抗原特異的結合活性を有する新しいシルク素材『アフィニティーシルク』アフィニティーシルク』の創出 scFv フィブロインＬ鎖 VH VL 一本鎖抗体(scFv)が融合されたが融合された一本鎖抗体絹フィブロインタンパク質を発現新規絹タンパク質を発現する遺伝子組換えカイコ（独）農業生物資源研究所動物生体防御研究ユニット動物生体防御研究ユニット佐藤充優れたタンパク質生産系としてのカイコ吐糸口セリシン ser-1 ser-2 ser-3 ・・・フィブロインL鎖・フィブロイン鎖 (FibL) ・P25 後部絹糸腺フィブロイン・フィブロインH鎖・フィブロイン鎖 (FibH) 前部絹糸腺中部絹糸腺カイコが吐く絹（シルク）はタンパク質からできている１個の繭からおよそ1.5kmに達する絹糸の単繊維がとれる。カイコの絹糸腺（模式図）遺伝子組換えカイコの利用・2000年にカイコの遺伝子組換え技術が確立された。・外来遺伝子の導入によりシルクタンパク質を改変し、物性の向上や機能性の付加を実現した新しいシルクを設計・創出することが可能となった。・目的のタンパク質をフィブロインとセリシンのどちらにも発現させることが可能。（例）・フィブロインと蛍光タンパク質の融合タンパク質 →蛍光絹糸・セリシン層にヒト血清アルブミンを発現させる →遊離・精製→活性のあるものがとれる。・組換えカイコを用いる最大のメリット →安価で大量にタンパク質を生産できることである安価で大量にタンパク質を生産できることである。安価で大量にタンパク質を生産できることである一本鎖抗体 (single chain variable fragment: scFv)とはとは抗原結合部位重鎖軽鎖 Linker:(GGGGS)3 可変部 VH (variable region) VL 抗体の低分子化定常部 (constant region) 一本鎖抗体 (scFv) 完全長抗体 (150kDa) (30kDa) 抗体のH鎖および抗体の鎖およびL鎖鎖および鎖可変部の遺伝子をクローニング DNA VH VL 抗原特異的な抗体を産生する細胞 VH linker VL 一本鎖抗体 (scFv)DNA フィブロインL鎖と一本鎖抗体の融合タンパク質をフィブロイン鎖と一本鎖抗体の融合タンパク質を発現する遺伝子組換えカイコ作製用ベクターの構築 BamH Ⅰ VH scFv cDNA HindⅢ Ⅲ linker VL Myc 一本鎖抗体(scFv) 一本鎖抗体 EcoR Ⅰ フィブロインL鎖フィブロイン鎖-scFv 発現ベクター発現ベクター Bgl Ⅱ Fib-L pro Fib-L 3’-UTR フィブロインL鎖フィブロイン鎖-scFv 融合タンパク融合タンパク質タンパク質〈マーカー遺伝子〉マーカー遺伝子〉 piggyBac R 3XP3-pro DsRed2 polyA Fib-L pro Fib-L VH linker VL Myc 3’-UTR piggyBac L 遺伝子組換えカイコ遺伝子組換えカイコ作製用えカイコ作製用ベクター作製用ベクター「転移酵素遺伝子」をもつヘルパープラスミドDNAと一緒にカイコ卵へ注入ゲノム中にランダムに挿入遺伝子組換えカイコ作出法顕微鏡下でカイコ卵に針で穴を開け、 DNAを注入するを注入するマーカー遺伝子(DsRed2)の発色での発色でマーカー遺伝子組換え体を選抜マーカー遺伝子(DsRed2)は視神経では視神経でマーカー遺伝子発現するように制御されているので組換えカイコの眼が赤くなる組換えタンパク質の発現と素材化コンセプト・フィブロインL鎖との融合タンパク質として発現させると、ネイティブなフィブロインL鎖の一部が組換えタンパク質に置き換わることで絹糸に発現する A C フィブロインH鎖フィブロイン鎖フィブロインL鎖フィブロイン鎖 scFv ヘテロ２量体化 P25 カイコ繭 20mm B フィブロインH鎖フィブロイン鎖 (>300kDa) フィブロインL鎖フィブロイン鎖 (~27kDa) フィブロイン繊維セリシン層 P25 FibL-scFv (~58kDa) x5.0k 20um 絹糸断面の走査型電子顕微鏡写真 C. カイコ絹糸腺内でのフィブロイン複合体形成フィブロインタンパク質は、後部絹糸腺でのみ合成・分泌され、 2本の繊維がセリシン層に包まれて絹糸となる。本の繊維がセリシン層に包まれて絹糸となる。組換えタンパク質の発現と素材化コンセプト・フィブロインL鎖との融合タンパク質として発現させると、ネイティブなフィブロインL鎖の一部が組換えタンパク質に置き換わることで絹糸に発現する A C 最大の特徴組換え抗体がフィブロイン複合体に「取り込まれ」シルク担体に固定される。