様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書 - KAKEN - 科学研究費

様式 C-19
科学研究費補助金研究成果報告書
平成２２年５月３１日現在
研究種目：若手研究(スタートアップ)
研究期間：2008～2009
課題番号：20850011
研究課題名（和文）シグナル伝達のクロストークの解明を目指した足場蛋白質の構造・機能
に関する研究
研究課題名（英文） Studies on Structure and Function of Scaffold Proteins for elucidation
of signal transduction cross-talk
研究代表者
工藤基徳（KUDOU MOTONORI）
東京大学・大学院新領域創成科学研究科・特任助教
研究者番号：00456188
研究成果の概要（和文）
：創薬のターゲットとして重要であるシグナル伝達関連蛋白質の調製の
向上およびドメイン間相互作用の制御に必要な諸因子を抽出した。また、溶媒が完全長蛋白質
におけるドメイン間のトポロジーとリガンド親和性の変化に及ぼす影響をＸ線小角散乱および
共鳴プラズモン測定、滴定型熱量計（ITC）によって評価した。溶媒が各ドメインの安定性や
構造変化に与える影響を蛍光スペクトルおよび円偏光二色性スペクトル(CD)で評価した。
研究成果の概要（英文）： For signal transduction related proteins, several factors essential for
improvement of preparation system and the regulation of domain-domain interactions have been
extracted. The effects of solvent and/or additives on the topology of domains and ligand affinity of
whole-length proteins have been evaluated using SAXS, SPR, and ITC. The effects of solvent and/or
additives on domain stability and structural changes have been interpreted using fluorescence
spectroscopy and circular dichrorism.
交付決定額
2008 年度
2009 年度
年度
年度
年度
総計
直接経費
1,320,000
1,200,000
間接経費
396,000
360,000
（金額単位：円）
合計
1,716,000
1,560,000
2,520,000
756,000
3,276,000
研究分野：生物物理学、生物工学
科研費の分科・細目：生物生体工学
キーワード：足場蛋白質、シグナル伝達系、ドメイン、溶媒
１．研究開始当初の背景
ゲノムプロジェクトの進捗によって、高等
真核生物を構成する蛋白質の約 70％が、複数
のドメインがリンカーによって連結された
マルチドメイン蛋白質であることが明らか
となった。シグナル伝達関連蛋白質は、特に
マルチドメイン蛋白質であることが多く、シ
グナル伝達のクロストークにおいて個々の
機能ドメインが作用すると考えられてきた。
さらに、近年、足場蛋白質と呼ばれる蛋白質
が、キナーゼ群の反応場を提供することでシ
グナル伝達におけるクロストークを制御し
ていることが示唆されつつある。
これまでに、シグナル伝達関連蛋白質とリ
ガンドの相互作用について、プルダウンアッ
セイや酵素ツーハイブリット法によってス
クリーニングが行われてきた。また、構造機
能解析では、SH2、SH3 などの各ドメインに
分割した欠損変異体について報告がなされ
てきた。近年 MAP キナーゼシグナル伝達経
路に存在する足場蛋白質のひとつである
MEK partner protein (MP1)の完全長蛋白質の
構造・機能解析の報告があるが、分子量が
14kDa と小さくシングルドメインの構造であ
るため、分子量が大きく複数のドメインを持
つシグナル伝達関連蛋白質が多いなかで特
殊な事例である。
北海道大学のグループが SH2 と SH3 の二つ
のドメインで構成される足場蛋白質
Grb2(growth factor receptor-bound protein)の空
間分布についてＸ線小角散乱を用いて解析
したことによると、Grb2 の天然構造にはドメ
イン間のトポロジーが大きく異なる 2 つの構
造が存在しており、その構造を変化させるこ
とでシグナル伝達のクロストークを制御し
ていることが提案された。
シグナル伝達を原子レベルで理解すること
