シングルステップの RNA 抽出試薬 RN-Sure Single Step Reagent Cat NO. HS-51-100 【使用方法】 【目的・用途】 RN-Sure Single-Step Reagent は、シングルステップで RNA を抽出するた めの、フェノールとグアニジンイソチオシアネート用いる手法を改良した試 薬です。細胞破砕・溶解時に本試薬を共存させることで、RNase を迅速に不 活性化します。その後、クロロホルムを添加すると、RNA は水層（上部透明 の層）に、タンパク質は有機層（下部赤色の層）に、DNA は両層の界面に移 動し、RNA を分取する事が可能です。得られた精製 RNA は、RT-PCR・マイ クロアレイ・ poly(A) + RNA セレクションなどに適用できます。 また、必要に応じて、DNA やタンパク質の層も分取し、エタノールやイソ プロパノールを用いて沈殿させることができます。 基本プロトコール １） サンプルの溶解 ① ■ 組織の場合■ 100mg 以下の組織片に 1mL の RN-Sure Single-Step Reagent を加えて ホモジナイザーを用いてサンプルを破砕した後、室温で 5 分間静置し ます。 ■ 培養細胞 (浮遊細胞)の場合■ 106 の細胞を遠心分離で回収し、1mL の RN-Sure Single-Step Reagent を加えてピペッティングで細胞を溶解しした後、室温で 5 分間静置し ます。 【特徴】 【注意】RN-Sure Single-Step Reagent を添加するまえに細胞ペレット 1） シングルステップの RNA 抽出が可能 2） 組織・培養細胞・バクテリア・植物・酵⺟等幅広い試料に適応 3） 操作時間は 1 時間以内 4） 下流の様々な実験に適用可能 を洗浄しないでください。 ■ 培養細胞（接着細胞）の場合 ■ 10cm2 ディッシュあたり 1mL の RN-Sure Single-Step Reagent をディ ッシュに直接加え、ピペッティングで細胞を溶解しした後、室温で 5 分間静置します。 【キット内容】 RN-Sure Single-Step Reagent 内容 RN-Sure Single-Step Reagent ２） RNA の分離 容量 100 mL RN-Sure Single-Step Reagent 1mL あたり、0.2mL のクロロホルムを添 加し、ボルテックスミキサーで激しく混合します。その後、4℃で 12,000 ×g、2 分間遠心します。一番上層の水相（RNA）を別のマイクロチュー ブに分取します。 【使用期限】 ３） RNA の沈殿 2〜8℃(遮光)にて 12 ヶ月 得られた水相（RNA 溶液）と等量のイソプロパノールを加えてボルテッ クスミキサーで混合した後、室温で 10 分間静置します。その後、4℃で 【本品以外に準備が必要な試薬・器具】 • クロロホルム • イソプロパノール • 75％エタノール • 氷 12,000×g、15 分間遠心し、上清を除去します。 ４） RNA の洗浄 ： 特級試薬をご使用ください 0.5mL の氷冷した 75％エタノール RNA ペレットを洗浄します。その後、 4℃で 12,000×g、1 分間遠心し、上清を除去します。 • メスシリンダー • マイクロピペット、ピペットチップ ５） ペレットの乾燥・再溶解 • ディスポーザブル手袋 RNA ペレットがチューブ壁に沈殿していることを確認しながら、余分な溶液 • ボルテックスミキサー を除去します(※)。その後、少量の RNase-Free 水 等で再溶解します。 【注意】この際、ペレットにチップが触れないように十分注意してください。 • 冷却遠心機 • 1.5mL, 2mL マイクロチューブ また、RNA ペレットは完全に乾燥してしまうとその後の溶解度が • RNase-Free 水 著しく低下しますので完全に乾燥する前に再溶解してください。 【Q&A】 Q1 相が完全に分離しない クロロホルムの純度が低い ・ イソアミルアルコール等の混入がない精製度の高いクロロホ ルムを使用する。 サンプルとクロロホルムの混合不足 サンプルと クロロホルムの混合不足 ・ クロロホルム添加後、激しく混合する。相が分離していない 場合、再度、15 秒以上激しくボルテックスミキサーで混合・ 遠心を実施する。 サンプルに有機溶媒等が含まれている ・ スタートサンプルがエタノールや DMSO などの有機溶媒や 強いアルカリ性溶液を含まないことを確認する。 Q2 RNA ペレットが再溶解できない ペレットを乾燥させすぎた ・ 真空乾燥せずに自然乾燥にするなど、乾燥の具合を弱める。 ・ 再溶解に使用する RNase-Free 水の量を増やす。 RNA ペレットにイソプロパノールが ペレットに イソプロパノールが残っている イソプロパノールが残っている ・ 75％エタノールでの洗浄を確実に実施する。 ・ 再溶解に使用する RNase-Free 水の量を増やす。 Q3 RNA の収量が低い ホ モジナイズが不十分 ・ サンプル量を減らすか加える RN-Sure Single-Step Reagent の量を増やす。 RNA ペレットが完全に溶解していない ・ Q4 ペレットが残っていないか確認する。 A260／A280 が低い RNRN -Sure SingleSingle -Step Reagent が少ない ・ サンプル量を減らすか加える RN-Sure Single-Step Reagent の量を増やす。 水相に有機相がコンタミネーションしている ・ 水相を分取する際、有機相が混入しないよう注意する。 タンパク質が溶解して タンパク質 が溶解していない が溶解して いない ・ ホモジナイズ後の室温で 5 分間静置する工程を確実に実施 する。この工程によって核タンパク質等が溶解される。 純度測定時の RNA 溶液の希釈を水で実施している 溶液の 希釈を水で実施している ・ 純度測定時の RNA 溶液希釈には、10mM Tris-HCl, pH7.5 等 を使用する。
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