(57)【要約】 【課題】 野生型のプロテインＣインヒビターよりも作 用の増強された改変型プロテインＣインヒビターを提供 することを目的とする。 【解決手段】 野生型ヒトプロテインＣインヒビターよ りも強いセリンプロテアーゼ阻害活性を有する改変型ヒ トプロテインＣインヒビターであって、野生型ヒトプロ テインＣインヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位である第 ２３０位及び第３１９位の少なくとも一方に対応する部 位のアミノ酸残基にＡｓｎ型糖鎖が結合していないこと を特徴とする改変型ヒトプロテインＣインヒビター。 −1− (2) 特開２００２−１０７８３ 1 2 【特許請求の範囲】 のアスパラギン残基をセリンに、又は第３１９位のアス 【請求項１】野生型ヒトプロテインＣインヒビターより パラギン残基をグルタミンに置換してなるものである改 も強いセリンプロテアーゼ阻害活性を有する改変型ヒト 変型ヒトプロテインＣインヒビター。 プロテインＣインヒビターであって、野生型ヒトプロテ 【請求項７】野生型ヒトプロテインＣインヒビターに比 インＣインヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位である第２ し、トロンビン及び血漿カリクレインに対して強い阻害 ３０位及び第３１９位の少なくとも一方に対応する部位 作用を有することを更に特徴とする、請求項１ないし６ のアミノ酸残基にＡｓｎ型糖鎖が結合していないことを の何れかの改変型ヒトプロテインＣインヒビター。 特徴とする改変型ヒトプロテインＣインヒビター。 【請求項８】請求項１ないし７の何れかの改変型ヒトプ 【請求項２】改変型ヒトプロテインＣインヒビターであ ロテインＣインヒビターを有効成分として含有すること って、野生型ヒトプロテインＣインヒビターのＡｓｎ型 10 を特徴とする、血液凝固異常亢進抑制剤。 糖鎖結合部位である第２３０位及び第３１９位の少なく 【請求項９】請求項１ないし７の何れかの改変型ヒトプ とも一方に対応する部位にＡｓｎ型糖鎖が結合しないよ ロテインＣインヒビターを有効成分として含有すること うに該野生型ヒトプロテインＣインヒビターの少なくと を特徴とする、炎症反応抑制剤。 も一方のＡｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基を置換し 【請求項１０】該血液凝固異常亢進が播種性血管内凝固 てなるアミノ酸配列を有し、該野生型ヒトプロテインＣ におけるものである、請求項８の血液凝固異常亢進抑制 インヒビターよりも強いセリンプロテアーゼ阻害活性を 剤。 有することを特徴とする改変型ヒトプロテインＣインヒ 【請求項１１】該炎症反応が播種性血管内凝固に伴った ビター。 ものである、請求項９の炎症反応抑制剤。 【請求項３】該Ａｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基の 置換が、第２３０位及び第３１９位のアスパラギン残基 【請求項１２】配列表の配列番号２で示されたアミノ酸 20 配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡにおいて： の属するＡｓｎ型糖鎖結合領域であるアミノ酸配列−Ａ １） 該アミノ酸配列の第２３０位及び第３１９位のう ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−（ＸはそれぞれＬｅｕ又はＨｉｓを ち少なくとも一方のアスパラギン残基をコードする３塩 表す）における、 基を、他のアミノ酸残基をコードする３塩基となるよう １） 他のアミノ酸残基によるアスパラギン残基の置 に置換するか、 換、 ２） 第２３１位及び第３２０位のうち少なくとも一方 ２） プロリン残基によるＸの置換、及び のアミノ酸残基をコードする３塩基をプロリンをコード ３） トレオニン以外の他のアミノ酸残基によるセリン する３塩基となるように置換するか、又は 残基の置換 ３） 第２３２位及び第３２１位のうち少なくとも一方 のうち、少なくとも何れかによるものである、請求項２ のセリン残基をコードする３塩基をトレオニン以外の他 の改変型ヒトプロテインＣインヒビター。 30 のアミノ酸残基をコードする３塩基となるように置換す 【請求項４】野生型ヒトプロテインＣインヒビターを構 るか、 成するアミノ酸配列中における第２３０位及び第３１９ の少なくとも何れかの置換をすることにより得ることの 位のＡｓｎ型糖鎖結合部位のアスパラギン残基の少なく できる、改変型ヒトプロテインＣインヒビターをコード とも一方を他のアミノ酸残基に置換してなるアミノ酸配 するＤＮＡ。 列を有し、且つ、該野生型ヒトプロテインＣインヒビタ 【請求項１３】第２３０位のアスパラギン残基をコード ーよりも強いセリンプロテアーゼ阻害作用を有すること する３塩基について他のアミノ酸残基をコードする３塩 を特徴とする、改変型ヒトプロテインＣインヒビター。 基となるように行う置換において、該他のアミノ酸がセ 【請求項５】第２３０位のアスパラギン残基を置換する リン、グリシン、アスパラギン酸、ロイシン及びプロリ 他のアミノ酸残基がセリン、グリシン、アスパラギン 酸、ロイシン及びプロリンよりなる群より選ばれるもの ンよりなる群より選ばれるアミノ酸であり、第３１９位 40 のアスパラギン残基をコードする３塩基について他のア であり、第３１９位のアスパラギン残基を置換する他の ミノ酸残基をコードする３塩基となるように行う置換に アミノ酸残基がグルタミン、アラニン、アルギニン、ア おいて、該他のアミノ酸がグルタミン、アラニン、アル スパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、 ギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、 ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオ グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジ ニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニ ン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ ン、トリプトファン、チロシン及びバリンよりなる群よ ン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン り選ばれるものである、請求項３又は４の改変型ヒトプ よりなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項１２の ロテインＣインヒビター。 ＤＮＡ。 【請求項６】野生型ヒトプロテインＣインヒビターを構 【請求項１４】該配列表の配列番号２で示されたアミノ 成するアミノ酸配列中において、少なくとも第２３０位 50 −2− 酸配列をコードする塩基配列が、配列表の配列番号１で (3) 特開２００２−１０７８３ 3 4 示された塩基配列中、第５８∼１２１８位の塩基よりな れにつき先に特許出願を行っている（特開平11-60500 る配列である、請求項１２又は１３のＤＮＡ。 