TaqMan® マルチプレックスリアルタイム ̶ - Life Technologies

プロダクトブリテン
®
TaqMan multiplex real-time PCR
TaqMan® マルチプレックスリアルタイム PCR
̶ サンプルからより多くのデータを収集
• 遺伝子発現定量及び SNP ジェノタイ
ピングのためのマルチプレックスリア
ルタイムPCRソリューション
• 新しい蛍光色素の A BY ® と JUN ® 、
QSY®クエンチャー、マルチプレックス
マスターミックスが増幅を最適化
Filters
Wavelength
（nm）
Emission
Spectra
• シングルプレックスと同じ感度で最高
4-plex までの反応を実現。初期サン
プル量を削減するとともに最適化プ
Dyes
ロセスを短縮
少量の貴重なサンプルから最大限の遺
伝子情報を引き出すのは容易ではあり
ません。特にトランスレーショナルリサ
ーチに用いる FFPE サンプルや腫瘍生
検サンプルでは、これが大きな課題とな
~517 nm
~551 nm
~580 nm
~617 nm
~654 nm
FAM™VIC®ABY®JUN®MP
図1. マルチプレックスリアルタイム PCR に用いる FAM™、VIC®、ABY®、JUN®の蛍光スペクトル
灰色のゾーンは、Applied Biosystems® リアルタイムPCRシステムで使用されている各フィルターに適応
しています（QuantStudio® 7/12K FlexリアルタイムPCRシステムでは1 ∼ 6 、QuantStudio® 6 Flex リア
ルタイムPCRシステム、および ViiA™ 7リアルタイムPCRシステム、7500/7500 Fast リアルタイムPCRシ
ステムでは 1 ∼ 5 が使用できます）。MP はMUSTANG PURPLE®を示します。
ックスqPCRソリューションを開発しま
• 4 つのターゲットを競合することな
した。このソリューションは、次のような
く同時に増幅するために新しく開発
すが、通常はマルチプレックスに比べて
製品構成で提供しています。
されたTaqMan® Multiplex Master
サンプル当たりのコストが上昇します。
• QSY® クエンチャーを持つTaqMan ®
プローブは、マルチプレックス PCR の
Mix 。このマスターミックスは、ROX®
ります。このような臨床研究サンプルに
はシングルプレックスqPCR が一般的で
また、複数のシングルアッセイを個々に
セットアップすると時間がかかり、必要
効率を最大限に高めます。この新し
の代わりにパッシブリファレンスとし
て、MUSTANG PURPLE®を含み、こ
いプローブは、FAM™、VIC®、ABY®、
れまでROX®の測定に使用していたチ
性もあります。
JUN ®と組み合わせることで、1 反応
で最高 4つのターゲットを増幅するこ
ました。
一方マルチプレックスqPCRは、1本のチ
とができます。これらの蛍光色素は、
なサンプル量も増えるため、複雑なプロ
ジェクトでは実験コストが激増する可能
ューブでサンプルに含まれる複数のター
ゲットを増幅および定量するため、必要
なサンプルや試薬の量を少なく抑える
ことができます。そこでライフテクノロ
ジーズは、複数の試薬が連携してデータ
の品質を改善し、最適化の時間をより
短縮するよう設計した完全なマルチプレ
スペクトルの重複を最小限に抑え、
相互に連携して最高の性能を発揮で
きるよう最適化されています（図1）。
また QSY®クエンチャーは、MGBクエ
ンチャーをもつプローブと完全に適
合します。
ャネルでJUN®を測定できるようにし
• デザイン済みアッセイ― A BY ® -QSY ®
プローブを使用した RNaseP 用アッセ
イと、JUN ® -QSY®プローブを使用した
GAPDH 用アッセイ。どちらもプライマ
ー濃度を制限したアッセイおよび非制限
プローブの性能向上
当マルチプレックスソリューションは、
QuantStudio® 6、7 および12K Flexリアル
タイムPCRシステム、ViiA™ 7 リアルタイム
PCRシステム、7500/7500 Fast リアルタ
イムPCRシステムでご利用いただけます。
新しいレポーター蛍光色素としての ABY®
およびJUN®と、MUSTANG PURPLE®パ
ッシブリファレンスの導入により、FAM™
および VIC ®と合わせて理想的な 4 色のマ
ルチプレックスアッセイが可能となりまし
た。FAM™および VIC®色素はMGBとQSY®
のどちらのクエンチャーも使用できます
が、ABY ® およびJUN ® はクエンチャーが
QSY®に限られますのでご注意ください。
他社製の色素の組み合わせと比較して、ラ
イフテクノロジーズの色素は大半のアッセ
イでより早いCt値を示します（図3）。
アッセイの双方を取り揃えています。
• ABY® 、JUN® 、MUSTANG PURPLE®
用キャリブレーションプレート。96ウェ
