第35回日本リウマチ・関節外科学会シンポジウムヒアルロン酸と再生医療日時 2007年11月9日（金）会場品川プリンスホテルアネックスタワー座長演題・演者 FGF2とデキサメタゾンは弾性軟骨細胞のヒアルロン酸産生を増加させ軟骨形成を促す関矢一郎先生久保俊一先生京都府立医科大学大学院医学研究科運動器機能再生外科学教授石黒直樹先生名古屋大学大学院医学系研究科機能構築医学専攻運動・形態外科学教授東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科・軟骨再生学准教授ヒアルロン酸による関節組織の遺伝子発現変化高橋謙治先生京都府立医科大学大学院医学研究科運動器機能再生外科学講師機械的振動とヒアルロン酸が三次元培養軟骨細胞に与える影響竹内良平先生横浜市立大学大学院医学研究科運動器病態学准教授ヒト体性幹細胞の三次元培養組織に対する力学刺激とヒアルロン酸による組織リモデリング、再生中田研先生大阪大学大学院医学系研究科外科系臨床医学専攻器官制御外科学講師軟骨細胞ヒアルロン酸阻害モデルにおける回復過程解析西田佳弘先生名古屋大学大学院医学系研究科機能構築医学専攻運動・形態外科学講師共催：第35回日本リウマチ・関節外科学会／科研製薬株式会社／生化学工業株式会社現在ヒアルロン酸は、関節の痛みや炎症を和らげるための関節内注射として広く用いられている。しかし、その生物学的効果について、どこまで期待できるのか、それによって次世代の医療にどうつなげていくのかといった問題が残されており、これを本シンポジウムの主題として据えた。今回、再生医療に対して、ヒアルロン酸にはどのような役割があるのか、5人の演者に発表していただいた。久保俊一先生京都府立医科大学大学院医学研究科運動器機能再生外科学教授石黒直樹先生名古屋大学大学院医学系研究科機能構築医学専攻運動・形態外科学教授演題・演者 p.2 FGF2とデキサメタゾンは弾性軟骨細胞のヒアルロン酸産生を増加させ軟骨形成を促す関矢一郎先生（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科・軟骨再生学准教授） p.3 ヒアルロン酸による関節組織の遺伝子発現変化高橋謙治先生（京都府立医科大学大学院医学研究科運動器機能再生外科学講師） p.4 機械的振動とヒアルロン酸が三次元培養軟骨細胞に与える影響竹内良平先生（横浜市立大学大学院医学研究科運動器病態学准教授） p.5 ヒト体性幹細胞の三次元培養組織に対する力学刺激とヒアルロン酸による組織リモデリング、再生中田　研先生（大阪大学大学院医学系研究科外科系臨床医学専攻器官制御外科学講師） p.6 軟骨細胞ヒアルロン酸阻害モデルにおける回復過程解析西田佳弘先生（名古屋大学大学院医学系研究科機能構築医学専攻運動・形態外科学講師） 1 FGF2とデキサメタゾンは弾性軟骨細胞のヒアルロン酸産生を増加させ軟骨形成を促す関矢一郎（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科・軟骨再生学准教授）線維軟骨細胞をFGF2とヒドロコルチゾンを含有する培養液を用軟骨細胞はHAS2とHAS3、特にHAS3を強く発現し、これがHA いて二次元培養すると、軟骨細胞が増殖し培養液がゲル化する。合成に最も寄与していると考えられた。この軟骨細胞を含むゲル状の培養液を鼻に注入すると弾性軟骨が形成されると矢永らは報告している。矢永式軟骨再生法の再現しかし、この方法にはいくつかの不明な点が含まれる。すなわち、矢永式軟骨再生法が再現されるかどうかを、再分化培地で弾性 ①ゲル化した培養液の主成分は何か、②このゲル状基質を産生す軟骨細胞を培養して得られたゲル状培地をマウス皮下のポケットにる細胞は軟骨に再分化することによるものか、③弾性軟骨だけでは移植し検討した。