号）。プロテインＣインヒビターは、セリンプロテアー 【請求項１５】配列表の配列番号７又は９で示された塩 ゼインヒビターファミリーに分類されており、尿、血液 基配列中、第５８∼１２１８位の塩基よりなる配列を有 及び精液において検出されている。 するものである、ＤＮＡ。 【０００５】プロテインＣインヒビターを得るために 【発明の詳細な説明】 は、多量の新鮮な生体成分が必要である。例えば、この 【０００１】 インヒビター１ｍｇを得るためには、新鮮尿60Ｌを必要 【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト生体成分由来 とする。 のプロテインＣインヒビターより強いセリンプロテアー 【０００６】しかしながら、臨床現場に安定供給できる ゼ阻害活性を有する、改変型プロテインＣインヒビター 10 程の量のプロテインＣインヒビターを得るためにそれに 及びこれを含む薬剤に関する。 見合う多量の生体成分を確保するには、困難が予想され 【０００２】 る。しかも、このプロテインＣインヒビターを生体成分 【従来の技術】播種性血管内凝固（Disseminated Intra から得るには原材料の鮮度が高いことも要求される。例 vascular Coagulation: ＤＩＣ）は、血液凝固系の異常 えば、原材料として尿を用いたとき、その尿の鮮度が低 亢進により引き起こされる疾患の代表である。感染症や いと、当初は含有されていた筈のプロテインＣインヒビ 悪性腫瘍等による細胞の破壊により露出した組織因子が ターの大部分はカリクレインにより低分子化されてしま 血液と接触する結果、ＤＩＣを特徴づける血液凝固系の っているため、プロテインＣ阻害活性が実質的に消失し 異常亢進が引き起こされる。ＤＩＣにおいては、血液中 ていることとなる。このため、医療現場の要求に見合う のトロンビン濃度が顕著に上昇し、全身の細小血管内で 血栓が形成される（凝固優位型ＤＩＣ）、これは組織壊 量でプロテインＣインヒビターを安定供給できる方法 20 は、現在のところ知られていない。 死や各種臓器の機能不全をもたらす。また、形成された 【０００７】 血栓を溶解するため、二次的な線溶系の亢進が見られ、 【発明が解決しようとする課題】プロテインＣインヒビ その結果、患者の体内では、血液凝固−血栓溶解が高頻 ターの十分量を安定供給するには、遺伝子組換え技術等 度で繰り返され、それに伴いフィブリノーゲン及びフィ 有効な手段を駆使してこれを多量に作製する方法の確立 ブリン分解物の血中濃度が上昇する。更に重度になる の確立が選択肢の一つである。しかし更に、このプロテ と、フィブリノーゲン等血液凝固系の諸因子の消費量が インＣインヒビターの抗凝固作用を増強させることがで 生成量を上回り、そのため顕著な出血傾向をもたらし きれば、相対的に少量のプロテインＣインヒビターで治 （線溶優位型ＤＩＣ）、死に至る場合がある。 療効果が得られることとなり、利用効率が高まるため、 【０００３】ＤＩＣにおいては、血中のトロンビン濃度 十分量のプロテインＣインヒビターの安定供給は一層容 が顕著に上昇して血液凝固系が異常亢進しているため、 30 易となろう。同時に、増強された抗凝固作用を有するプ 治療薬としては、従来ヘパリン（分子量4,000∼40,000 ロテインＣインヒビターは、先に知られているプロテイ の混合物）、低分子量ヘパリン（ヘパリンから分子量4, ンＣインヒビターよりも優れた治療効果を発揮する可能 000∼5,000のものを分画）、及びアンチトロンビンIII 性をも有することになる。 が用いられてきた。しかしながら、ヘパリンは、トロン 【０００８】本発明者等はこの点に着目した。すなわ ビンがアンチトロンビンIIIに反応するのを仲介するこ ち、本発明は、野生型のプロテインＣインヒビターより とによって作用を表すが、トロンビンと複合体を形成し も作用の増強された改変型プロテインＣインヒビターを たアンチトロンビンIIIは速やかに代謝され消失する。 提供することを目的とする。 このため、ヘパリンを投与しているＤＩＣ患者ではアン 【０００９】 チトロンビンIIIが不足傾向となり、アンチトロンビンI IIの補充が必要となる場合がある。しかしながら、アン 【課題を解決するための手段】タンパク質に結合するＡ 40 ｓｎ型糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖又はＮ結合型糖 チトロンビンIII製剤は高価なためその使用が保険上の 鎖とも呼ばれ、ポリペプチド鎖中のＡｓｎ型糖鎖結合領 制限を受けており、患者への十分な投与は望みにくいと 域〔−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−若しくは−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ いう問題がある。またヘパリンは血液凝固時間を延長さ ｅｒ−：ここに、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｔｈｒ＝トレ せるため、患者に出血傾向を起こす一因となる。低分子 オニン、Ｓｅｒ＝セリン、Ｘ＝Ｐｒｏ（プロリン）以外 量ヘパリンも、副作用の面では通常のヘパリンと同様で のアミノ酸残基〕のアスパラギン残基の酸アミド基に糖 ある。 鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコ 【０００４】このような背景において本発明者等は先 シド結合した糖鎖群である。これは、タンパク質の機能 に、播種性血管内凝固において見られる血液凝固系の異 を修飾する役割を果たしているが、本発明者等は、ヒト 常亢進とそれに伴う二次線溶の亢進を、生体成分由来の プロテインＣインヒビターにおいては、活性を抑制する プロテインＣインヒビターが改善することを見出し、こ 50 −3− 方向にＡｓｎ型糖鎖が作用しており、Ａｓｎ型糖鎖結合 (4) 特開２００２−１０７８３ 5 6 部位のうち１ヶ所又は複数ヶ所のＡｓｎ型糖鎖結合部位 生型ヒトプロテインＣインヒビターよりも強いセリンプ において糖鎖の結合をなくすことによってプロテインＣ ロテアーゼ阻害活性を有することを特徴とする改変型ヒ インヒビターの活性を高められるということを見出し トプロテインＣインヒビターをも提供する。 た。この発見は、本発明者等が、プロテインＣインヒビ 【００１４】野生型ヒトプロテインＣインヒビターのア ターに３ヶ所存在するＡｓｎ型糖鎖結合領域のうち２ヶ ミノ酸配列は、配列表において配列番号２に示されてい 所の、少なくとも一方の領域においてＡｓｎ型糖鎖の結 る。配列表において配列番号１で示された塩基配列は、 合（すなわち、Ａｓｎ型糖鎖による修飾）が起こらなく 併記されたアミノ酸配列においてアミノ酸番号１ないし なるようにアミノ酸残基を変更することを試みた結果、 ３８７よりなる野生型ヒトプロテインＣインヒビターの 得られたＡｓｎ型糖鎖の欠落を有する改変型ヒトプロテ アミノ酸配列及びこれに先行するアミノ酸番号−１９な インＣインヒビターが、ヒトのセリンプロテアーゼに対 10 いし−１よりなるシグナル配列をコードする塩基配列で してヒト生体成分由来のプロテインＣインヒビターより ある。 