を困難にしている理由は、マルチドメイン蛋
白質が蛋白質の調製の段階で凝集してしま
う場合が多く、完全長蛋白質として調製する
方法がいまだに確立されていない。
２．研究の目的
創薬のターゲットとして重要であるシグナ
ル伝達関連蛋白質の調製の向上およびドメ
イン間相互作用の制御に必要な諸因子の抽
出を目指す。また、溶媒が完全長蛋白質にお
けるドメイン間のトポロジーとリガンド親
和性の変化に及ぼす影響を平衡論的および
速度論的に考察することを目的とした。
３．研究の方法
発現系の構築
Grb10,14: リガンドである Insulin receptor(IR)
と IGFR のドメイン Grb10 と Grb14 の完全長
蛋白質ベクターを構築した。Grb10 および
Grb14 は、5 つの機能ドメインを持つが、今
回用いるリガンドは主に Grb の C 末端側のド
メインと相互作用することが報告されてい
るので、Ｎ末端側のドメインを欠損させた変
異体のベクターを複数構築した。精製過程を
簡便化するため、N 末端に 6×His タグを融合
させるように設計した。大腸菌による発現で
は、宿主として BL21(DE3)株を用いた。各ド
メインは、培養温度や発現誘導時間、発現誘
導物質 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
(IPTG)の濃度を制御することで可溶性画分に
発現させることを試みた。蛋白質の精製は、
His タグによるアフィニティークロマトグラ
フィーとゲルろ過の 2 段階精製を行った。精
製蛋白質の純度は、SDS-PAGE によって確認
した。
Transducer of ErbB2,1（TOB1）:CNOT7 と直接
結合し、CNOT7 の有する deadenylase 活性を
調節することが示唆されている。TOB1N 末端
BTG ホモロジー領域と CNOT7 の複合体の X
線結晶構造が決定されているが、結合におけ
るホモロジー領域以外の機能は未知である。
TOB1 の C 末端領域は、構造予測により
disorder 領域と予測されている。263-345 位領
域が大腸菌発現において不溶性画分に発現
させるという知見を得ていたため、C 末端側
の 109 残基、あるいは 83 残基を除いた欠失
変異体 DM1、DM2 および BTG/TOB ホモロ
ジー領域に相当する DM0 を調製した。
添加剤によるシグナル伝達系蛋白質のハン
ドリング
シグナル伝達関連蛋白質を解析するにあた
ってのボトルネックはハンドリング法であ
る。アルギニンを基軸に複数の化合物を混合
した溶液をデザインした。
各ドメインの機能評価
Grb の欠損変異体とリガンドである IR と
IGFR の相互作用を、等温滴定型カロリメト
リー（ITC）および表面プラズモン共鳴（SPR）
による平衡論的・速度論的相互作用解析を目
指した。さらに、添加剤存在下における相互
作用を併せて測定することで、速度論的およ
び平衡論的な立場から、添加剤の効果を推察
した。
TOB1: 調製した変異体について円二色性偏
光（CD）スペクトル測定による構造解析、等
ITC および SPR による平衡論的・速度論的相
互作用解析を行った。
X 線小角散乱におけるドメイン間トポロジー
の測定
欠損変異体におけるドメイン間のトポロジ
ー変化を X 線小角散乱(SAXS)による慣性半
径や形状の算出から評価する。SAXS におい
ては、緩衝液からのノイズの影響が大きいこ
とから、欠損変異体における SAXS の測定か
らノイズに影響しない程度の添加剤の濃度
を見積った。
足場蛋白質のハンドリングの最適化
簡便なハンドリング溶媒系を目指すために、
添加剤を複数混合した。蛋白質の凝集は、動
的光散乱（DLS）による粒径を指標に特性解
析を行った。凝集体形成に関わる相互作用は、
疎水性領域を検出するアニリノナフタレン
スルホン酸（ANS）など蛍光プローブを用い
て評価した。可溶性画分の蛋白質濃度は
SDS-PAGE や western blotting によって評価し
た。
(2010)
構造・機能・物性評価
②Saeko Yanaka, Motonori Kudou, Yoshikazu
Tanaka, Takumi Sasaki, Sumiyo Takemoto,
Atsuko Sakata Yukio Hattori, Tomoyuki Koshi,
Shiro Futaki, Kouhei Tsumoto, and Toshihiro
Nakashima Contribution of the flexible loop
region to the function of Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) Protein Eng. Des. Select.