最初はゲル状だが、2週間後には軟骨様の硬さになく、硝子軟骨細胞や間葉幹細胞を用いても培養液がゲル化するなり、トルイジンブルーで紫に染まるような基質産生が認められた。4 のか、④他の軟骨分化を誘導するような培地を用いてもこのことが週間後にはⅡ型コラーゲンを発現し、8週目ではelastica van 可能かどうかである。これらのことを確かめるために、弾性軟骨細胞 Gieson染色陽性の弾性線維を認めた。8週間経過したものは、ポ（小耳症の副耳由来）、硝子軟骨細胞（変形性膝関節症由来）、ジティブコントロール（弾性軟骨細胞）に劣らないような基質産生、染滑膜幹細胞（前十字靭帯損傷で得られた滑膜由来）を使って検色性を示した（図2）。　討を行った。これは培地内に豊富に産生された細胞外基質が軟骨細胞の散逸を防ぐとともに、三次元環境を保持するscaffoldを形成したためゲル化した培地の主体と考えられる。HAに富む細胞外基質に包埋された軟骨細胞の移いずれの細胞も形は紡錘形をしており、細胞の形に大きな違い植は、骨格発生過程での間葉凝集に類似するとも考えられる。はみられないが、3種類の培地における各細胞の培養の結果、弾性軟骨細胞と再分化培地（DMEM10％ FBSにデキサメタゾンとまとめ FGFを添加）の組み合わせが最も細胞増殖率が高く、細胞の重層弾性軟骨細胞にFGF2とコルチコステロイドを作用させて得られ化が顕著にみられた。たゲル化した培地の主体はHAであった。一方、硝子軟骨細胞やコンドロイチン4硫酸およびコンドロイチン6硫酸濃度は、いずれの間葉幹細胞を用いても培地はゲル化しなかった。三次元培養で軟細胞でも再分化培地を用いると経時的に上昇傾向を示した。また、骨分化を誘導する培地を用いて二次元培養しても、培養液のゲル弾性軟骨細胞を再分化培地で培養すると、ヒアルロン酸（HA）が化は起らなかった。著明に産生されたが、硝子軟骨細胞、滑膜幹細胞のHA産生量は、弾性軟骨細胞ほどではなかった（図1）。軟骨特異的な遺伝子の発現 RT-PCRを用いて軟骨特異的な遺伝子の発現を解析したところ、弾性軟骨細胞では、HA合成酵素のうちHAS1は発現せず、 HAS2とHAS3が発現していた。再分化培地で21日間培養すると、 HAS2のみの発現が維持され、軟骨関連遺伝子の発現から弾性図1 図2 2 ヒアルロン酸による関節組織の遺伝子発現変化高橋謙治（京都府立医科大学大学院医学研究科運動器機能再生外科学講師）変形性膝関節症（膝OA）に対するヒアルロン酸（HA）の関節内によるNO産生が抑制され、特に滑膜で有意に抑制された（図3）。注入療法に関しては、メタアナリシスにより、膝OAの症状を有意に以上の結果から、HA治療効果のメカニズムの一因として、OA 改善することが明らかにされている。ここではHAの効果発現メカニ軟骨細胞のアポトーシス抑制と滑膜および半月組織におけるNO産ズム解明のために、ウサギ前十字靱帯切離（ACLT）OAモデルを生抑制が考えられた。用いて行った我々の研究を紹介する。膝OA軟骨下骨由来骨芽細胞に対するHAの効果 MMP-3、TIMP-1、IL-1βの遺伝子発現に及ぼす影響膝OAにおけるサイトカインやプロテアーゼの発現動態に関して ACLT OAモデルを用い、ACL切離後4週から分子量90万のは、関節軟骨あるいは滑膜において詳細に報告されているが、軟 HAを週1回、5週間、関節内に投与したところ、HA投与群では非骨下骨においてはまだ十分ではない。我々は、膝OAの病態を解投与群と比較して有意にOAグレードの進行が抑制されていた。そ明するには、軟骨、滑膜と併せて軟骨下骨にも焦点をあてることがこで各OAグレードにおけるMMP-3 mRNAの発現を調べたところ、重要と考え、膝OAの人工関節手術時に軟骨下骨と骨棘を採取、滑膜ではOAが進行していない群（グレード1、2）において、HA投与単離した骨芽細胞をHA添加培養液中で培養し、HAのIL-6、で発現が抑制された。