も強い阻害作用を持つことが見出されたことに基づく。 【００１５】上記のＡｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸配 【００１０】すなわち本発明は、野生型ヒトプロテイン 列は、第２３０位のアスパラギン残基の属するものにつ Ｃインヒビターよりも強いセリンプロテアーゼ阻害活性 いては−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−であり第３１９位の を有する改変型ヒトプロテインＣインヒビターであっ アスパラギン残基の属するものについては−Ａｓｎ−Ｈ て、野生型ヒトプロテインＣインヒビターのＡｓｎ型糖 ｉｓ−Ｓｅｒ−である。これらのＡｓｎ型糖鎖結合領域 鎖結合部位である第２３０位及び第３１９位の少なくと に糖鎖が結合しないようにするには、１） アスパラギ も一方に対応する部位のアミノ酸残基にＡｓｎ型糖鎖が ン残基を他のアミノ酸残基で置換する、２） それらの 結合していないことを特徴とする改変型ヒトプロテイン Ｃインヒビターを提供する。 配列中央のＬｅｕ又はＨｉｓをＰｒｏで置換する、又は 20 ３） それらの配列末尾のＳｅｒをトレオニン以外の他 【００１１】本発明の改変型プロテインＣインヒビター のアミノ酸残基で置換する、の何れの手段をも用いるこ が野生型プロテインＣインヒビターのそれよりも高い活 とができる。 性を有するのは、野生型ヒトプロテインＣインヒビター 【００１６】従って本発明は更に、該Ａｓｎ型糖鎖結合 のアミノ酸配列中のＡｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残 領域のアミノ酸残基の置換が、第２３０位及び第３１９ 基を置換すること等により、分子内に３ヶ所存在するＡ 位のアスパラギン残基の属するＡｓｎ型糖鎖結合領域で ｓｎ型糖鎖結合領域、特に第２３０位及び第３１９位の あるアミノ酸配列−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−（Ｘはそれぞ アスパラギン残基の属するＡｓｎ型糖鎖結合領域の少な れＬｅｕ又はＨｉｓを表す）における、 くとも１つにおいてＡｓｎ型糖鎖が欠落している結果で １） 他のアミノ酸残基によるアスパラギン残基の置 ある。 換、 【００１２】野生型ヒトプロテインＣインヒビターのア 30 ２） プロリン残基によるＸの置換、及び ミノ酸配列において、Ａｓｎ型糖鎖結合部位は、第２３ ３） トレオニン以外の他のアミノ酸残基によるセリン ０位、第２４３位、第３１９位のアスパラギン残基の部 残基の置換 位に存在する。本発明における「改変型ヒトプロテイン のうち、少なくとも何れかによるものである、上記改変 Ｃインヒビター」は、野生型ヒトプロテインＣインヒビ 型ヒトプロテインＣインヒビターをも提供する。 ターのアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ型糖鎖結合領域 【００１７】更に本発明は上記のうち特に、野生型ヒト 内のアスパラギン残基（Ａｓｎ型糖鎖結合部位）、特に プロテインＣインヒビターを構成するアミノ酸配列中に 第２３０位及び第３１９位のアスパラギン残基のうち少 おける第２３０位及び第３１９位のＡｓｎ型糖鎖結合部 なくとも一方にＡｓｎ型糖鎖が結合していないものであ 位のアスパラギン残基の少なくとも一方を他のアミノ酸 れば、アミノ酸配列自体は野生型のそれと同一のもので あってもよい。これらのＡｓｎ型糖鎖が結合しないよう 残基に置換してなるアミノ酸配列を有し、且つ、該野生 40 型ヒトプロテインＣインヒビターよりも強いセリンプロ にするにはまた、これらのアスパラギン残基の属するＡ テアーゼ阻害作用を有することを特徴とする、改変型ヒ ｓｎ型糖鎖結合領域内の何れかのアミノ酸残基を置換す トプロテインＣインヒビターをも提供する。 ることによってもよい。 【００１８】上記の改変型ヒトプロテインＣインヒビタ 【００１３】従って本発明はまた、改変型ヒトプロテイ ーを、野生型ヒトプロテインＣインヒビターを構成する ンＣインヒビターであって、野生型ヒトプロテインＣイ アミノ酸配列中における第２３０位及び第３１９位のＡ ンヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位である第２３０位及 ｓｎ型糖鎖結合部位のアスパラギン残基の少なくとも一 び第３１９位の少なくとも一方に対応する部位にＡｓｎ 方を他のアミノ酸残基に置換することにより作製する場 型糖鎖が結合しないように該野生型ヒトプロテインＣイ 合、それらのアスパラギン残基と置換するために選ばれ ンヒビターの少なくとも一方のＡｓｎ型糖鎖結合領域の るアミノ酸は、該置換によってＡｓｎ型糖鎖が結合でき アミノ酸残基を置換してなるアミノ酸配列を有し、該野 50 −4− なくすればよいから、アスパラギン以外に種々のアミノ (5) 特開２００２−１０７８３ 7 8 酸を選択し得る。それらのうち、第２３０位のアスパラ は、トロンビン及び血漿カリクレインが主要な血液凝固 ギン残基は例えばセリン、グリシン、アスパラギン酸、 因子及び炎症性細胞刺激因子であること〔Journal of C ロイシン又はプロリンで置換してよく、第３１９位のア linical Investigation, 69:1199-1202(1982)、Pathoph スパラギン残基は例えばグルタミン、アラニン、アルギ ysiology of Shock, Sepsis, and Organ Failure, Schl ニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グ agG, Redl H, eds, Spring-Verlag 1993, pp46-60 リシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジ 等〕、尿由来のプロテインＣインヒビターがトロンビン ン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ 及び血漿カリクレインの阻害を経てＤＩＣにおける病態 ン、トレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリン を改善すること〔Thrombosis and Haemostasis, 84:54- で置換してよい。そのような置換により得られる改変型 58(2000)に本発明者等が投稿した〕によって支持され ヒトプロテインＣインヒビターも、野生型ヒトプロテイ 10 る。 ンＣインヒビターに比して顕著に高い阻害作用を有する 【００２３】従って本発明はまた、上記の何れかの改変 ことが、後述の研究結果に基づき合理的に推定される。 