%として,およそ10倍容
の蒸留水とともにホモジナイズした。その後,一晩
冷蔵庫内で撹拌して抽出し,遠心分離後,上澄を水
抽出物とした。水抽出物は蒸留水に溶解し,10倍容
値)を求めた。その結果を第2表に示す。キツネノロ
μg/mlであった。ついでコウタケ,ハタケシメジ,マ
ンネンタケ,ブナシメジ,コキララタケなどの順と
なった。なお,マンネンタケは薬用キノコとして栽
培,利用されており,そのトリテルペンがACE阻害
活性を持つことが報告されている15)。これら14種の
キノコの中でノポリリュウタケ,コウタケ,コカブ
イヌシメジ,ハタケシメジ,ブナシメジ,コキララ
のエタノール中に滴下して,エタノール可溶部と不
タケの6種は可食キノコである。代表的な合成ACE阻
溶部に分画した。エタノール可溶画分は溶媒分別を
害剤で,血圧降下薬として繁用されているカプトプ
行い,酢酸エチル層,2−ブタノン層,残さ(水層)に
リルのIC50は0.4ng/mlと報告されている4)。キノコの
分画した。その後,さらに残さ画分をSephadex LH−
血圧降下作用は合成薬剤と比較してかなり低いと判
20(3×90cm)(溶出条件:50%エタノール,0.12ml/
断される。しかし,これらの可食キノコは,副作用
min)によるゲルろ過クロマトグラフィーに供した。
が少なく,緩和な血圧降下作用が期待できる健康食
品として有望であると考えられる。
ACE阻害活性が認められ,生産量が多いブナシメ
ジについて,その活性画分の検討を行った。第3表に
ブナシメジ5菌株の栽培試験結果を示す。菌株間で,
〔林産試験場報 第14巻 第2号〕
北音
毎道 産 野 生 キ ノ コ のア ンジ オテ ンシ ン変 換 酵 素 阻害 活性
第1表
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キ ノ コの ア ンジ オ テ ン シ ン変 換 酵素 阻害 活 性
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注:1)‥札幌市郊外で採取 した。その他の試料は旭川市近郊で採取 した。
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:市販晩 3)
‥菌床栽培株,4)‥500 〃〆Ⅰ
舶に
N o te :1):S am p les w ere c olle cte d in S ap p oro .T h e o th ers w ere c olle cte d in A sah ik aw a .;2 ):m u Sh roo m s p urch ased ;3 ):G ro w n
〔 J.H o k k a id o F o r.P ro d .R e s .In st.V o l.
14 ,N o .
2 ,2 0 0 0 〕
ー1 2
−
北海道産野生キノコのアンジオテンシン変換酵素阻害活性
おける阻害率(%)。阻害率20%未満をn,20%以上30%未満を±,30%以上50%未満を+,50%以上を++で表示。
at mushroom bed;4):ACE inhibitory activity at 500μg/ml,++:≧50%;+:30−50%;±:20−30%;n:20%>.
〔林産試験場報 第14巻 第2号〕
北海 道 産野 生 キ ノ コ のア ンジ オテ ンシ ン変 換 酵 素 阻害 活 性
第2 表
A C E 阻害 活 性 を示 した キ ノ コの IC 50
1 七 b le 2 .1C 50 fo「 A C E a c tiv ity o f M u s h「0 0 m S .
科名
キノ コ
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1 5 0 1)
注:1):札 幌市郊外 で採取 した。 そ の他の試料 は旭川市近 郊で採 取 した。
N o te :
1 ):S a m p le s w e re c o lle c te d in S a p p o ro .T h e o th e r s w e r e c o lle c te d in A s a h ik a w a ・
栽培 目数 に 大 き な違 い は認 め られ な か っ た。 子 実 体
溶媒 分 別 残 さ画 分 が 高 か っ た 。 そ こ で , こ れ を
収量 は 菌株 1 と3が 142 g と多 く,品 質 A の割 合 も80?
