一体型ATP測定試薬キットと小型ルミノメーターを用いた農
耕地土壌の微生物バイオマスの推定
誌名
日本土壌肥料學雜誌 = Journal of the science of soil and manure, Japan
ISSN
00290610
著者
青山, 正和
巻/号
82巻4号
掲載ページ
p. 305-308
発行年月
2011年8月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波事務所
Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat
305
炭素量との関係を検討し，
ノート
ATP量から徴生物バイオマス
炭素最への換算係数を求める必要がある.
そこで本研究では，
ATP量から徴生物バイオマス炭素
一 体 型 ATP測定試薬キットと小型ルミノメー
最へ換算するための係数を決定することを目的として，
ターを用いた農耕地土壌の微生物ノ〈イオマスの
壌タイプならびに土地利用(水田，畑，果樹園)の具なる
推定*
114点の農耕地土壌を採取し，クロロホルムくん蒸一抽
出法で土壌微生物バイオマス炭素最を測定するとともに
一体型試薬キットと小型ノレミノメーターを用いて土壌の
青山正和
ATPを測定し，両者の関係を検討した.
2
. 材料と方法
キーワード ATP
，微生物バイオマス，ノレミノメーター，
畑土壌，水国土壌
1)土壌試料
14点の土壌試料を採取し，実験
青森県内の農耕地から 1
に供した.内訳は，非黒ボク土畑土壌 47点(水田転換畑
土壌 5点およびリンゴ閤土壌 3点を含む)，非黒ボク土水
田土壌 24点，黒ボク土畑土壌 35点および黒ボク土水田土
壌 8点である.非黒ボク土は主にグライ土，灰色低地土，
1.はじめに
近年，土壌診断のための土壌分析は，農業生産現場に近
掲色低地土に分類される沖積土壌であり，畑土壌の一部は
い施設でも行われており，土壌改良に役立っている. しか
掲色森林土を含んでいる.また，黒ボク土は岩木山起源の
し土壌診断の項目は化学性に関するものが主であり，土
黒ボク土ならびに十和田・八Ej3田起源の黒ボク土からなる.
壌生物性の診断はほとんど行われていない.土壌生物性を
007年と 2008年の 7月から 1
1月までの期間に
畑土壌は 2
評価する場合，最初に必要となる情報は土壌徴生物量であ
008年と 2009年の 1
0
表層 10cmを 採 取 し 水 田 土 壌 は 2
る.土壌徴生物量は，一般に徴生物バイオマスとして評価
月から 1
1月までの期間に落水後の作土層から採取した.
され，主にクロロホルムくん蒸法，基質誘導呼吸法やアデ
採取した土壌は，湿潤状態のまま 2mmのふるいを通して
ノシン 5
' 一三リン酸 (ATP) 法が用いられている. しか
実験に用いた.土壌の一部は，ふるいを通した後に風乾し，
しながら， これらの徴生物バイオマス部定法は研究のため
化学分析に用いた.
に開発されたものであり，農協や普及センタ一等の農業生
産現場に近い施設で行うことは困難である.前報(青山，
2
) 化学分析
風乾土について，
pH(
H
z
O
) ならびに全炭素量と全窒
2
0
0
5
) において，著者は食品関連施設等における清浄度
.
5水懸褐液
素量を測定した. pH(HzO) は常法通り 1:2
検査の目的で比較的安価で市販されている ATP測定用の
一体型試薬キットと専用の小型/レミノメーターを用いて
についてガラス電極法で測定し，全炭素量と全窒素量は
NC-アナライザー(住友化学 SumigraphNC-90A) で分
黒ボク土の ATP測定を行い
析した.
ATP出定値とクロロホル
ムくん蒸一抽出法による微生物バイオマス炭素量との関
係を調べたところ，両者の間には高い正の相関関係が存在
することを報告した.ただしこの結果は黒ボク土，
しか
3
) 前培養
各土壌の乾土 60g相
にとり，
の湿潤土を 200mLビーカー
25Cで 7日間前培養した後， クロロホルムくん
0
も地域的にはかなり限定された土壌について得られたもの
蒸一抽出法による微生物バイオマス炭素の測定ならびに
であり，水田土壌を対象としていなかった. したがって，
ATPの測定に供した.前培養は各土壌について 3反復で
ATP測定用の一体型試薬キットと小型/レミノメーターを
行い，反復ごとにバイオマス炭素と ATPを l連で測定し
用いた農耕地土壌の徴生物ノくイオマス推定法を確立するた
た.なお，前培養に際して，前報(青山， 2
0
0
5
) では最大
めには，多くの土壌について ATP量と微生物バイオマス
容水量の 60%水分に調節したが，本研究で、は簡便化のた
め，土壌水分の調節は行わなかった.