型ヒトプロテインＣインヒビターを有効成分として含有 【００１９】従って本発明は更に、上記の各改変型ヒト することを特徴とする、血液凝固異常亢進抑制剤及び炎 プロテインＣインヒビターのうち、第２３０位のアスパ 症反応抑制剤をも提供する。 ラギン残基を置換する他のアミノ酸残基がセリン、グリ 【００２４】ここにおいて、該血液凝固異常亢進は、特 シン、アスパラギン酸、ロイシン及びプロリンよりなる に好ましくは、播種性血管内凝固におけるものである。 群より選ばれるものであり、第３１９位のアスパラギン また、該炎症反応も、特に好ましくは、播種性血管内凝 残基を置換する他のアミノ酸残基がグルタミン、アラニ 固におけるものである。 ン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタ ミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシ 【００２５】更に本発明は、配列番号２で示されたアミ 20 ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡにおい ン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ て： ン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及 １） 該アミノ酸配列の第２３０位及び第３１９位のう びバリンよりなる群より選ばれるものである改変型ヒト ち少なくとも一方のアスパラギン残基をコードする３塩 プロテインＣインヒビターをも提供する。 基を、アスパラギン以外のアミノ酸残基をコードする３ 【００２０】本発明より、野生型ヒトプロテインＣイン 塩基となるように置換するか、 ヒビターに比してセリンプロテアーゼ阻害作用の増強さ ２） 第２３１位及び第３２０位のうち少なくとも一方 れた改変型ヒトプロテインＣインヒビターが提供され のアミノ酸残基をコードする３塩基をプロリンをコード る。改変型ヒトプロテインＣインヒビターは、従来の野 する３塩基となるように置換するか、又は 生型ヒトプロテインＣインヒビターに比して少量で同等 ３） 第２３２位及び第３２１位のうち少なくとも一方 の効果を得ることを可能にする。従って、遺伝子工学的 30 のセリン残基をコードする３塩基をトレオニン以外の他 に製造できることと相まって、ヒトプロテインＣインヒ のアミノ酸残基をコードする３塩基となるように置換す ビターを臨床現場に必要な供給量を確保することが容易 るか、の少なくとも何れかの置換をすることにより得る となる。 ことのできる、改変型ヒトプロテインＣインヒビターを 【００２１】本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒビ コードするＤＮＡをも提供する。 ターの活性は、野生型ヒトプロテインＣインヒビターに 【００２６】更に本発明は、上記何れかのＤＮＡであっ 比して、トロンビン及び血漿カリクレインに対する阻害 て、第２３０位のアスパラギン残基をコードする３塩基 作用が野生型プロテインＣインヒビターより強いという について他のアミノ酸残基をコードする３塩基となるよ ことによって更に特徴づけられる。 うに行う置換において、該他のアミノ酸がセリン、グリ 【００２２】更には、本発明の改変型ヒトプロテインＣ インヒビターのセリンプロテアーゼ阻害活性が野生型よ シン、アスパラギン酸、ロイシン及びプロリンよりなる 40 群より選ばれるアミノ酸であり、第３１９位のアスパラ り強いことは、これまでよりも強い治療効果を期待して ギン残基をコードする３塩基について他のアミノ酸残基 プロテインＣインヒビターを使用できることをも意味す をコードする３塩基となるように行う置換において、該 る。トロンビン及び血漿カリクレインに対して阻害作用 他のアミノ酸がグルタミン、アラニン、アルギニン、ア が増強されていることは、血液凝固系の持続的亢進及び スパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、 これに伴って起こるものを含む炎症性反応に対する改善 ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオ 効果が高いことを意味する。このことは、本発明の改変 ニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニ 型ヒトプロテインＣインヒビターが、ＤＩＣにおける血 ン、トリプトファン、チロシン及びバリンよりなる群よ 液凝固系の異常亢進及びそれに伴って起こる炎症反応を り選ばれるアミノ酸であることを特徴とするＤＮＡをも 改善する能力において、野生型ヒトプロテインＣインヒ 提供する。 ビターより優れていることを示すものである。このこと 50 −5− 【００２７】更に本発明は、上記ＤＮＡであって、該配 (6) 特開２００２−１０７８３ 9 10 列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列をコードする ことは意図しない。 塩基配列が、配列表の配列番号１で示された塩基配列 【００３３】＜実施例１＞ 中、第５８∼１２１８位の塩基よりなる配列であること １． 野生型及び改変型プロテインＣインヒビターの発 を特徴とするＤＮＡをも提供する。 現 【００２８】更に本発明は、上記ＤＮＡの好ましい例に ａ） 野生型及び改変型プロテインＣインヒビター発現 含まれる、配列表の配列番号７又は９で示された塩基配 用ベクターの構築 列中、第５８∼１２１８位の塩基よりなる配列を有する ヒト肝臓由来のポリ（Ａ）ＲＮＡ（Clontech社製）１μ ものであるＤＮＡをも提供する。 gよりｃＤＮＡ合成モジュール（cDNA Synthesis Modul 【００２９】 e：Amersham社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、これを 【発明の実施の形態】本発明において、Ａｓｎ型糖鎖の 10 鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりプロ 結合の制限された改変型ヒトプロテインＣインヒビター テインＣインヒビター遺伝子を増幅した。このとき用い は、Ａｓｎ型糖鎖結合領域におけるアミノ酸残基の置換 たフォーワードプライマー（プライマー１）の塩基配列 によって得たものであってもよいが、それに限らず、化 を配列表の配列番号３で、リバースプライマー（プライ 学的手段を含む適宜の手段による野生型ヒトプロテイン マー２）を配列表の配列番号４で示す。フォーワードプ ＣインヒビターからのＡｓｎ型糖鎖の除去や、野生型ヒ ライマー（プライマー１）は、配列表の配列番号１の野 トプロテインＣインヒビタータンパク質へのＡｓｎ型糖 生型ヒトプロテインＣインヒビターの塩基配列の塩基番 鎖の結合の阻止によって得たものであってもよい。Ａｓ 号1∼36に相当する塩基配列及びその5側に連結した配列 ｎ型糖鎖の除去又は結合阻止の手段は問わない。 cgcggatcc（このうち、ggatccはBamHI部位である）より 【００３０】各種改変タンパク質の二次構造について本 発明者等が行ったコンピュータ解析より、上記２個のＡ なる。