ル、96ウェル Fast、384ウェルの各フォ
ーマットでご用意しております。
• カスタムアッセイデザインサービス（有
料）は、専門のアッセイデザインチーム
がマルチプレックスアッセイのデザイン
を代行し、お客様の時間を節約します。
A
Amplification plot
3.5
3.0
5
2.5
4
2.0
△Rn
△Rn
マルチプレックスは、コストを削減し、貴
重なサンプルを有効利用します。しかし、
シングルプレックスと同様の感度を維持
することも重要です。そこで図2では、遺伝
子定量実験におけるシングルプレックスと
4-plexの結果を比較しました。
B
Amplification plot
6
データを損なうことなくマルチプレックスを実行
3
1.5
2
1.0
1
0.5
2
4
6
8
10
12
C
14
16
18
20
22
Cycle
24 26
28
30
32
34
36
38
4
6
8
10
12
D
Amplification plot
3.0
2
40
18
20
22
Cycle
24
26
28
30
32
34
36
38
40
28
30
32
34
36
38
40
△Rn
2.0
△Rn
2.5
2.0
16
Amplification plot
3.0
2.5
14
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
0.5
2
4
6
8
10
12
14 16
18
20 22
Cycle
24
26
28
30
32
34
36
38
40
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Cycle
24
26
図2. 遺伝子発現定量におけるシングルプレックスとマルチプレックスの比較
（ A ）EGFRアッセイ、FAM™ラベル、
（B） BRCA1 アッセイ、VIC ®ラベル、
（C） ESR1アッセイ、JUN®ラベル、
（D） RNaseP アッセイ、ABY®ラベル。QuantStudio® 7
®
リアルタイムPCRシステムで、TaqMan Multiplex Master Mix を使用して増幅しました。コントロール cDNA を10 μL あたり 20,000 pg ∼ 2 pg 含む希釈系列を調製
し、4つのシングルプレックス（青）と4-plex（赤）で実施した結果、いずれも稀釈倍率に応じた増幅曲線を得ることができました。希釈系列の C t値の平均（線グラフ）と
標準偏差（棒グラフ）をそれぞれひとつのグラフに表示し、シングルプレックスと4-plex の結果がほぼ一致していることを確認しました。PCR 効率は、EGFR でシングル
プレックスが 96.09%に対し 4-plex が 96.39% 、BRCA1でシングルプレックスが 93.56%に対し 4-plex が 94.93% 、ESR1でシングルプレックスが 97.13%に対し 4-plex が
95.81% 、RNaseP でシングルプレックスが 96.91%に対し4-plex が 98.1%でした。
B2M assay
0.5
Standard Deviation
0.4
0.35
20
0.3
15℃
0.25
0.2
10
0.15
0.1
HPRT assay
0.5
30
0.45
25
25
0.4
0.35
20
0.3
0.25
15 ℃
0.2
10
0.15
0.1
5
0.05
5
0.05
0
C
B
30
0.45
Standard Deviation
A
FAM
VIC
ABY
0
JUN
GAPDH assay
0.5
0
D
30
0.45
FAM
VIC
ABY
JUN
RNaseP assay
0.5
25
0.3
0.25
15℃
0.2
10
0.15
0.1
5
VIC
ABY
最適化済みマルチプレックスマスターミックス
マルチプレックスPCRでは、厳しい競合環境で各ターゲットを安
定的に増幅できるマスターミックスが必要となります。そこでライ
フテクノロジーズは、PCR反応で各ターゲットに対し最高のマルチ
プレックス性能を発揮できる新しい組成のマスターミックスを開
A
20
0.3
15 ℃
0.25
0.2
10
0.15
5
0.05
0
0
FAM
0.35
0.1
0.05
0
25
0.4
20
Standard Deviation
0.35
0
30
0.45
0.4
Standard Deviation
図 3. ライフテクノロジーズの新しい色素群と
他社製の色素群との比較
（ A ）B2M 、（ B ）HPRT 、（ C ）GA PDH 、
（ D）RNaseP の各遺伝子発現アッセイ用
に FAM ™ 、VIC ® 、ABY® 、JUN ® の QSY®プロ
ーブ（赤）を合成し、他社製の色素の組み合
わせ（青）と比較しました。PCR 反応液は
TaqMan® Multiplex Master Mixで調製し、
プライマー 900 nM 、プローブ 250 nM 、
cDNA10 ng を使用しました。