4
) 微生物バイオマス炭素量の測定
MasakazuAOYAMA:E
s
t
i
m
a
t
i
o
no
fm
i
c
r
o
b
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lb
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tandah
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yl
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i
n
o
m
e
t
e
r
ネ本研究の主要部分は，平成 2
0年度科学技術振興機構重点地
域研究開発推進プログラム・シーズ発掘試験「低コストで
簡便迅速な土壌微生物診断法の開発j の一部として実施し
た.また，本研究の一部は 2
0
0
9年 9月の日本土壌肥料学会
京都大会で発表した.
0
3
6
8
5
6
1 弘前市文京町 3
)
弘前大学農学生命科学部 (
C
o
r
r
ε
s
p
o
n
d
i
n
gAuthor:青山正和
2
0
1
1年 2月四日受付・ 2
0
1
1年 5月 2
4臼受理
2巻 第 4号 p
.305~308 (
2
0
1
1
)
日本土壌肥料学雑誌第 8
0
0
5
) と同じく， Vancee
ta
l
.(
19
8
7
)の
前報(青山， 2
クロロホルムくん蒸一抽出法に基づ、いて行った.
5
) ATPの抽出
土壌からの ATP抽出には，広く使われているトリク
ロロ酢酸 (TCA) ーリン酸ーパラコートの混液を用いる
nkinsonandOades
，1
9
7
9
) では毒性が強く取り
方法(Je
0
0
5
) と同じ
扱いが難しいと考えたため，前報(青山， 2
く，ジメチルスルフォキシド (DMSO) とリン酸三ナト
リウムによる抽出法 (
B
a
ie
ta
l
.，1
9
8
8
) を用いた.前培養
日本土壌肥料学雑誌第 8
2巻 第 4号
306
(
2
0
1
1
)
した乾土1.0
0g相当量の湿潤土を 100mLビーカーに秤取
3. 結果と考察
10mLの DMSOを加えてスターラーで 2分間撹狩し
.OlMリン酸三ナトリウム、溶液を加えて
た後， 40mLの O
2分間撹持した.さらに超音波パス(アズワン US-1，出
力5
5W) 中で 2分間鵡音波処理を行った後，あらかじめ
0.005MMg-EDTAを含む O
.OlM グリシン溶液 (
p
H
7
.
5
)
10mLを入れた試験管に懸掲液 1mLをただちに加えて十
分に混合し，希釈懸濁液を調製した.以下の ATP測定に
供試土壌の pH (HzO
)は3
.
9
7
.
1の範閤にあり，土壌
し
，
有機物含量の指標となる全炭素量も 4
.
2
8
8
.
8
gk
g
-1の範
囲にあった.非黒ボク土の畑地と水田ならびに黒ボク
の畑地と水自に分けて頻度分布をみた場合にも，それぞれ
広い範囲をカバーしていた(表 1).なお， pH (
狂20) の
土壌別の平均値±標準偏援は，非黒ボク土・畑地で 5
.
5
4
く，拭き取り試験用の一体型試薬キットであるキッコーマ
0
.
2
7，黒ボク土・畑
地で 5
.
6
9土 0
.
5
1，黒ボク土・水田で 5
.
5
8と
こ0
.
2
9であり，
5
.
6土 l
1
.9
gkg-1，
全炭素量のそれは，非黒ボク土・畑地で 2
非黒ボク土・水田で 2
9
.
7ご
と 6
.
1
gk
g
l，黒ボク土・畑地で
1
4
9
.
6:
!
:1
8
.
6
gk
g
-，黒ポク土・水田で 6
0
.
8:
!
:1
7.
4
gk
g
-1
ン社製ノレシパックワイドと専用の小型ノレミノメーター(東
であった.
はこの希釈懸濁液を用いた.
6
) ATPの測定
0
0
5
) と同じ
上記の希釈懸濁液について，前報(青山， 2
軍
DKKAF-20) を用いて ATPを測定した.測定に際し
:
!
:0
.
7
8，非黒ボクゴ二・水田で 5
.
