酵素基質を用いた微生物培地

酵素基質を用いた微生物培地
微生物検査の
簡易化・迅速化
チッソ（株）横浜研究所
牛山正志
微生物培地
• 阻害剤
• 炭水化物から酸産生
• アミノ酸の脱炭酸
• ｐH指示薬
代謝産物に
より判断
– 培地・コロニーの色で判定
• 微生物の酵素活性に
より発色
酵素基質培地
• 微生物の生育を見やすくする
– 多くの微生物で発色する基質
• テトラゾリウム塩、エステラーゼ、フォスファターゼの基質など
• 特定の微生物だけを発色させる→判定が容易
– 微生物群の定義に基づく
• 大腸菌群
– 目的の微生物がもつ酵素活性を検出
• 大腸菌など
– 他に比べて強い酵素活性を検出
• 黄色ブドウ球菌など
酵素基質培地：高価であった
酵素基質価格低下コスト減
微生物の生育を見やすくする
• テトラゾリウム塩
– 微生物の代謝に伴いに還元されて色素ホル
マザンを生じる。
• TTC→赤色
• INT→朱色
• テトラゾリウムバイオレット→紫色
– おもに一般生菌用、
– 大腸菌群用にも使用例あり。
微生物の生育を見やすくする
• エステラーゼ、フォスファターゼ
– 生きている生物は必ずもっている。
– 一般生菌、（非培養鏡検用）
– 真菌（かび・酵母）
• ＋クロラムフェニコール
真菌(かび・酵母)用
• Ｘ-アセテート、インドキシルアセテート
など
– エステラーゼ、リパーゼにより分解
CH 3
Cl
– 青色スポット
O
Br
H
N
O
N
H
Cl
Br
Cl
N
H
Br
特定の微生物だけを発色させる
• 大腸菌群
– 乳糖を分解し、酸とガスを生じる通性嫌気性
グラム陰性無芽胞性桿菌。
– 乳糖を分解＝βｰガラクトシダーゼ活性
– グラム陽性菌の生育は押さえる。
• グラム陽性球菌にはβｰガラクトシダーゼ活性をも
つものがある。
大腸菌群用
• X-Gal
β-ガラクトシダーゼ
青色スポット
CH2OH
O
OH
O
H
N
beta-Galactosidase
Br
Cl
O
N
OH
N
OH
X-gal
Cl
O
CH2OH
Br
O
OH
OH
+O2
oxidation
Cl
Abs.615nm
(Blue spot)
OH
OH
Br
特定の微生物だけを発色させる
• 大腸菌用
– EC培地44.5±0.2℃→EMB→IMViC試験→
– βｰグルクロニダーゼ活性
• 大腸菌の95％以上がもつ
• 他の腸内細菌科では一部のサルモネラ、赤痢菌、
エルシニアのみがもつ。
• グラム陽性菌の生育は押さえる。
• X-グルクロン酸塩など
特定の微生物だけを発色させる
• 黄色ブドウ球菌用
– NaCl耐性
– マンニットより酸産生
– 高い酸性フォスファターゼ活性
• X-Phosなど
• ｐＨ低下→緑色
乾式シート状培地
• 手軽に使える
– 調製の手間不要
• 省スペース
• 少廃棄物量
– シャーレの1/20以下
• 寒天培地と高い相関
– 定量性
• 種々の微生物用の開
発可能
• 酵素基質添加
• 長期保存が可能
シート状培地「サニ太くん」など
シート状培地「サニ太くん」
透明フィルム
不織布
フィルム
水溶性高分子フィルム(含培地成分)
粘着シート
不織布および試料液
試料液
1mL添加
不織布 + 試料液
•
•
•
•
•
•
一般生菌用
真菌用
大腸菌群用
大腸菌用
黄色ブドウ球菌用
サルモネラ用
水溶性高分子フィルムが
TTC
X-acetate
X-Gal
X-Glucronic acid
X-phosphate
非酵素基質、H2S
試料液に溶解
水溶性高分子フィルム(含培地成分)
培養
水溶性高分子培地成分溶液を含む不織布
微生物の生育は不織布表面上で赤色 (一般生菌
用)、青色(大腸菌群用、真菌用)、緑色(ブドウ球
菌用 )、黒色 (サルモネラ用 )スポットとして観察
される
図2. サニ太くんの基本構成(透明フィルムと粘着シートは不織布高分子フィルムのないところで密着している)
一般生菌用
• TTC
8
8
7
7