リバースプライマー（プライマー２）は、配列表 20 の配列番号１の塩基番号1197∼1221に相補的な塩基配列 ｓｎ型糖鎖結合部位の各アスパラギン残基を置換する場 及びその5側に連結した配列cgcggatcc（同上）よりな 合については、置換するアミノ酸として少なくとも下記 る。 のアミノ酸が、本発明の目的にとって好ましいことが判 【００３４】ＰＣＲ産物を、制限酵素BamHIを用いて常 明している。 法により消化した後、アガロースゲル電気泳動を行っ １） 第２３０位のＡｓｎ（「Ａｓｎ230」と略す）： た。目的のＤＮＡバンドを精製した後、クローニングベ セリン（Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン クターpBluescript SK(-)のBamHI部位に組み込んだ。得 酸（Ａｓｐ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、プロリン（Ｐｒ られた野生型プロテインＣインヒビター（以下、「ｗＰ ｏ） ＣＩ」と略す。）の遺伝子は、塩基配列を確認後、BamH ２） 第３１９位のＡｓｎ（「Ａｓｎ319」と略す）： I消化により切り出してバキュロウイルス構築用ドナー グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニ 30 ン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン ベクターpFastBac-1（GIBCO BRL社製）のBamHI部位に組 み換えた。方向が合っているクローンを選び出し、これ （Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌ をｗＰＣＩ発現用のBacmid作製に用いた。 ｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌ 【００３５】また、プロテインＣインヒビターのアミノ ｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオ 酸配列（配列表の配列番号２）のＮ末端側から230位の ニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリ アスパラギン（Ａｓｎ230）をセリンに、又は319位のア ン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈ スパラギン（Ａｓｎ319）をグルタミンに置換した２種 ｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙ 類の改変型プロテインＣインヒビター（以下、それぞれ ｒ）、バリン（Ｖａｌ） 「Ａｓｎ230Ｓｅｒ」、及び「Ａｓｎ319Ｇｌｎ」と略 【００３１】本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒビ ターは、先に知られている野生型ヒトプロテインＣイン す。）の遺伝子は、それぞれ以下のようにして構築し 40 た。すなわち、先ずそれぞれのアミノ酸置換部位を含む ヒビターと同様、生理的に許容し得る塩類溶液等に加え 領域に、Ａｓｎ230Ｓｅｒの作製用には配列表の配列番 て点滴静注等により循環血中に直接投与する形で、播種 号５で示した塩基配列を有するプライマー（プライマー 性血管内凝固に対して使用することとができる。使用に ３）を、そしてＡｓｎ319Ｇｌｎの作製用には配列表の 当たっては、患者の循環血のフィブリノーゲン濃度、フ 配列番号６で示した塩基配列を有するプライマー（プラ ィブリン分解物濃度、プロトロンビン時間等、血液凝固 イマー４）を設計した。 系の諸パラメータを定期的にモニターし、その結果に応 【００３６】プライマー３（配列番号５）は、配列表の じて投与量を加減すればよい。 配列番号１（野生型ヒトプロテインＣインヒビター塩基 【００３２】 配列）に示した塩基番号733∼765の塩基に相当するが、 【実施例】以下、代表的な一実施例を挙げて本発明をよ 但し該プライマーの塩基番号13∼15の塩基配列（配列番 り具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される 50 −6− 号１の塩基番号745∼747に対応する）が、野生型のＡｓ (7) 特開２００２−１０７８３ 11 12 ｎの代わりに、Ｓｅｒをコードするように設計されてい ドナープラスミド１μｌにBacmid構築用大腸菌DH10Bac る。プライマー４（配列番号６）は、配列表の配列番号 のコンピテント細胞（GIBCO BRL社製）20μｌを加えて １（野生型ヒトプロテインＣインヒビター塩基配列）に 混和し、氷上にて30分間静置した。次に、42℃で45秒間 示した配列番号1003∼1034の塩基に相当するが、但し該 のヒートショックを与えた後、直ちに氷中に移して２分 プライマーの塩基番号10∼12の塩基配列（配列番号１の 間冷却した。予め37℃に温めておいたＬＢ培地0.5ｍｌ 塩基番号1012∼1014に対応する）が野生型のＡｓｎの代 を加えて混和し、37℃にて５時間震盪培養した。目的遺 わりに、Ｇｌｎをコードするように設計されている。 伝子のBacmidへのトランスポジションを選別するために 【００３７】プライマー３及び４をフォーワードプライ 培養液をＬＢ培地にて2,000倍希釈し、その0.2ｍｌを選 マーとし、プライマー２をリバースプライマーとして用 別用ＬＢプレート（カナマイシン50μｇ／ｍｌ、ゲンタ い、プロテインＣインヒビター遺伝子を鋳型としてＰＣ 10 マイシン７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン10μｇ／ｍ Ｒを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供 ｌ、ＩＰＴＧ／Ｘ-galコート）に播いた。37℃にて２日 し、増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片を精製した。更 間培養後、大きくて白いコロニーを選択しそれを２ｍｌ に、プライマー１をフォーワードプライマーとし、精製 ＬＢ培地（カナマイシン50μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン した各ＤＮＡ断片をリバースプライマーとして用いて前 ７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン10μｇ／ｍｌ）にて一 記のプロテインＣインヒビター遺伝子を鋳型としてＰＣ 晩培養した。培養液１ｍｌから大腸菌を回収し、アルカ Ｒを行った。ＰＣＲ産物を制限酵素BamHIにて消化後、 リ溶解法にて野生型及び改変型プロテインＣインヒビタ アガロースゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡバンド ー発現用Bacmidを回収した。 