1
7と
ご
これらの土壌について，一体型試薬キットと小型/レミノ
て，ルシパックワイド本体から綿棒ホルダーを引き抜いた
メーターを用いて ATP最を測定し，
後，抽出試薬のーとの隔膜上に希釈懸濁液 100μLを注入し
法で測定した徴生物バイオマス炭素量との関係を検討した
た.つぎに，綿棒ホルダーを本体に蔑して強く押し込み，
ところ，荷者の間には正の相関関係が認められた.ただ
クロロホノレムくん蒸
2枚の隔膜を破って測定チューブまで挿入した.その直後
し畑土壌と水田土壌とでは傾向が大きく異なっており，
に，本体を数回強く降りおろし測定チューブ内で土壌懸
水自転換畑土壌は水田土壌と同じ傾向にあった.水田転換
濁液，抽出液および発光試薬を十分に混合した後，小型ノレ
畑土壌を株いた畑土壌について ATP量 (
X
) と徴生物ノ〈
ミノメーターに装着しスタートボタンを押して相対発光
イオマス炭素量 (
Y
) との関係を原点を通る一次回帰式に
(
R
e
l
a
t
i
v
eL
i
g
h
tU
n
i
t;RLU) を測定した. RLUは
， I
司
一試料について連続して 5
1
0回測定し，最大値を記録し
た.それとは別に，上述の希釈懸渇液 1mLに対して ATP
標準溶液(10
0pg~tVl) 1
0
0μLを 加 え た 液 を 調 製 し こ
の1
1
0uLに対して上記と同様に RLUを測定した.さら
に，ブランクとして抽出試薬のみの RLUの測定を行った.
ATP量は，下記の式により算出した.
当てはめると(鴎 1
A
)，Y=117Xという関係式が得られた
(
r
=
=
0
.
8
6料*).なお， この中にはりンゴ圏土壌も合まれて
いる.これに対して，水田土壌と水田転換畑土壌の場合に
は(密1B)，非黒ボク土，黒ボク土を問わず，
Y
=
=
2
0
2
X
という関係式が得られた (
r
=
0
.
6
7料*)•
これらの関係式における傾きは，徴生物バイオマス炭素
と ATPの比(バイオマス炭素 /ATP比)に相当するが，
この数値に土壌の化学性が影響しているかどうかを検討す
C= (
N
B
)
/
(
M
N
)X 1
0
-3
るため，
μ
g
)， Bはブラン
Cは希釈抽出液 100μL中の ATP量 (
，
U Nは ATP標 準 液 無 添 加 の 場 合 の RLU
，
Mは
クの RL
ATP標準液を添加した場合の RLUである.なお， B
a
ie
t
a
l
.(
19
8
8
) と羽a
r
t
e
n
s(
2
0
01)の研究において ATPの回
収率はほぼ 100%であったとされていることから，乾土あ
たりの ATP量の算出にあたっては，回収率を考慮しなかっ
pHと全炭素量によって土壌を細区分して個々の
土壌のバイオマス炭素/ATP比 を 計 算 し そ れ ら の 平 均
値に有意差があるかどうかを検定した(表 2
)
. 水田およ
び水田転換畑の黒ボク土については，細区分しなかった.
畑土壌と水田土壌および、水田転換畑土壌との聞には，統計
的に有意な差が検出されたが，
pHと全炭素量は有意な影
響を及ぼしていないことが認められた.なお，バイオマス
炭素 /ATP比を儒別に計算した場合には，回帰式から得
た.
られたバイオマス炭素/ATP比よりやや高い値が得られ
託20) と全炭素設の頻度分布
表 1 供試土壌 pH(
pH(
H20)
土壌
く 4
.
0 4
.
5
5
.
0 5
.
0
5
.
5 5
.
0
6
.
5 6
.
5
7
.
0
.
0
4
.
5 4
.
5
6
.
0 6
非巣ボク土・畑地
1
4
2
1
0
1
0
1
1
8
黒ボク土・対日地
O
2
9
1
7
1
5
1
非黒ボク土・水田
O
O
O
5
1
7
2
O
泉ボク土・水田
O
O
5
2
l
O
O
土壌
1
O
O
O
全炭素設 (gkg→)
2
0
1
5
く
非黒ボク土・!畑地
黒ボク土・畑地
J
o
o
l
累ボクニヒ・水田
黒ボクゴ二・水田
>7
.