QuantStudio® 7リアルタイムPCRシステム
を使用して増幅しました。棒グラフは標準
偏差を、三角形とひし形は C t 値の平均を示
しています。
JUN
FAM
VIC
ABY
JUN
0
発しました。このマスターミックスと他社製のマスターミックスと
を4-plex 反応で比較した結果、ライフテクノロジーズ製品は増幅
したターゲットのうち 3つが他社製品より早くCt値に達するととも
に、大半の希釈ポイントで標準偏差がより小さく、優れた性能を発
揮しました（図 4）。
B
35.00
35.00
0.50
0.50
33.00
33.00
0.50
0.50
30.00
30.00
0.40
0.40
0.35
0.35
av. Ct
av. Ct
Ct std. dev
Ct std. dev
0.25
0.25
20.00
20.00
0.20
0.20
Ct std. dev
Ct std. dev
25.00
25.00
0.30
0.30
15.00
15.00
0.10
0.10
27.00
27.00
25.00
25.00
0.30
0.30
23.00
23.00
21.00
21.00
19.00
19.00
0.10
0.10
0.05
0.05
17.00
17.00
100000
100000
10000
10000
1000
1000
100
100
pg
pgtemplate
templateper
perreaction
reaction
1010
10.00
10.00
0.00
0.00
100000
100000
D
35.00
35.00
0.50
0.50
10000
10000
1000
1000
100
100
pg
pgtemplate
templateper
perreaction
reaction
1010
15.00
15.00
35.00
35.00
0.50
0.50
0.45
0.45
0.45
0.45
30.00
30.00
0.40
0.40
0.40
0.40
30.00
30.00
0.35
0.35
av. Ct
av. Ct
Ct std. dev
Ct std. dev
25.00
25.00
0.25
0.25
0.20
0.20
20.00
20.00
0.30
0.30
25.00
25.00
0.25
0.25
0.20
0.20
20.00
20.00
0.15
0.15
0.15
0.15
0.10
0.10
15.00
15.00
0.10
0.10
15.00
15.00
0.05
0.05
0.05
0.05
100000
100000 10000
10000
1000
1000
100
100
pg
pgtemplate
templateper
perreaction
reaction
1010
10.00
10.00
0.00
0.00
100000
100000
10000
10000
1000
1000
100
100
pg
pgtemplate
templateper
perreaction
reaction
1010
10.00
10.00
av. Ct
av. Ct
0.30
0.30
Ct std. dev
Ct std. dev
0.35
0.35
0.00
0.00
29.00
29.00
0.20
0.20
0.15
0.15
C
31.00
31.00
0.40
0.40
av. Ct
av. Ct
0.45
0.45
0.00
0.00
35.00
35.00
0.60
0.60
図 4. TaqMan® Multiplex Master Mix と他社製マスターミックスの比較
（ A ）B2Mアッセイ、FAM™、
（B）RNasePアッ
セイ、VIC®、
（C）GAPDHアッセイ、ABY®、
（D）
HPRT アッセイ、JUN ®。いずれのアッセイも
クエンチャーには QSY®を使用しました。グラ
フは標準偏差（棒グラフ）、および C t 値の平均
（十字と三角形）を示しています。cDNA を10
μLあたり100 ng∼10 pg含む希釈系列を調製
し、4-plexで増幅しました。すべての増幅は、
各マスターミックスが推奨するサイクル条件に
従い、ViiA™ 7リアルタイムPCRシステムで実行
しました。赤はTaqMan® Multiplex Master
Mix、青は他社製マスターミックスの 4-plexを
示しています。
アッセイ開発を最短化
マルチプレックスPCRアッセイを開発する
には、正確にアッセイを設計し、増幅反応
を最適化するための長い時間が必要です。
しかしライフテクノロジーズのソリューシ
ョンでは、すべての試薬が同時に使用され
ることを想定して開発されているため、成
功率が高まるとともに開発時間を短縮で
きます。また、新たにお客様の開発および
最適化プロセスをサポートするユーザーガ
イド：TaqMan Multiplex Optimization
Guideを作成しました。さらにライフテクノ
ロジーズのカスタムアッセイデザインサービ
スを利用すれば、専門チームにアッセイの