in Press(2010)
調製した蛋白質については、各ドメインに
おける特性解析と同様に、CD や蛍光スペク
トルを用いて構造変化を評価した。さらにド
メインの特性解析に用いた添加剤を加え、ド
メイン間に相互作用が存在するときの各ド
メインの構造および安定性に及ぼす影響を
精査する。添加剤の存在下において、相互作
用を ITC や表面プラズモン測定によって評価
した。さらに、添加剤の存在下におけるドメ
イン間のトポロジー変化を SAXS から評価し
た。
４．研究成果
Grb10 、 Grb14 ：リガンドである Insulin
receptor(IR)の Grb10,Grb14 結合領域はペプチ
ド固相合成により調製した。Grb10 と Grb14
の完全長蛋白質を BL21(DE3)に発現させたが、
いずれの変異体も目的の分子種としては発
現せず、部分的に分解されていることが明ら
かとなった。Ｎ末端側のドメインを欠損させ
た変異体は可溶性画分に発現し、２段階精製
によってサンプルを得た。しかしながら、得
られた変異体を用いて IR ペプチドとの相互
作用を SPR により測定したところ、速度論的
な解析ができるほどの十分な親和性は観察
されなかった。
TOB1: 遠紫外 CD スペクトルから DM1 の 2
次構造が DM2 に比べ崩れていることを示し
ており、polyQ、polyP 領域の立体構造維持へ
の寄与が示唆された。ITC および SPR 解析か
ら親和性は DM1 より DM2 の方がわずかに親
和性が高かった。DM2-CNOT7 結合の遷移状
態では、大きなエントロピー損な状態であり、
一時的な蛋白質構造の誘起あるいは水和を
伴っていることが推測された。結合速度定数
ka の温度依存性を調べたところ、DM1 は温
度上昇とともに増大したが、興味深いことに
DM2 は温度上昇に対して減尐した。このこと
から、polyP, polyQ 領域が温度変化に対する
結合機構の変化に重要な影響を及ぼすこと
が示唆された。現在ホモロジー領域を含まな
い欠失変異体を作成し、速度論的相互作用解
析を中心に解析を進めている。
５．主な発表論文等
（研究代表者、研究分担者及び連携研究者に
は下線）
〔雑誌論文〕（計１３件）
①Ryota Abe, Jose M. M. Caaveiro, Motonori
Kudou and Kouhei Tsumoto Solubilization of
Membrane Proteins with Novel N-Acylamino
Acid Detergents. Mol. BioSyst. 6 , 677-679
③ Nagatoishi S, Tanaka Y, Kudou M and
Tsumoto K. Temperature and salt concentration
alter base-sequence selectivity of a duplex
DNA-binding protein. Mol. Biosyst. 6 ,
98-101(2010)
④ Mizuno T, Suzuki K, Imai T, Furutani Y,
Kudou M, Oda M, Kandori H, Tsumoto K,
Tanaka T Manipulation of protein-complex
function by using an engineered heterotrimeric
coiled-coil switch. Org. Biomol. Chem. 7,
3102-3111 (2009)
⑤ Kageyama Y, Murayama M, Onodera T,
Yamada S, Fukada H, Kudou M, Tsumoto K,
Toyama Y, Kado S, Kubota K, Takeda S.
Observation of the membrane-binding activity
and domain structure of gpV, which comprises
the tail spike of bacteriophage P2. Biochemistry
48, 10129-10135(2009)
⑥ Nakakido M, Kudou M, Arakawa T, and
Tsumoto K. To be excluded or to bind, that is
the question: Arginine effects on proteins Curr.