0
l
l
O
2
0
3
0
2
0
4
1
1
3
0
4
0
7
6
1
1
O
O
4
0
5
0
2
9
1
3
5
0
6
0
3
4
6
0
7
0
7
0
8
0
8
0
9
0
O
O
4
6
O
O
O
O
l
O
l
O
2
2
青山:一体型 A
TP測定試薬キットと小型ノレミノメーターを用いた農耕地土壌の微生物ノくイオマスの推定
5
0
0
2
5
0
0
(
A
)
、
，
@
二400
307
bj)
(
B
)
2
0
0
0
震
護3∞
1
5
0
0
z
r
<
2
0
0
1
0
0
0
T
y=117x
r=
0
.
8
6
付*
e
〆
暴1
0
0
剥
豊
臣
2
3
4
y=2
0
2x
r
=0.67***
5
0
0
5
0
0
5
1
0
1
5
2
0
2
5
A
T
P(
m
gk
g
-1)
関
1 水回転換畑土壌な除いた畑土壌 (
A
) ならびに水田土壌と水回転換焔土壌 (B) における
A
T
P最と微生物バイオマス最の関係
O非祭ボクニと:矧l
土壌 ;
e泉ボク土畑土壌;ム非黒ボク土水国土壌;
印非黒ボクニ!こ水回転換~関土壌;企黒ボク土水回. *
**0.1%水準で有意
表 2 土地利用， 土壌タイプ，
p
Hと全炭素主主とバイオマス炭素/A
T
P比
水回転換畑を除いた畑地
l
水田および水田転換J1J
黒ボク土
非黒ボク土
黒ボク土
非然ボクオ二
20
E旦(H
)
〈 5
.
0
5
.
0
6
.
0
く 5
.
0
>6
.
0
5
.
0
6
.
0
く 5
.
0
>6
.
0
>5
.
0
>5
.
0
2
0土 8a 1
2
4土 8a 1
0a 1
1
7土 11a 1
こ1
1a 2
1
1
2土 1
1
2土 14a 1
4
0と
2
4土 28b
3
9と
こ2
0b 2
こ1
5b 2
5
6と
(
1
0
)
(
1
7
)
(
3
)
(
2
2
)
(
8
)
(
8
)
(
15
)
(
10
)
(
21
)
全炭素設 (gkg-1)
〈 2
0
20-30
>3
0
<4
0
4
0…6
0
>6
0
<3
0
〉 3
0
>4
0
1
0
3
5
4土 1
と8a
1
2
3土 1
0a 1
2
8土 8a 1
2
3と
こ1
3a 1
3
1と
こ1
0a 1
2
8と
ご1
0a 2
3
4と
こ1
7b 2
6b 2
2
4と
こ2
8b
(
1
5
)
(
1
4
)
(
1
7
)
(
10
)
(
1
1
)
(
13
)
(
1
1
)
(
15
)
(
8
)
王子均領土標準誤差.表中のアルファベットは引lkey法による多重比較検定の結果を示し 向記号は 5%水準で
有意義がないことを示す.カッコ内の数字は試料数.
ATP量から微生物バイオマス炭素量を推定するに
いる.これを mgkg-1乾土で表した微生物バイオマス炭素
は，囲 l
帰式から得られた備を換算係数として用いる方が汎
(
Y
) と ATP量 (
X
) で示すと， Y=190Xとなる.た
たが，
用性は高いと考えられる. したがって，畑土壌では A
TP
測定値を
1
1
7倍，水田土壌と水自転換熔土壌で、は 2
0
2倍す
ることにより徴生物バイオマス炭素最に換算で、きる.
前報(青山，
2
0
0
5
) において， 7点の黒ボク土畑土壌お
TP測定植の多くは，
だし彼らが用いた A
酸
トリクロロ酢
(
T
C
A
)， リン酸およびパラコートを用いた抽出によっ
て得ーられたものである.一方，
M
a
r
t
e
n
s(
2
0
01)は，本
研究で採用したと向じ DMSO-リン酸三ナトリウムによ
ATPを 抽 出 し て い る が ， バ イ オ マ ス 炭 素 /
よび未耕地土壌について本研究と閉じ一体型試薬キット
り土壌から
と小型ノレミノメーターで測定した A
TP量とクロロホルム
ATP 比は 208~217 であると報告している.