ヘテロ２量体化 20mm B フィブロインH鎖フィブロイン鎖フィブロインL鎖フィブロイン鎖フィブロイン繊維セリシン層 P25 FibL-scFv x5.0k 20um 複合体形成組換えカイコ産生繭における組換えタンパク質の発現 EcoRI FibL-scFv 3xP3 pro SV40 FibL pro DsRed2 polyA BamHI FibL cDNA HindIII scFv Myc BglII FibL 3’UTR 〈フィブロインL鎖－一本鎖抗体発現組換えカイコベクターフィブロイン鎖－一本鎖抗体発現組換えカイコベクター〉鎖－一本鎖抗体発現組換えカイコベクター〉 EcoRI FibL-EGFP 3xP3 pro SV40 FibL pro DsRed2 polyA BamHI FibL cDNA HindIII EGFP BglII His FibL 3’UTR bright FibL-EGFP FibL-scFv wild FibL-EGFP FibL-scFv wild 〈フィブロインL鎖－緑色蛍光タンパク質発現組換えカイコベクターフィブロイン鎖－緑色蛍光タンパク質発現組換えカイコベクター〉鎖－緑色蛍光タンパク質発現組換えカイコベクター〉 EGFP 1 cm 1 cm 組換えカイコ産生繭からシルクパウダーの調整９M 臭化リチウムにより溶解組換えカイコ産生繭シルク水溶液透析濃縮・ゲル化凍結乾燥シルクゲル粉砕シルクパウダー 5 mm (x 500) 200 µm （直径1-40µ （直径 µmの小さな粒子）の小さな粒子）組換えカイコ由来シルクパウダーにおける組換えタンパク質の発現 scFv VH フィブロインＬ鎖 FibL-EGFP FibL-scFv wild FibL-EGFP FibL-scFv wild FibL-EGFP FibL-scFv wild FibL-EGFP FibL-scFv (kDa) wild VL 87.5 FibL-scFv-Myc FibL-EGFP-His 52.7 35.9 内在性FibL 内在性 27.9 クマシー染色抗Myc抗体抗体抗His抗体抗体抗FibL抗体抗体組換えカイコ由来シルクパウダーの結合活性の評価標的タンパク質：WASP 標的タンパク質： (Wiskott-Aldrich syndrome protein) WASP WASP WASP 免疫細胞で発現しているシグナル伝達分子マクロファージ（免疫系細胞） VS 抗WASP-scFv発現発現シルクパウダー抗WASP抗体抗体（完全長の抗体） PGS プロテインＧセファロース (PGS) （従来法）抗WASP抗体抗体コントロール IgG 細胞抽出液 (kDa) 85.6 WASP FibL-EGFP WASP 免疫沈降 FibL-scFv （シルクパウダー）（抗WASP抗体）抗体）（抗 wild 細胞抽出液と反応 WASP Y Y Y プルダウンプルダウン標的タンパク質を効率よく精製することが可能（前）（後）タンパク質アフィニティー精製用担体としての利用繭から様々な形状のシルク担体に加工処理することが可能糸シルクパウダーシルクフィルムシルク水溶液目的タンパク目的タンパク質タンパク質抗原アフィニティーシルクフィルムアフィニティーシルクパウダーアフィニティー精製用新素材アフィニティー精製用新素材の精製用新素材の開発抗原検出用新素材の抗原検出用新素材の開発シルクスポンジ細菌・ウイルス検出系や疾患マーカー検出系へ応用まとめ・組換えカイコの成虫は飛行不能なので、脱出などによる拡散はない。 → 人・環境に優しく安全な生産技術・製品として社会にアピール。・今後、アフィニティーシルク技術の実績を積み上げ、基礎研究レベルから実用化へとステージアップを図る。 → 試薬メーカー、診断薬メーカー、化学・材料メーカーとの連携。・新しい機能性を付加したシルクを生産する組換えカイコの利用により、長い歴史と伝統のある我が国の養蚕業に新たな道を開くことが期待される。日本発の日本発の『ネオ・シルクロード』ネオ・シルクロード』を展開していく展開していく！していく！本日はご本日はご清聴はご清聴ありがとうございました清聴ありがとうございました。ありがとうございました。 Thank you for your attention. 独立行政法人農業生物資源研究所について農業生物資源研究所について農業分野の生命科学の研究開発を進め、農業技術の発達やこれまでにない新しい生物産業の創出を目指して設立された、我が国最大の農業分野の基礎生命科学研究所です。これまでに、イネゲノムの全塩基配列解読やカイコの遺伝子組換え技術、体細胞クローン技術による遺伝子組換えブタ作出等、基礎的・先導的研究において世界をリードしてきました。