H. pylori

モンゴル乳製品より分離したプロバイオティクス
乳酸菌のピロリ菌増殖抑制と機能性チーズの開発
当研究室は保健機能に着目した新たな機能性チーズの開発を目指し、その基盤研
究としてチーズの機能性の解明とその発現に関わるチーズスターターについて研究
している。
本研究ではモンゴル乳製品よりプロバイオティクスとして分離した乳酸菌のチー
ズスターターとしての利用を目的に、本菌の機能性解明の一つとして胃潰瘍や胃癌
などの原因菌として知られているピロリ菌増殖抑制作用について調べた．
農学部井越敬司
２０１４年３月１３日（木）
ピロリ菌抑制実験方法
供試菌
・Lb．plantarum 7, 69, 151, 361, 432, 453, 1811 の合計7株
・Lb．paracasei L-1．L-2．171．353．402．481．572．633 の合計8株
これら乳酸菌は胃酸、胆汁酸耐性およびCaco2細胞付着性が認められている(S. Takeda, et al.,
2011, Anim Sci J. 82, 571-9) 。
・ Helicobacter pylori HP130:東海大学医学部より分譲
H. pyloriと乳酸菌の混合培養
乳酸菌：MRS培地(1日)
HP 130: BHI培地（2日）
Lb. plantarum脱脂乳培養
前培養：MRS培地
10％脱脂乳
前培養
40μl
0.4ml
0.4ml
40ml
混合(BHI培地3.6 ml)
培養
0、24、48、72 hrs
微好気培養
48 hrs、37℃
培養液
生菌数
MRS寒天培地、37℃
培養液
滅菌後 pH測定
MRS寒天培地
37℃、好気培養
抗生物質含BHI寒天培地
37℃、微好気培養
・
・
・
pH測定
タンパク質分解
Prpteplytic Inndex(PI)
4％TCA可溶性物質を
ローリー・フェノール法
で発色（660nm）
ODS-HPLC：ペプチド
遊離アミノ酸
Lb.plantarum
Lb.paracasei
Viable cell counts of H.pylori HP130(LogCFU/ml)
H.pylori HP130の増殖におよぼす乳酸菌の影響
Lb.paracasei
pH of Broth
Lb.plantarum
Viable cell counts of H.pylori HP130(LogCFU/ml)
H.pylori HP130とLb.paracaseiの混合培養における
pHとH.pylori HP130増殖との相関
Lb.paracasei
pH of Broth
Viable Cell Counts of
（LogCFU/ml）
Lb.plantarum
Culture time(hrs)
脱脂乳培養におけるLb.plantarumとLb.paracaseiの増殖性
選抜菌L. paracasei L2とL. plantarum 1811株のピロリ菌増殖抑制
供試菌
・モンゴル乳製品より分離したL. paracasei L2，L. plantarum 1811
・L. paracasei JCM1171, L. plantarum JCM 1558
・Helicobacter pylori NCTC11637, No.130：クラリスロマイシン(以下CAM)感受性株
TM15，TK21：クラリスロマイシン(CAM)耐性株
東海大学医学部より分譲
供試乳酸菌の酸耐性試験
L2株, 1811株, JCM1171株, JCM1558株
H.Pyloriと乳酸菌との混合培養
H.pylori:BHI培地(3日)
前培養
MRS broth
37℃，18hrs培養
乳酸菌培養液
各20µl添加
1/10Mクエン酸緩衝液
(pH1.5，pH2.0)
0.1ml
20µl
混合(BHI broth 10 ml)
微好気培養(37℃, O2:5%, N2:85%, CO2:10%)
37℃，0，30，60，120(min)
放置
0，10，24，48，72 hrs 培養
培養液
MRS寒天培地
37℃，24hrs嫌気培養
菌数測定
乳酸菌:MRS培地(2日)
変法スキロ－培地
37℃，微好気培養
菌数測定
MRS培地
37℃，嫌気培養
H.pylori No.130の増殖におよぼすL.paracasei L2とL.plantarum 1811の影響
H.pylori No.130+L.paracasei L2
10
H.Pylori No.130
6
5
H.pylori No.130+L.plantarum 1811
4
3
H.pylori No.130+L.paracasei L2
2
乳酸菌生菌数(Log10 CFU/ml)
H.pylori生菌数(Log10 CFU/ml)
7
1
9
8
7
H.pylori No.130+L.plantarum 1811
6
5
4
3
2
1
0
12
24
36
48
60
72
0
12
Incubation Time(h)
7
H.pylori菌数(Log10 CFU/ml)
H.pylori No.130+L.plantarum 1811
乳酸濃度(mM)
16
H.pylori No.130+L.paracasei L2
8
4
36
48
60
72
Incubation Time(h)
20
12
24
H.Pylori No.130
乳酸菌培養液による抑制効果
6
H.pylori No.130+L.plantaraum 1811濾液
5
4
3
2
H.pylori No.130+L.paracasei L2濾液
1
0
0
12
24
36
48
Incubation Time(h)
60
72
40
60
80
培養濾液濃度(%)
100
H.pylori CAM感受性株と乳酸菌共培養中のピロリ菌数
H. pylori No.130