なお、軟骨においてはHA投与による発現抑 MMP-13、RANKLなどの遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。制は認められなかった。その結果、IL-6の遺伝子発現は軟骨下骨、骨棘いずれにおい IL-1β mRNAの発現を調べたところ、MMP-3と同様にグレードてもHA添加により有意に抑制され、MMP-13の遺伝子発現は、 1および2において非投与群と比べてHA投与群でその発現が抑制軟骨下骨においてHA投与により有意に抑制された。RANKLのされていた。一方、TIMP-1の発現については、滑膜・軟骨ともに遺伝子発現は、HA投与により軟骨下骨、骨棘いずれにおいても群間に差は認められなかった。有意な変化はみられなかった。以上のことから、HAの治療効果のメカニズムの一つとして、初期以上はまだpreliminaryな研究ではあるが、HAの関節内投与が OA滑膜組織におけるMMP-3およびIL-1β遺伝子発現の抑制が膝OA軟骨下骨にも作用する可能性を示している。示唆された（図1）。図2 アポトーシスおよびNO産生に及ぼす影響同モデルを用いて、OA関節軟骨のアポトーシスおよび一酸化窒素（NO）産生に及ぼすHAの影響について検討したところ、肉眼的なOAグレードはHA投与群、PBS投与群、非投与群の順に軽度で、HA投与によってOA進行が抑制されていた。軟骨細胞のアポトーシスの割合を各群間で比較すると、PBS投与群、非投与群と比較してHA投与群では有意に低下していた（図2）。また、滑膜、半月、軟骨を組織培養し、LPSで刺激するとNO産生が亢進するが、これにHAを添加すると、いずれにおいてもLPS刺激図1 図3 3 機械的振動とヒアルロン酸が三次元培養軟骨細胞に与える影響竹内良平（横浜市立大学大学院医学研究科運動器病態学准教授）三次元培養軟骨細胞に対して、メカニカルストレスの一種である染色では、振動を加えることでインテグリンおよびその裏打ちタンパク振動を加え（矩形波、振幅500nm、周波数100Hz、培養翌日から毎であるパキシリン、FAK、さらに細胞増殖に影響を与えるシグナル伝日24時間）、その影響がヒアルロン酸（HA）を加えることで、どのよう達経路にあるMAPKなどの発現強度が増した。その発現強度は振に変化するかを調べた。動とHAをそれぞれ単独で加えた群と比べると、振動とHAの両方を加えた群で高かった（図2）。軟骨細胞数の経時的変化このことから、振動刺激が細胞に与える影響は細胞膜に存在するブタ足関節より採取した関節軟骨から軟骨細胞を単離し、アテロメカノレセプターであるインテグリンを介して細胞内に伝達され、コラーゲンゲルに混ぜ、 Ⅰ型コラーゲンスポンジに吸着させて培養し、 MAPK経路を活性化して核にシグナルを伝達することが示唆され顕微鏡で観察した。スポンジは1週目は透過性が高かったが、しだいた。さらに、近年、軟骨細胞増殖に関係があることが示されたβ-カテに透過性が低下したことから、軟骨細胞間の基質産生が亢進したとニンの発現は、振動のみを加えた群とHAのみを添加した群とで同考えられた。クリスタルバイオレット染色にて生細胞数をカウントすると、等の発現強度が認められ、両方を加えることで更に発現が増強され培養2週目まで経時的に増加し、2週目の細胞数は培養開始時のた（図2）。約3倍であった。振動群と非振動群を比較すると、振動群で培養軟また、電子顕微鏡で軟骨細胞表面を観察すると、コントロール群の骨細胞数は有意に増加した。しかし、振動群と非振動群それぞれ細胞表面は比較的スムーズであったが、振動とHAを加えた群では、の中では、HA添加の有無による細胞数の変化に差はなかった。表面から伸びる長い突起状の構造物が形成されることが観察され培養液中のコンドロイチン4硫酸、コンドロイチン6硫酸産生量との接着性が増加し、細胞骨格を形成するアクチンフィラメントがより軟骨基質産生の指標として考えられるコンドロイチン4硫酸異性活発に伸びて接着斑を形成したことによると考えられた。