ム
S ephadex L H −
2 0 に よ るゲル ろ過 ク ロマ トグ ラ フ ィー
以上 と高 か っ た。
によっ て 四つ の画 分 に分 けた。画 分 1(溶 出位 置 :160
∼2 05 Il嘘 )お よび 画 分2 (溶 出位 置 :20 5∼2 53 m β)
ブナ シ メジ 5 菌株 をそ れ ぞ れ 水 抽 出 し, 抽 出物 の
A C E 阻害 活 性 を調 べ た。水抽 出率 とA C E 阻 害 率 を第
のA C E 阻 害率 はそ れ ぞ れ2 9.
4 % と53.
7 % で ,画 分2 の
3 表 に示 す 。いず れ の菌株 も水抽 出 率 は約 70 %(対絶
I C 5。
は4 70 〃g/
m βで あ った 。 ま た , 画分 3 と4 (溶 出
乾重 量 ) で ,A C E 阻 害 率 は30 ∼4 0% で あ っ た。 菌株
位置 :2 53 Inβ∼ )に は活 性 が認 め られ な か っ た。画
1 は ,供 試 菌 株 の 中で 最 もA C E 阻 害活 性 が 高 く,IC ■
5。
分2 を薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィー (S ilica g e1 6 0 F 254,
は6 0 1 〃g /
m βで あ っ た 。
M E R C K )に供 した とこ ろ,数 個 のニ ン ヒ ドリン 陽性
物質 が 確 認 され た。 この こ とか らブ ナ シメ ジ のA C E
子実体 収 量 が 多 く,活性 が 高 か っ た菌株 1 の阻 害活
阻害 活性 物 質 は教 程 のオ リゴペ プ チ ドと推 定 され た。
性物 質 の検 索 を行 った。 そ の結 果 ,阻 害 活性 は エ タ
ノール 可溶 部 で 認 め られ た。 さ らに, この エ タ ノー
ー
ル可溶 部 につ い て 溶 媒 分別 を行 っ た とこ ろ, 活性 は
〔 J.H o k k a id o F o r.P r o d .R e s .In st.V o l.
14 ,N o .
2 ,2 0 0 0 〕
−1 4
−
北海 道 産 野生 キ ノ コの ア ンジ オ テ ン シ ン変換 酵 素 阻 害活 性
第3 表
ブナ シ メ ジ市 販 株 の 子 実体 収 量 とA C E 阻害 活 性
 ̄b ble3.
Yield off
「ujtbodiesand ACE inhibitoryactivityof伽 由胎usm ∂
m OJ℃US
(Peck)
B ig e lo w .
栽培 目数 1)
品質 (%)
子実体収量(g ノ
瓶)1)
慧慧
㌘二
蕪を 触
諾毛
3三
i。
S
D a y s fb r
A
c u lt i v a t i o n
水抽出率 (%)2■ A C E 阻害率 (%)3J
q u ality
W ater ACEinhibitory
B C extract activlty
( g /b o ttle )
1 1 15 .
0 ±0.
0
1 42.
8 ± 15 .
1
8 5
15
0
7 1 .
7
4 1.
6
2 1 17 .
1±0.
6
1 16 .
4 ± 10 .
2
5 1
4 3
5
6 5 .
5
3 2 .5
3 1 15 .
0 ±0.
0
1 4 1.
9 ± 1 1.
0
8 1
19
0
7 2 .1
4 1.
3
4 1 14 .
8 ±2.
7
1 28.
8 ± 10 .
2
3 8
62
0
7 2 .1
3 1 .5
5 1 16 .
8 ±0.
7
1 2 1.
5 ± 14 .
9
7 3 .
7
2 9 .
4
0 60
4 0
注‥1):平均 ±標 準偏差 ,2):対絶 乾重量 (
(施),3):500 〃g/
m ゼでのA C E 阻害率
N o te ‥1)‥m e.
an ± stan d a rd erro r ;2 )‥B a se d on ov en −
d ried sam p le(% );3 ):A C E in h ib ito ry
a c tlV ity a t 5 0 0 〃 g /
m β.
4 . ま とめ
9 ) K in o sh ita,E .
,Y am ak o sh i,J.an d K ik u ch i,M ∴ βわ∫C ∼
.
北海 道 内 で採 取 した 野 生 キ ノ コお よび食 用 に人 工
βわ ′
ec カ,βわc ゐe 肌 ,5 7 , 1 10 7 −1 1 10(1 9 9 3 )
.