を精製し、pBluescript SK(-)のBamHI部位に組み込ん 【００４０】ｃ） 組換えバキュロウイルスの作製 10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地（Graces Ins だ。得られた改変型プロテインＣインヒビター遺伝子 は、目的の塩基置換が行われている事を確認した後、Ba 20 ect Cell Culture MedIum 500ｍｌ、50倍希釈したYeast mHI消化により切り出し、バキュロウイルス構築用ドナ olate Solution 10ｍｌ、及び50倍希釈したLactoalbumI ーベクターpFastBac-1のBamHI部位に組み換えた。次 n Hydrolysate SolutIon 10ｍｌ；何れもGIBCO BRL社 に、方向が合っているクローンを選び出し、それらを各 製）で懸濁したＳｆ９細胞を細胞培養用の６ウェルプレ 改変型プロテインＣインヒビター発現用のBacmid作製に ートにウェル当たり4.5×105 個／２ｍｌ播いた後、27℃ 用いた。 にて１時間静置してプレートに固着させた。次に、培地 【００３８】上記で得られた及び及びアミノ酸配列を、 を除き、ＴＮＭ−ＦＨ培地２ｍｌにて細胞を濯いだ後、 配列表の配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。配 同培地を２ｍｌ加えて27℃にて10分間静置した。Cell F 列表の配列番号７に示した塩基配列は、配列番号１（野 ctin（GIBCO BRL社製）５μｌにＴＮＭ−ＦＨ培地100μ 生型ヒトプロテインＣインヒビター塩基配列）に示した ｌを加えたものとｗＰＣＩ発現用Bacmid５μｌにＴＮＭ 塩基配列に相当するが、但し塩基745∼746がＡｓｎの代 30 −ＦＨ培地100μｌを加えたものを混和し、室温で30分 わりにＳｅｒをコードするよう設計されている、Ａｓｎ 間静置した。その後、ＴＮＭ−ＦＨ培地を800μｌ加え 230Ｓｅｒをコードする塩基配列である。配列表の配列 て混和した。10分間静置していたＳｆ９細胞から培地を 番号８に示したアミノ酸配列は、配列番号２（野生型ヒ 除去し、これに先のBacmid-lipid混合液を加えて27℃で トプロテインＣインヒビターアミノ酸配列）に示したア 静置した。５時間後、10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ− ミノ酸配列に相当するが、但し２３０位のアミノ酸がＳ ＦＨ培地２ｍｌにて細胞を濯いだ後、同培地を２ｍｌ加 ｅｒに置き換えられるよう設計された、Ａｓｎ230Ｓｅ えて27℃にて培養した。３日後、培養上清を回収し、遠 ｒのアミノ酸配列である。配列表の配列番号９に示した 心分離（2,000ｒｐｍ、５分間）して細胞残渣を除いた 塩基配列は、配列番号１（野生型ヒトプロテインＣイン ものをｗＰＣＩ発現用種ウイルス液とした。同様に各改 変型プロテインＣインヒビター発現用Bacmidを用いて各 ヒビター塩基配列）に示した塩基配列に相当するが、但 し塩基1012∼1014がＡｓｎの代わりにＧｌｎをコードす 40 改変型プロテインＣインヒビター発現用の種ウイルス液 るよう設計されている、Ａｓｎ319Ｇｌｎをコードする を作製した。この様にして作製した種ウイルス液は、使 塩基配列である。配列表の配列番号１０に示したアミノ 用するまで４℃にて保存した。 酸配列は、配列番号２（野生型ヒトプロテインＣインヒ 【００４１】ｄ） 野生型及び改変型プロテインＣイン ビターアミノ酸配列）に示したアミノ酸配列に相当する ヒビターの発現チェック が、但し３１９位のアミノ酸がＧｌｎに置き換えられる Ex-CELL400（JRH Bioscience社製）培地に懸濁させたHi よう設計された、Ａｓｎ319Ｇｌｎのアミノ酸配列であ gh-Five細胞を25ｃｍ2 培養フラスコに２×106 個／５ｍ る。 ｌ播いた後、27℃にて１時間静置してフラスコに固着さ 【００３９】ｂ） 野生型及び改変型プロテインＣイン せた。次いで、培養上清を除去し、10％ウシ胎仔血清を ヒビター発現用のBacmidの作製 含むＴＮＭ−ＦＨ培地800μｌにｗＰＣＩ発現用種ウイ 野生型及び各改変型プロテインＣインヒビター発現用の 50 −7− ルス液200μｌを混和したものを加え、室温でシーソー (8) 特開２００２−１０７８３ 13 14 にてゆっくりと揺らしてウイルスを感染させた。１時間 ヒビターの精製 後、ウイルス液を除き、Ex-CELL400培地２ｍｌにて細胞 上記１．で得たｗＰＣＩを含む培養上清500ｍｌを分子 を濯いだ後、同培地を５ｍ加えて27℃にて３日間培養 量10,000カットの限外濾過膜（PM-10, Amicon社製）を 後、培養上清を回収して遠心分離（2,000ｒｐｍ、５分 用いて150ｍｌまで濃縮した後、50ｍＭ塩化ナトリウム 間）により細胞残渣を除いた。こうして得られた培養上 を含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）に対して透 清２ｍｌを、分子量10,000カットの遠心濃縮装置（ミリ 析し、液内の緩衝液を交換した。次いで、内液を同緩衝 ポア社製）を用いて200μｌまで濃縮した。各改変型プ 液で平衡化させたHiTrap Heparinカラム（カラム容積５ ロテインＣインヒビター発現用種ウイルス液を用いて同 ｍｌ、アマーシャム ファルマシア バイオテク社製） 様の操作を行い、培養上清を得た。これらを12.5％ゲル に供し、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液に溶解さ 濃度のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、 10 せた塩化ナトリウムの直線濃度勾配（50ｍＭから2.0 クシマー染色及び抗ヒトプロテインＣインヒビター抗体 Ｍ）により溶出させた。この溶出画分を４∼20％マルチ （Nordic Immunology社製）を用いたウエスタンブロッ ゲル（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳ−ポリアクリ ティングを行い、野生型及び改変型プロテインＣインヒ ルアミドゲル電気泳動に供し、抗ヒトプロテインＣイン ビターの発現を確認した。 ヒビター抗体を用いたウエスタンブロッティングで分析 【００４２】ｅ） バキュロウイルスの大量培養 し、ｗＰＣＩを含む画分を集めた。各改変型プロテイン 野生型及び改変型プロテインＣインヒビター大量発現用 Ｃインヒビターを含む培養上清についても同様に精製、 のウイルス液を得るために、以下の操作を行った。10％ 分析し、各改変型プロテインＣインヒビターを含む画分 ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地で懸濁したＳｆ９ を集めた。これらを４∼20％マルチゲルを用いてＳＤＳ 細胞を150ｃｍ2 培養フラスコに1.2×107 細胞／10ｍｌ播 いた後、27℃にて１時間静置してフラスコに固着させ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、銀染色及び 20 抗ヒトプロテインＣインヒビター抗体を用いたウエスタ た。