さらに、細体の産生量をHPLC法にて分析した。4硫酸異性体は経時的に増胞周囲には細胞外基質様の高密度の構造物の産生も認められた。加し、特に振動とHAを加えた群で産生量が高かった（図1）。コンドロ力学刺激とHAという組み合わせは、今後の軟骨再生の研究にイチン6硫酸も同様に、経時的に増加し、振動とHAを加えると、高い新しい可能性を生み出すことが期待される。産生量が得られた。免疫組織学的検討た。これは振動刺激を加えた影響で軟骨細胞と細胞を取り巻く基質まとめ振動刺激はインテグリンを介したMAPK経路を活性化し、軟骨細コラーゲンスポンジ上には軟骨細胞層が形成され経時的に層の厚胞の分化、増殖に影響を及ぼすことが明らかにされた。さらに、そのさが増した。培養後1週間では、コントロール群（振動なし、HAなし）作用はHAを添加することで増加した。に比べ、HA添加群および振動を加えた群でさらに厚い細胞層が形 HAは軟骨細胞に対するメカニカルストレスの効果を増強させると成された。2週目でも、コントロール群に比べて、振動とHA添加群で考えられる。軟骨基質の産生と細胞分化が極めて良好であり、またTypeⅡコラーゲンの生産量も非常に高かった。スポンジ上に形成された軟骨層の図2 細胞数とスポンジ内の細胞数との比は約2：1であった。蛍光抗体図1 4 ヒト体性幹細胞の三次元培養組織に対する力学刺激とヒアルロン酸による組織リモデリング、再生中田研（大阪大学大学院医学系研究科外科系臨床医学専攻器官制御外科学講師）力学刺激とヒアルロン酸（HA）の作用をヒト滑膜由来幹細胞をたが、HAを添加すると抑制された。用いた三次元培養にて検討した。その他、Ⅲ型コラーゲン、TGF-β1、HAS2、CD44などは、HA 添加により遺伝子発現が増強した。方法と組織学的所見培養液中のHA濃度は、刺激5日目と15日目でやや上昇したが、ヒト滑膜由来幹細胞をアテロコラーゲンのscaffold中に分散さ HA添加によりさらに上昇した。また、HA添加によってグリコサミノせ、培養5日目から0.5Hzの力学刺激（5kPaまたは20kPa）を1日1 グリカン（GAG）濃度も上昇することが分かった。時間、5日間または15日間与えた。なお、5kPaは変形量3 ～ 5％の弱い刺激、20kPaは変形量10 ～ 20％の非生理的で過大なス組織のリモデリングトレスである。組織のリモデリングは、マトリックス分解が先に進み、続いて組織この力学刺激によって組織が壊れ、細胞が漏れ出すということの合成や再構成、マトリックスが再構成されると考えられている。はなく、電子顕微鏡で観察すると、細胞はコラーゲンscaffold中のすなわち、生体内で力学刺激を受けると、MMP-1とMMP-3のゲル内に埋まっているものからコラーゲンスポンジに接着しているも遺伝子発現が亢進して分解が進み、次にsox9、 Ⅱ型コラーゲン、アのまであった。グリカンの遺伝子発現が増加することによってマトリックス合成が促これにHAを添加し、5kPa、20kPaの力学刺激を与えた群では、進されることがうかがわれる。そこにHAを加えると、組織リモデリン細胞周囲マトリックスがやや増加していた。このことから力学刺激グの初期における分解が遺伝子発現レベルで抑制され、さらに、とHAを加えることにより細胞のアグリゲーションと軟骨マトリックスの HAS、CD44やTGF-βの遺伝子発現を増加させてHAやGAGの蓄積が認められることが分かった（図1）。合成を促進させることにより、組織の合成や再構築を亢進すると考えられる（図2）。遺伝子発現 DNA量は、5kPa刺激群と20kPa刺激群、そしてHA添加の有まとめ無では大きな差はなく、アポトーシスについてもこの刺激条件ではこのようにHAは、ヒト滑膜由来幹細胞による三次元組織培養変化は認められなかった。