遺伝子改変動物 • 同種あるいは異種に由来する遺伝子を外部から 人為的に導入して作成された動物を「遺伝子導入 動物」あるいは「トランスジェニック動物」と呼ぶ。 遺伝子改変技術 • 特定の遺伝子の機能を破壊する遺伝子ノックアウ ト技術やゲノム単位での遺伝子改変を行う技術に 由来する動物を含む広義での名称として、「遺伝 子改変動物」あるいは「形質転換動物」 という呼 称もある。 遺伝子導入技術の利用 遺伝子導入技術の利用 • 実験動物 （１） 農学研究 • 家畜 （１） 家畜の遺伝的改良 （２） 家畜生産物組成の改変 （３） 有用物質の生産 － 動物工場 （４） バイオリアクターの開発 （５） ヒト疾患モデルの開発 （６） 代替臓器の開発 － 家畜への応用の ための基礎研究 （２） 生物学研究 － 遺伝子機能解析 遺伝子制御領域解析 （３） 医学研究 － 病態モデル 疾患モデル 遺伝子治療モデル ベクターの例（GFP) 歴史 ニワトリβアクチン プロモータ グリーンマウス アンピシリン 耐性遺伝子 GFP遺伝子 1980 Gordon 初期胚前核へのプラスミドDNA顕微注入によるTG マウスの作出 1981 Gordon & Ruddle TGマウスの導入遺伝子の次世代への移行 を証明 1982 Palmiterら ヒト成長ホルモン遺伝子を導入してスーパーマウス を作出 1985 Brinsterら マウス 遺伝子導入効率に関係する原因を解析 Hammerら 中家畜（ヒツジ）で初めて遺伝子導入に成功 1989 Roschhaus ウシで初めて遺伝子導入に成功 1991 Krimperfortら 体外受精技術を応用したTGウシの作出 1999 Eyestone 体外受精技術を利用したTGウシの商業的利用 1 遺伝子導入法 １．初期胚前核注入法（顕微注入法） （マイクロインジェクション法） ２．精子ベクター法 精子にDNAを持ち込ませる ３．体細胞核移植法 遺伝子注入細胞との核置換法 ４．キメラ作成法 －ES細胞の利用 ５．ウイルスベクター法 ６．トランスポゾンの利用 前核期胚への遺伝子導入 精子ベクター法 • 精子にDNAを持ち込ませる方法。精巣上体精子 や射出精子を環状あるいは直鎖状DNAを含む 培養液で培養して精子表面にDNAを付着させた り、受精培地中にDNAを浮遊させたりして、人工 授精や体外受精で精子と同時に卵子内に持ち込 ませる。 • 前核注入法に比べて、サイズの大きな（100kb以 上）外来遺伝子分子を導入するのに適している。 家畜の前核期卵への遺伝子導入 家畜卵子は脂肪顆粒のため、内部を観察できない。 そのため、遠心分離を行い脂肪顆粒を片寄らせて から操作を行う。 体細胞核移植法 • 核移植技術を利用し、遺伝子導入細胞との核置 換法により遺伝子導入個体を作成する。 • 核移植による正常個体の作成効率が低いが、ES 細胞の利用できない家畜種で有用である。 • 導入細胞は、一般体細胞を用い、導入コピー数や 発現レベル解析などの解析後、最適な細胞を用 いて遺伝子導入個体を作製する。 2 核移植を利用した遺伝子導入 キメラ動物 キメラとは ２個以上の受精卵や受精卵と体細胞など、遺 伝的に起源を異にした細胞集団から構成され た生物個体 キメラ作成 （注入法） キメラ作成法を用いた トランスジェニックマウスの 作出法（１） ウイルスベクターの利用 • ウイルスの感染力を利用し、ウイルス中に目的の遺伝子 を組み込んで、ウイルスとともに導入する。 • ウイルスの胚への感染は、胚の状況に影響を受ける。 • 組み込むことができる遺伝子の大きさに制約がある。 ウイルスベクターの比較 ゲノム 導入遺伝子サイズ ゲノムへの組み込み キメラ作成法を用いた トランスジェニックマウスの 作出法（２） 発現期間 非増殖細胞への感染 毒性 レトロウイルス RNA レンチウイルス RNA アデノウイルス DNA 約8kb 約8kb 約8kb ○ ○ × 長い 長い 短い × ○ ○ なし なし あり 3 導入遺伝子の発現 • 組織特異的発現 特定の組織で発現する遺伝子のプロモータを利用するこ とにより、導入遺伝子を特定の組織で発現させることが できる。 • 時期特異的発現 個体発生の特定の時期に発現する遺伝子としてβ鎖グロ ビン遺伝子群などで、制御領域が解明されている。 トランスポゾンを用いた遺伝子組み換え スーパーマウス（左側） ウシ成長ホルモン遺伝子組換えブタ。皮下脂肪厚が減少し 赤味部分が増加している。 動物工場 アンチセンスDNAを導入したミニラット ヒトα１アンチトリプシンを 発現しているヒツジ 4 遺伝子導入 • ランダムな組み込み 一般には、染色体上の任意の場所に導入さ れる。 • 相同組換え 導入された遺伝子が染色体上の塩基配列と 相同性を持つ場合は、その場所で相同組換 えが起こる。 ランダム挿入 相同組換え ネオマイシン 耐性遺伝子 挿入用遺伝子 挿入用遺伝子 Neor 細胞遺伝子 Neor 遺伝子が挿入された細胞遺伝子 相同組み換え 遺伝子が置換された細胞遺伝子 ポジティブ・ネガティブセレクション法 相同組換え体の選択 ターゲティングベクター ランダム挿入 相同領域 相同領域 置換遺伝子 Ｘ neo Positive marker 標的遺伝子 TK Ｘ Negative marker 相同組換え 置換遺伝子 変異遺伝子 Neor 細胞遺伝子 Neor ゲノムDNA ネオマイシン 耐性遺伝子 neo 置換遺伝子 neo TK • ポジティブセレクション 導入遺伝子が組み込まれて発現すると、薬物耐 性遺伝子も発現するので、薬物添加培地で培養す ると、発現細胞が生き残る。ランダム挿入されたも のも、生き残ってしまう。 • ネガティブセレクション 相同領域外に配置された自殺遺伝子は、相同組 換え体では発現しないので生存するが、ランダム 挿入では、発現して細胞は死ぬ。 5 相同組み換え ポジティブ・ネガティブセレクション法 形質転換動物 相同組換え 置換遺伝子 ランダム挿入 1. neo 置換遺伝子 neo TK 1. ネオマイシン誘導体G418添加培地で培養すると、ネオマイシ ン耐性遺伝子(neo）発現株のみが、選択的に生き残る。 （ポジティブセレクション） 2. ガンシクロビル（GCV)は、チミジンキナーゼ（TK)によって活性 型に変化し、細胞毒性を持つようになるので、ランダム挿入に より、TKが発現している細胞は、死滅する。 （ネガティブセレクション） 遺伝子導入動物 (１) トランスジェニック動物 (Transgenic animal) 特定の遺伝子を導入した動物 (２) ノックイン動物 (Knock-in animal) 特定の場所に特定の遺伝子を入れた(あるいは置 換した)遺伝子を導入した動物 2. 遺伝子欠損動物 ノックアウト動物 (Knock-out animal) 特定の場所の遺伝子を破壊(あるいは不活性化)し た遺伝子を導入したマウス Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム 2つのloxP配列が同方向に位置している場合、CreによりloxP 配列間の遺伝子は切り出され環状化する Ｗｅｂ 脳科学辞典より Cre発現依存的遺伝子欠損（コンディショナルノックアウト） Ｗｅｂ 脳科学辞典より ジンクフィンガーモチーフ(ＺＦＮ)法 ２つのZFNがセンスとアンチセンスのDNAを認識すると、 FokI２量体が形成され、DNA切断活性を発揮する。 ＴＡＬＥＮ法 TALエフェクターがDNAを認識 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法 Cre発現依存的遺伝子発現 Ｗｅｂ 脳科学辞典より gRNAの5'末端の20塩基が標的DNAを認識。gRNAにリクルートさ れたCas9は、PAM配列上流の。番3と4番目の塩基の間を切断。 6
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