次いで、培養上清を除去し、10％ウシ胎仔血清を含 ンブロッティングで分析し、得られた各プロテインＣイ むＴＮＭ−ＦＨ培地５ｍｌとｗＰＣＩ発現用種ウイルス ンヒビターは高純度のものであることを確認した。 液100μｌを混和した液を加え、室温でシーソーにより 【００４５】３． トロンビン及び血漿カリクレインに ゆっくりと揺らしてウイルスを感染させた。１時間後、 対する阻害作用 ウイルス液を除き、10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−Ｆ 上記１．及び２．に述べたように発現及び精製した野生 Ｈ培地を30ｍｌ加えた。27℃にて４日間培養した後、培 型及び改変型プロテインＣインヒビター（ｗＰＣＩ、Ａ 養上清を回収し、遠心分離にて細胞残渣を除いたものを ｓｎ230Ｓｅｒ、及びＡｓｎ319Ｇｌｎ）それぞれとヒト ｗＰＣＩ大量発現用のウイルス液としてストックした。 尿由来プロテインＣインヒビター（以下、「ｕＰＣＩ」 同様に、改変型プロテインＣインヒビター発現用種ウイ と略す。）のトロンビン及び血漿カリクレイン阻害活性 ルス液を用いて各改変型プロテインＣインヒビター大量 30 を比較した。0.15Ｍ塩化ナトリウム及び0.05％ウシ血清 発現用ウイルス液を作製した。 アルブミンを含む50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0） 【００４３】ｆ） 野生型及び改変型プロテインＣイン 中でトロンビン（最終濃度10ｎＭ）及び血漿カリクレイ ヒビターの大量発現 ン（最終濃度10ｎＭ）と各プロテインＣインヒビター 150ｃｍ2 培養フラスコ５枚（培養液量30ｍｌ）にコンフ （最終濃度25∼500ｎＭ）を37℃にて15分間反応させ ルエントに用意したHigh-Five細胞をピペッティングに た。これらの反応液それぞれに合成基質（最終濃度１ｍ より剥がして得た細胞懸濁液を10ｍｌずつ新しい150ｃ Ｍ、S-2238：トロンビン活性測定用、S-2302：血漿カリ ｍ2 培養フラスコに播いた後、27℃にて１時間静置して クレイン測定用：共に第一化学薬品社製）を加え、405 細胞をフラスコに固着させた（合計15枚）。次いで、培 ｎｍにおける吸光度の時間変化量をTHERMOmax Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices社製)でモニタ 養上清を除いた後、15枚のフラスコそれぞれに10％ウシ 胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地４ｍｌとｗＰＣＩ大量 40 ーして得た反応初速度から算出した各酵素の残存活性を 発現用のウイルス液１ｍｌを混和したものを加え、室温 利用して、各酵素の活性を50％阻害するのに必要な各プ にてシーソーでゆっくりと揺らしてウイルスを感染させ ロテインＣインヒビター濃度（ＩＣ5 0 ）を求めた。結果 た。１時間後、ウイルス液を除き、Ex-CELL400培地５ｍ を表１及び２にまとめる。 ｌにて細胞を濯いだ後、同培地を30ｍｌ加えた。27℃に 【００４６】 て３日間培養後、遠心分離（2,000ｒｐｍ、５分間）に 【表１】 て細胞残渣を除去し、ｗＰＣＩを含む培養上清を得た。 同様に、各改変型プロテインＣインヒビター大量発現用 のウイルス液を用いて、各改変型プロテインＣインヒビ ターを含む培養上清を得た。 【００４４】２． 野生型及び改変型プロテインＣイン 50 −8− (9) 特開２００２−１０７８３ 15 16 ＊【００４７】1 ) Fujita M, Thrombosis and Haemostas is, 84:54-58(2000)より引用。 【００４８】 【表２】 ＊ 【００４９】1 ) Fujita M, Thrombosis and Haemostas Ａｓｎ型糖鎖の修飾を制限することで、トロンビン及び is, 84:54-58(2000)より引用。 血漿カリクレインに対して強い阻害作用を有する改変型 【００５０】ｕＰＣＩ及びｗＰＣＩの10ｎＭトロンビン 活性に対するそれぞれのＩＣ5 0 値は、150ｎＭ及び120ｎ プロテインＣインヒビターを得ることができることを示 している。 20 Ｍであった。同様に、20ｎＭ血漿カリクレインに対する 【００５２】 それぞれのＩＣ5 0 値は100ｎＭ及び65ｎＭであった。Ａ 【発明の効果】本発明によれば、血液凝固系の異常亢進 ｓｎ230Ｓｅｒのトロンビン及び血漿カリクレインに対 及びそれに伴う炎症反応の亢進に対する抑制作用が、先 するＩＣ5 0 値はそれぞれ58ｎＭ及び34ｎＭであり、Ａｓ に知られている尿由来ヒトプロテインＣインヒビターよ ｎ319Ｇｌｎのトロンビン及び血漿カリクレインに対す りも顕著に強い改変型ヒトプロテインＣインヒビターを るＩＣ5 0 値はそれぞれ94ｎＭ及び44ｎＭと、ｕＰＣＩ及 得ることができる。更に、本発明の改変型ヒトプロテイ びｗＰＣＩと比較して顕著に低いものであった。すなわ ンＣインヒビターは遺伝子組換え技術等により容易に作 ち、プロテインＣインヒビターのＡｓｎ230又はＡｓｎ3 製することが可能でありしかも該尿由来ヒトプロテイン 19に糖鎖が結合しなければ、トロンビン及び血漿カリク Ｃインヒビターに比して少量で同等の効果が得られるた レインに対する阻害活性が顕著に増加することを示して め、生体成分から精製するよりも多量且つ安定した供給 30 いる。 が可能となる。 【００５１】この結果は、Ａｓｎ230、Ａｓｎ319を含む 【００５３】 Ａｓｎ型糖鎖結合部位のアスパラギン残基を置換して、 【配列表】 Sequence Listing <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Modified Protein C Inhibitors <130> P94-00 <160> 10 <210> 1 <211> 1221 <212> DNA <213> Homo sapience <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 1 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln -19 -15 -10 −9− -5 45 (10) 特開２００２−１０７８３ 17 18 ggg gcc tcc ctt cac cgc cac cac ccc cgg gag atg aag aag aga 90 Gly Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg -1 1 5 10 gtc gag gac ctc cat gta ggt gcc acg gtg gcc ccc agc agc aga 135 Val Glu Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg 15 20 