くん蒸法で測定した微生物バイオマス炭素量との関係は，
と比べると，本研究の畑土壌について得ーられた
Y=128Xで表されることを報告した. この関係は，本研究
で畑土壌について得られた Y
=117Xという関係に近いも
0
0
5
) では前培養時に土壌水分
ので、あった.前報(青山， 2
数値はかなり低い.
ATP測定は，ルシフェリンールシフエラーゼ反応、による
を最大容水量の 60%に調節したのに対して，本研究では
発光に基づいているが，さらにアデノシン 5
' ーーリン酸
これらの報告
1
1
7という
一体型試薬キットであるルシパックワイドを用いた
前培養特に水分調節を行わなかった.それにも関わらず，
(
A
M
P
) を ATPに変換する酵素であるピルベート・オル
ATP量と徴生物バイオマス炭素量との関係は大きくは変
ソフォスフェート・ジキナーゼを加えることによって，ル
わらなかったことから，前培養時の土壌水分の調節は必須
シフェリンールシフエラーゼ、反応で生じた AMPを蒋び
ATPに変換して発光強度を高めている(キッコーマン，
2
0
01
)
. このため，本法で求めた A
TP測定値は A抗 Pも
ではないと考えられた.
土壌の徴生物バイオマス炭素量と
ATP量との間の関係
については，多くの検討が行われてきている. C
o
n
t
i
ne
t
含めた値となり，実際より高く見積もられている可能性が
a
l
.(
2
0
01
) は，それまで得られていた多数のデータを取
ある. このことが， これまで、行われてきた研究と比べてバ
りまとめて，土壌の徴生物バイオマス炭素量と
ATP量と
TP比が低い原田であると推定される.
イオマス炭素/A
ATP(~mol g-l乾土) =0
.
0
1
4x徴生物バイオ
水田土壌と水回転換畑土壌に関しては，バイオマス炭素
μgg-l乾土)の関係が成り立つことを報告して
マス炭素 (
/ATP比は 2
0
2と，畑土壌と比べてかなり高い植を示し
の簡には，
日本土壌肥料学雑誌、第 8
2巻 第 4号
308
(
2
0
11
)
た. lnubushie
ta
l
.(
19
9
1
) は，土壌を湛水条件下と好気
ため，現場に近い施設で土壌生物性の診断に用いるには，
条件下で培養して ATP量と微生物バイオマスの変化を追
前培養を含めた前処理および抽出法のさらなる検討が必要
跡し，楳水条件下ではいずれの値も減少するが，徴生物バ
であると考える.
イオマスより ATP量の減少が著しいことを報告している.
謝
辞:本研究を行うにあたり，実験を担当された西
このことは，湛 7
]
(条件下ではバイオマス炭素 /ATP比が
塚由季子さん，林
上昇することを意味している.本研究で使用した水田土壌，
いたします.
沙樹さんならびに山田智珠さんに感謝
水回転換畑土壌のいずれも採取時には湛水状態、で、はなかっ
文 献
たが，湛水条件を経ることもしくは水分過多の状態が土壌
の徴生物バイオマスと ATPの関係に影響を及ぼしている
可能性が示唆される. Shibaharaandlnubushi(
1995) は
，
湛水前の水田土壌について TCAーリン酸で、抽出した ATP
量を測定しクロロホルムくん蒸一抽出法で測定した徴
生物バイオマス炭素量との関係を検討している.彼らの結
果からバイオマス炭素/ATP比を求めると，
232となり，
Contine
ta
l
.(
2
0
01
) が畑土壌に関して得た 190より大き
な値となった. このように，水田土壌では畑土壌と比べて
バイオマス炭素/ATP比が高くなることが認められてお
り，本研ー究での結果と一致している.
以上のように，
DMSO- リン轍三ナトリウム抽出後に
清浄度検査用の一体型 ATP測定試薬キットとノト型ノレミノ
メーターを使うことによって，土壌徴生物バイオマス炭
素量が推定可能であることが示された.ただし，畑土壌と
水田転換畑土壌を含めた水田土壌とでは ATP測定値から
徴生物バイオマス炭素量への換算係数は異なり，前者では
ATP測定{直を 117倍，後者では 202倍することによって
徴生物バイオマス炭素量に換算で、きることが判明した.本
法は，清浄度検査用の一体型試薬キットと小型ノレミノメー
ターを用いているので，測定操作自体は簡易に行うことが
できるが，抽出にはスターラーと超音波パスを用いている
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