設計を委託し、手間を最小限に抑えること
ができます。
®
参考資料
1. ユーザーガイド：TaqMan® Multiplex
Optimization Guide
2. アプリケーションノート：TaqMan® マルチプレ
ックスqPCR
両参考資料とも、以下の URL よりダウンロード
いただけます。
www.lifetechnologies.com/multiplexqpcr
Ordering Information
製品名
製品番号
TaqMan® QSY® プローブ
TaqMan® QSY® Probe, 6,000 pmol
4482777
TaqMan® QSY® Probe, 20,000 pmol
4482778
TaqMan QSY Probe, 50,000 pmol
4482779
®
®
QSY®プローブのご注文はこちらから： www.lifetechnologies.com/taqman-order
コントロールキット
TaqMan® GAPDH Assay, JUN®-QSY® 20X
4485712
TaqMan GAPDH Assay, JUN -QSY PL 20X
4485713
TaqMan® RNaseP Assay, ABY®-QSY® 20X
4485714
®
TaqMan RNaseP Assay, ABY -QSY PL 20X
4485715
TaqMan® Multiplex Master Mix, 1 mL
4461881
TaqMan® Multiplex Master Mix, 5 mL
4461882
TaqMan Multiplex Master Mix, 2 x 5 mL
4461884
TaqMan® Multiplex Master Mix, 5 x 5 mL
4484262
TaqMan Multiplex Master Mix, 10 x 5 mL
4484263
TaqMan® Multiplex Master Mix, 50 mL
4486295
®
®
®
®
®
マルチプレックスマスターミックス
®
®
キャリブレーションプレート
MUSTANG PURPLE® Dye Spectral Calibration Plate, 96-well
4461599
JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 96-well
A24737
ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 96-well
A24738
MUSTANG PURPLE Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well
4457328
®
MUSTANG PURPLE® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well
4457334
JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well
A24733
ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well
A24734
JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well
A24735
ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well
A24736
ユーザーマニュアルや参考文献など、製品の詳しい資料については、
www.lifetechnologies.com/multiplexqpcr をご参照ください。
facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
© 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo
Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. TaqMan is a registered trademark of
Roche Molecular Systems, Inc., used under permission and license. SDR085-A1408OB
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8
TEL.03 (6832) 9300 FAX. 03 (6832) 9580
www.lifetechnologies.com
大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28
TEL.06 (6389) 1201 FAX. 06 (6389) 1206
取扱店

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