25 agg gac ttt acc ttt gac ctc tac agg gcc ttg gct tcc gct gcc 180 Arg Asp Phe Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala 30 35 40 ccc agc cag aac atc ttc ttc tcc cct gtg agc atc tcc atg agc 225 Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser 45 50 55 ctg gcc atg ctc tcc ctg ggg gct ggg tcc agc aca aag atg cag 270 Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln 60 65 70 atc ctg gag ggc ctg ggc ctc aac ctc cag aaa agc tca gag aag 315 Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys 75 80 85 gag ctg cac aga ggc ttt cag cag ctc ctt cag gaa ctc aac cag 360 Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln 90 95 100 ccc aga gat ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg aac ctc tcc tgc agg gtg gtg Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val −10− 765 (11) 特開２００２−１０７８３ 19 20 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser 315 320 325 gag atg gtg cac aaa gct gtg gtg gag gtg gac gag tcg gga acc 1080 Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val Asp Glu ser Gly Thr 330 335 340 aga gca gcg gca gcc acg ggg aca atc ttc act ttc agg tcg gcc 1125 Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr Phe Arg Ser Ala 345 350 355 cgc ctg aac tct cag agg cta gtg ttc aac agg ccc ttt ctg atg 1170 Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met 360 365 370 ttc att gtg gat aac aac atc ctc ttc ctt ggc aaa gtg aac cgc 1215 Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val Asn Arg 375 380 385 ccc tga 1221 Pro <210> 2 <211> 387 <212> PTN <213> Homo sapience <400> 2 His Arg His His Pro Arg Glu 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DNA <213> Homo sapience <400> 4 cgcggatcct caggggcggt tcactttgcc aagg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer identical to nucleotides 733-765 in the sequence u nder SEQ ID NO:1 except that the sequence of nucleotides 13-15 in the pr imer encodes Ser instead of Asn <400> 5 ctcctggacc ggtccctctc ctgcagggtg gtg 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer identical to nucleotides 1003-1034 in the sequence under SEQ ID NO:1 except that the sequence of nucleotides 10-11 in the primer encodes Gln instead of Asn <400> 6 ggcatcagcc agcactcaaa tatccaggtg tc 32 <210> 7 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <220> <223> Designed sequence to be identical to the sequence under SEQ ID NO: 1 except that the nucleotides 745-747 encode Ser instead of Asn <400> 7 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag 45 Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu 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ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg tcc ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 −14− 295 945 (15) 特開２００２−１０７８３ 27 28 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu 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gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg aac ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys −17− 855 (18) 特開２００２−１０７８３ 33 34 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc cag cac 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