Pharm. Biotechnol. 10, 415-420 (2009)
⑦Futatsumori-Sugai M, Abe R, Watanabe M,
Kudou M, Yamamoto T, Ejima D, Arakawa T,
and
Tsumoto
K. Utilization
of
an
arginine-elution
method
for
FLAG-tag
chromatography Protein Expr Purif. 67,
148-155 (2009)
⑧ Nagatoishi S, Tanaka Y, Kudou M and
Tsumoto
K. The
interaction
of
hyperthermophilic TATA-box binding protein
with single-stranded DNA is entropically
favorable and exhibits a large negative heat
capacity change at high salt concentration. Mol.
BioSyst. 5, 957-961 (2009)
⑨Sakamoto S, Jose M. M. Caaveiro, Sano E,
Tanaka
Y,
Kudou
M
and
Tsumoto
K Contributions of interfacial residues of
human Interleukin15 to the specificity and
affinity for its private alpha-receptor. J. Mol.
Biol.389, 880-894 (2009)
⑩Abe R, Kudou M, Tanaka Y, Arakawa T and
Tsumoto K. Immobilized
metal affinity
chromatography
in
the
presence
of
arginine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 381,
306-310 (2009)
⑪工藤基徳、津本浩平 アルギニンによる蛋
白質ハンドリング ペプチドニュースレター,
72 , 9-11(2009)
⑫Nakakido M, Tanaka Y, Mitsuhori M, Kudou
M, Ejima D, Arakawa T and Tsumoto
K. Structure-based analysis reveals hydration
changes
induced
by
arginine
hydrochloride. Biophys. Chem. 137, 105-109
(2008)
⑬工藤基徳, 津本浩平 アミノ酸を利用した
クロマトグラフィー. バイオインダストリ
ー, 5 月号, (2008)
〔学会発表〕（計１８件）
①黄色ブドウ球菌由来膜表面蛋白質 EbpS の
物性・機能解析
中木戸誠, 田中良和, 工藤基徳, 相川知
宏, 森宏員, 中川一路, 津本浩平
第 82 回日本生化学会大会
神戸ポートアイランド
2009 年 10 月 21~24 日
②会議名称：第 82 回日本生化学会大会
開催日：2009 年 10 月 21~24 日
開催場所：神戸ポートアイランド
発表題目：高機能化 IL11 改変体の特性解析
谷中冴子, 佐野恵海子, 工藤基徳, 三浦
謹一郎, 津本浩平
③黄色ブドウ球菌由来鉄取り込み蛋白質に
おけるヘム輸送機構解析
安部良太・工藤基徳・津本浩平
第 82 回日本生化学会年会＠神戸ポートア
イランド
2009 年 10 月 21-24 日
④黄色ブドウ球菌膜表面由来天然変性蛋白
質 EbpS の物性解析
中木戸誠, 田中良和, 工藤基徳, 小西雄介,
二木史朗, 津本浩平
第 24 回生体機能関連化学シンポジウム
九州大学医系キャンパス・百年記念講堂
2009 年 9 月 13~15 日
⑤第 24 回生体機能関連化学シンポジウム、
第 12 回バイオテクノロジー部会シンポジウ
ム
2009 年９月 14 日〜15 日（九州大学医系キャ
ンパス・百年記念講堂）
ポスター発表 1P-105
化膿レンサ球菌由来ヒアルロン酸分解酵素
群の構造特性評価
○宮房孝光・工藤基徳・中川一路・津本浩平
⑥ Structure-based analysis reveals hydration
changes of Lysozyme and Glucose isomerase
induced by Arginine hydrochloride
Makoto Nakakido, Yoshikazu Tanaka, Mariko
Mitsuhori, Motonori Kudou, Daisuke Ejima,