H.pylori生菌数(Log10 CFU/ml)
7
H. pylori NCTC11637
7
6
6
No.130
5
4
4
3
3
+L.paracasei L2
2
NCTC11637
5
+L.paracasei L2
2
1
1
0
12
24
36
48
60
0
72
12
24
36
48
60
72
7
6
7
6
5
4
3
2
1
No.130
NCTC11637
5
4
+L.plantarum 1811
3
2
+L.plantarum 1811
1
0
12
24
36
48
60
72
0
12
Incubation time(h)
24
36
48
60
72
H.pylori CAM耐性株と乳酸菌共培養中のピロリ菌数
H. pylori TK21
H.pylori生菌数(Log10 CFU/ml)
H. pylori TM15
7
7
6
5
4
3
2
6
TM15
5
TK21
4
3
+L.paracasei L2
+L.paracasei L2
2
1
1
0
7
6
5
4
3
2
1
12
24
36
48
60
72
7
0
12
24
36
48
60
72
6
5
TM15
4
TK21
3
+L.plantarum 1811
+L.plantarum 1811
2
1
0
12
24
36
48
60
72
0
12
Incubation Time(h)
24
36
48
60
72
マウスを使用したIn vivo 実験
実験動物
GF BALB/C 4週齢マウス(♂・♀)
菌数測定培地
●変法スキロー培地(H.pylori用)
感染微生物
H.pylori No.130
●MRS寒天培地(乳酸菌用)
スケジュール
1.Control 水投与(n=8)
2.L.paracasei L2 (n=7)
3.L.plantarum 1811 (n=7)
H.pylori感染マウス/day 連日経口投与4週間
H.pylori No.130
H.pylori感染マウス
連日経口投与4日間
…………………...
0
ピロリ菌
2
4
6
8
(週)
乳酸菌一ヶ月投与・解剖
乳酸菌による
乳酸菌
ピロリ菌抑制効果を確認!!
感染確認のため
一部屠殺
屠殺・胃摘出後,
菌数測定
乳酸菌生菌数(Log10CFU/g)
H.Pylori生菌数(Log10CFU/g)
H.pylori感染マウスにおけるL.paracasei L2および
L.plantarum 1811の抑制効果と乳酸菌生菌数
5.0
※※
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
乳酸菌投与前
Control
水投与
※
L.paracasei
L.plantarum
L.paracaseiL2 L.plantarum
L2投与
投与
1811
投与
1811投与
6
5.5
5
4.5
4
L2
L.paracasei L2
L.plantarum 1811
1811
※※ P＜0.01
※ P＜0.05
Helicobacter pyloriによるヒト胃上皮
細胞株からの炎症性サイトカインIL8産生抑制作用の検討
供試菌
・乳酸菌： Lactobacillus (L.) delbrueckii ssp. delbrueckii 643
L. plantarum 7, 69, 361(06TCa40), 432, 453
L. paracasei ssp. L-1, L-2, 481, 633
・ピロリ菌： Helicobacter pylori HP130 (東海大医学部より分譲)
・細胞：胃ガン細胞株MKN45
乳酸菌
MRS broth 37℃ 24h
MKN45 (JCRB0254)
5×105 cell/mL
37℃, 48h
5% CO2
37℃, 24h
5% CO2
HP130
BHI broth 37℃ 48h
(1×108 CFU/mL)
ELISA分析
IL-8 (感度: 2 pg/mL)
MKN45のIL-8産生におよぼすピロリ菌濃度の影響
ピロリ菌によるMKN45のIL-8産生の経時変化
IL-8産生を抑制する乳酸菌株のスクリーニング
L. delbrueckii 643
L. paracasei 633
L. paracasei 481
L. plantarum 453
L. plantarum 432
L. plantarum 361
L. plantarum 69
L. plantarum 7
L. paracasei L-2
L. paracasei L-1
ブランク
(107 CFU/mL添加)
IL-8産生抑制に対する乳酸菌濃度の影響
ブランク
105
106
107
L-2株菌数 (CFU/mL)
108
乳酸菌株
EC50
(CFU/ml)
L. delbrueckii 643株
ND
L. paracasei 633株
8.1×106
L. paracasei 481株
1.5×107
L. plantarum 453株
6.3×107
L. plantarum 432株
4.5×107
L. plantarum 361株
5.6×107
L. plantarum 69株
2.1×107
L. plantarum 7株
3.3×107
L. paracasei L-2株
6.6×106
L. paracasei L-1株
5.1×107
機能性チーズの開発
Lb. paracasei L-2
乳酸菌スターター
酵素製剤の添加
トランスグルタミナーゼ
13℃，2ヶ月
凝乳酵素
熟成
三次機能成分
動脈硬化予
防，
高血圧予防，
胃潰瘍予防，
胃がん予防，
糖尿病予防
整腸作用，
Penicillium
roqueforti

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