サニ太くん一般生菌用 (logcfu/g)
サニ太くん一般生菌用　2日(logcfu/mL)
標準法（標準寒天培地）との比較
6
5
4
3
y = 1.020 x - 0.165
R2 = 0.982
2
6
5
4
y = 0.977 x + 0.044
3
R2 = 0.993
2
1
1
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
3
4
5
6
7
標準寒天　2日(logcfu/mL)
Plate Count Agar(標準寒天) (logcfu/g)
AOACPTM認証
8
真菌用
• エステラーゼの基質
• 標準法より短い培養時間で発色約3日
• より早く、2日間培養培地を検討中
2
サニ太くん　真菌用　3日　(logcfu/mL)
サニ太くん　真菌用　2日　(logcfu/mL)
ポテトデキストロース寒天とサニ太くん
の比較
1
0
0
1
2
ポテトデキストロース寒天培地　5日
(logcfu/mL)
2
1
0
0
1
2
ポテトデキストロース寒天培地　6日
(logcfu/mL)
大腸菌群用
デソキシコレイト寒天培地
• X-Gal法 βｰガラクトシダーゼ活性
（横浜市衛研HPより）
• 青色コロニーを数える。判定容易
8
8
7
y = 0.95 x + 0.23
r=0.95
サニ太くん大腸菌群用(logcfu/g)
サニ太くん大腸菌群用(logcfu/g)
y = 0.94 x + 0.29
6
5
4
3
2
7
r=0.95
6
5
4
3
2
1
1
1
2
3
4
5
6
7
デソキシコレート寒天培地(logcfu/g)
8
1
2
3
4
5
6
X-Gal寒天培地(logcfu/g)
7
8
試料調製の差が現れにくい（サニ太くん）
ほぼ同時に調製
焼き鳥
50g ←大腸菌群株
50g ←大腸菌群株 50g ←大腸菌群株
50g ←大腸菌群株 50g ←大腸菌群株
約1000cfu
約1000cfu
約1000cfu
約1000cfu
← 450mLPBS
← 450mLPBS
← 450mLPBS
← 450mLPBS
← 450mLPBS
ストマッカー
ストマッカー
ストマッカー
ストマッカー
ストマッカー
培養
培養
培養
約1000cfu
順次調製
培養
培養
サニ太
くん
970
970
890
900
870
米国公
定法
1050
970
560
700
450
有意差あり
cfu/g
cfu/g
HO
OH
大腸菌用
H
COOH
H
H
H
βｰグルクロニダーゼ活性
青色コロニーが大腸菌
O
HO
Cl
O
Br
H
N
H
30
サニ太くん大腸菌用　大腸菌数(cfu/mL)
•
•
20
10
0
0
10
20
XMG寒天培地　大腸菌数(cfu/mL)
30
サルモネラ
• C8-エステラーゼ
特異性不十分
• 硫化水素産生
硫化鉄（黒色）
試料液
サルモネラ
サルモネラ以外
黄色ブドウ球菌用
•
•
•
グラム陰性菌の生育は押さえる
マンニットから酸を酸性
酸性フォスファターゼ活性
H
N
Cl
Br
Cl
O
Br
N
H
Cl
O
P
ONa
Br
ONa
N
H
緑～青緑の
コロニー
黄色ブドウ球菌用特異性
• 陽性
– S.aureus
– S.cohnii
– S.xylosus
– S.intermedius
• 陰性
–
–
–
–
–
Bacillus
Enterobacteriaceae
Micrococcus
Streptococcus
S.delphini（青色）
– 左記、上記以外の
Staphylococcus
乾式シート状培地「サニ太くん」
•
•
•
•
調製の手間不要
省スペース
少廃棄物量
長期保存が可能
• 酵素基質添加
– 判定容易
– 見やすい
• 寒天培地と高い相関
• 様々な用途に使える
自主検査に適す

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