において、メカニカルストレスによるリモデリングを促進する可能性が RT-PCRマイクロアレイを用いて骨軟骨関連遺伝子の発現量あることから、力学刺激とHAは、組織のリモデリングを促進させるとを定量化すると、アグリカンの遺伝子発現は5kPa、20kPaの力学考えられる。刺激を加えた群でHAを添加することで増強され、sox9の遺伝子発現も増強された。Ⅱ型コラーゲンの遺伝子発現量は5kPaの低刺激群でHAの添加なしでも増加したが、HAを添加することによってさらにそれが増強された。Ⅸ型コラーゲンの遺伝子発現については有意差を認めなかった。MMP-1とMMP-3については、 20kPa刺激群で、HA添加なしで遺伝子発現の増強が認められ図1 図2 5 軟骨細胞ヒアルロン酸阻害モデルにおける回復過程解析西田佳弘（名古屋大学大学院医学系研究科機能構築医学専攻運動・形態外科学講師）ヒアルロン酸（HA）依存性の細胞周囲マトリックスは、細胞を保護度を上げると、細胞周囲マトリックスに新たに合成されるPG量が用し、また成長因子などを保持して細胞分化に関与するなど、さまざま量依存的に増加した。な役割を担っている（図1）。本研究では、軟骨細胞周囲のHAを中組織培養においても、HA6添加を繰り返すと、PG量が減少して心としたマトリックスをヒアルロニダーゼまたはHAオリゴ糖（6糖、くる。しかし、OP-1の添加によってその減少を妨げると、軟骨表層 HA6）で処理して除去した後のマトリックス回復過程を解析した。さおよび深層において、ともにHAの染色性が増強した（図3）。らにその回復過程を細胞増殖性サイトカインの1つであるOP-1 （BMP-7）を用いて検討した。まとめ関節軟骨細胞は、HA合成酵素であるHAS2が中心となって、アグリカンとHAS2の上昇 CD44、アグリカンと協調しながら細胞周囲マトリックスを形成するこ単離した軟骨細胞をヒアルロニダーゼやHA6で処理すると、細とが分かった。また、マトリックス形成が一旦阻害されても、HAS2、胞周囲マトリックスに存在するHAが消失し、マトリックス形成が抑制 CD44、アグリカンを中心とした回復能があれば再形成が可能であされる。しかし、ヒアルロニダーゼやHA6を除去すると、徐々に細胞ることも示唆された。周囲マトリックスにHAが増加し、マトリックス形成が回復してくる。したがって、軟骨細胞自体にマトリックス形成の再生能力が残っそこで、mRNA発現をRT-PCRで調べてみると、回復過程におていれば、HAもしくは細胞増殖性サイトカインを添加することで、細いて、HAS2が約2倍に上昇し、アグリカンも上昇していることが分胞周囲マトリックスが形成される。ただし、進行したOAの軟骨細胞かった（図2）。つまり、アグリカンとHAS2のmRNA発現上昇が協調など、その回復能力がない場合には、再生能を増強できる何らかのしてマトリックスの形成回復に働いていると考えられる。添加物を加えなければマトリックス形成は難しいと考える。 OP-1による増強作用このマトリックス形成回復に対するOP-1添加の影響をHA6と OP-1を同時に投与して、同様にmRNAの発現を調べた。その結果、CD44において差異は認められなかったが、 HAS2あるいはアグ図2 リカンにおいてはOP-1を使うことによって、発現量がより増加した。次に細胞周囲マトリックス、軟骨細胞から離れた軟骨マトリックスおよび培養液中に流れ出たマトリックスの3分画で、それぞれ新たに合成されたプロテオグリカン（PG）量を測定した。HA6を投与した場合では、コントロールと比べて細胞周囲に新たに合成されたPGは少なかった。しかしOP-1を投与することで、細胞周囲のPG蓄積量が増加したことから、OP-1によりHA合成が増加し、細胞周囲に蓄積するPG量が増えたのではないかと考えられた。また、OP-1の濃図1 図3 6 第35回日本リウマチ・関節外科学会シンポジウムヒアルロン酸と再生医療【発行】科研製薬株式会社 2008年6月作成 ARD212-08F-10-CO1