栽培 され てい るキ ノ コの70 % ア セ トン抽 出物 につ い
1 0)斉藤義 幸
てA C E 阻害 活 性 を測 定 した。 そ の 結果 , キ ツネ ノ ロ
ほか3 孝一:日本農芸化学 会誌 ,6 6 ,
1 0 8 ト 1 0 8 7(1 99 2 ).
ウソク ,マ ンネ ンタ ケ,コ ウタ ケ ,ハ タ ケ シ メ ジ,ブ
1 1)N ak a m u ra ,Y リM asu d a,0 .a n d T ak an o ,T .
:βわ ∫C 7.
ナシ メ ジ, コキ ラ ラ タケ な どにA C E 阻害 活 性 が認 め
βわ ′
ec カ.βわc 力e 椚.
,6 0 , 4 8 8−
4 8 9(1 9 9 6).
られ た。後者 4 種 は 可食 キ ノ コで あ る こ とか ら,緩 和
1 2)関
な血 圧 降下 作 用 が 期待 で き る健 康 食 品 と して有 望 で
栄治
ほ か4 名 :日本 農 芸 化 学 会 誌 , 6 9 ,
1 0 1 3 −10 2 0 ( 1 9 9 5 ).
ある と考 え られ る。 そ して, ブ ナ シ メ ジのA C E 阻 害
1 3 )O k a m ato ,A .e 才α/
∴ βわ ∫C 才
.βわ ′
ec /
‡
.βわ c/
王
e∽ .
,5 9 ,
活性 主 要 画分 のIC 5。
は47 0 〃g/
m βで ,阻害 活 性物 質 は
1 1 4 7 −1 1 4 9 ( 1 9 9 5 ).
数種 の オ リゴペ プ チ ドと推 定 され た 。
1 4)関 栄治 ほか4名 :日本農芸化学会誌 70,21−
2 7 ( 1 9 9 6 ).
文献
1 5)M origiw a,
A.
eJαJ∴ C ゐe肌 用 α〃乃.β〟J/
.
,
34 , 3025−
1 ) 谷田 鳳 池上四郎,奥 彬 :有機医薬品化学,
3 0 2 8 ( 1 9 8 6 ).
1 6)富樫
化学 同人 ,237−
2 54(199 5)
.
講演集 ,N o .
25 ,62−
65(1993)
.
2 ) 猿 田享 男 ‥フ ァル マ シ ア, 27, 12 69−1272(199 1)
.
1 7)富 樫
3 ) 木 全 心 一 :フ ァル マ シア ,29 ,779−
784(1993)
.
4 ) 兼 俊 明夫
ほ か7名 :道衛 研 所 報 , 第42 集 ,5−
8,
巌 ,瀧 澤 南海 雄 :木 材 学 会 誌 , 4 1 ,2 1 ト
2 1 7 ( 1 9 9 5 ).
1 8)米 山彰造 ‥林 産試 だ よ り, 11月 号, 15−
18(1987)
.
( 1 9 9 2 ).
5 ) 兼 俊 明夫
巌 ,瀧 澤 南海 雄 :日本 木材 学 会北 海道 支部
( 原 稿 受 理 :1 1.
10.
15)
ほ か8名 :道衛 研 所 報 , 第4 3集 , 1−
5,
一利 用 部
( 1 9 9 3 ).
6 ) 高橋哲夫,佐藤隆司, 金島弘恭 :道衛研所報,第
4 3集 ,63−
64(1993)
.
−*1
きの こ部
生産 技 術 科 −
−*2
きの こ部
主任 研 究 員 −
−*3
7 ) K am eda,K .eJαJ∴ノb〟γ
〃αJ(オ肋 ′
〟rα/
P ro血 cね,
50 ,
成分 利用 料 一
北 海 道 立 衛 生研 究 所 −
6 8 0 −6 8 3 ( 1 9 8 7 ).
8 )Ueno,
H.
e′
α
J∴わ〟
川α
J仰 山和げ和血cね
,
51,
357−
3 5 9 ( 1 9 8 8 ).
〔 林 産 試 験 場報
−1 5
−
第 14巻
第2 号〕