Tsutomu Arakawa, and Kouhei Tsumoto
Protein Society 23rd annual symposium
Boston Marriott Copley Place
2009 年 7 月 25~29 日
⑦ 会議名称： Protein Society 23rd annual
symposium
開催日：2009 年 7 月 25~29 日
開催場所：Boston Marriott Copley Place
発表題目： Characterization of Interleukin 11
agonist & antagonist
Saeko Yanaka, Emiko Sano, Motonori Kudo,
Kin-ichiro Miura, Tsumoto Kouhei
⑧会議名称：第 74 回日本インターフェロ
ン・サイトカイン学会
開催日：2009 年 6 月 26~27 日
開催場所：芝覧会館（京都大学）
発表題目：創薬開発を目指したインターロイ
キン 11 改変体の物性解析
谷中冴子・佐野恵海子・工藤基徳・成瀬紀男・
三浦謹一郎・津本浩平
⑨黄色ブドウ球菌膜表面由来機能未知蛋白
質 EbpS の機能解析
中木戸誠・田中良和・工藤基徳・相川知宏・
森宏員・中川一路・津本浩平
第９回日本蛋白質科学会年会
熊本全日空ホテルニュースカイ
2009 年 5 月 20~22 日
⑩Arg 存在下の金属キレートクロマトグラフ
ィーとその応用
安部良太・工藤基徳・津本浩平
日本化学会第９０春季年会＠日本大学船橋
キャンパス
2009 年 3 月 26-29 日
⑪IL15 と IL15R 受容体 a 鎖の相互作用の精査
坂本壮、Jose M. M. Caaveiro、工藤基徳、田中
良和、津本浩平
第 31 回日本分子生物学会年会・第 81 回日本
生化学会大会合同大会、神戸ポートアイラ
ンド、2008 年 12 月 9 日-12 日
⑫ Structure-based analysis reveals hydration
changes induced by Arginine hydrochloride
Nakakido Makoto, Tanaka Yoshikazu, Mitsuhori
Mariko, Kudou Motonori, Ejima Daisuke, Kita
Yoshiko, Arakawa Tsutomu, Tsumoto Kouhei
第 31 回日本分子生物学会年会第 81 回日
本生化学会大会合同大会
神戸ポートアイランド
2008 年 12 月 9-12 日
⑬Transducer of ErbB2,1(TOB1)と CNOT7 間相
互作用の精密解析
渡邊正人・工藤基徳・田中良和・山本雅・津
本浩平
BMB2008
神戸ポートアイランド
2008 年 12 月 9-12 日
⑭黄色ブドウ球菌由来ヘム鉄取り込み蛋白
質におけるヘム鉄受け渡し機構の解析
安部良太・工藤基徳・カアベイロ-ホセ・津本
浩平
第 31 回日本分子生物学会年会
第 81 回日本生化学会年会
(合同大会)
神戸ポートアイランド
2008 年 12 月 9-12 日
⑮抗アミロイド β 抗体を用いた生体超分子構
造形成制御
有里樹理、工藤基徳、武井俊朗、中島敏博、
杉村和久、津本浩平
第 82 回日本生化学会大会
神戸ポートアイランド
2008 年 12 月 9～12 日
⑯ワクチンの創成を目指した黄色ブドウ球
菌毒素改変体の分子特性解析
谷中冴子・工藤基徳・田中良和・中島敏博・
津本浩平
第 31 回日本分子生物学会
神戸ポートアイランド
2008 年 12 月 9-12 日
⑰ワクチンの創成を目指した黄色ブドウ球
菌毒素改変体の分子特性解析
谷中冴子・工藤基徳・田中良和・中島敏博・
津本浩平
第 3 回バイオ関連化学合同シンポジウム
東京工業大学
2008 年 9 月 18-20 日
⑱アルギニン存在下での金属キレートアフ
ィニティークロマトグラフィー
安部良太・工藤基徳・津本浩平
第 8 回日本蛋白質科学会年会
タワーホール船堀
2008 年 6 月 10-12 日
〔図書〕
（計１件）
工藤基徳, 津本浩平 リフォールディング技
術-総論-、酵素利用技術大系、NTS
〔その他〕
ホームページ等
http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/phys-biochem
６．研究組織
(1)研究代表者
工藤基徳（KUDOU MOTONORI）
東京大学・大学院新領域創成科学研究科・
特任助教
研究者番号：00456188
(2)研究分担者
該当なし
研究者番号：
(3)連携研究者
該当なし
研究者番号：

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