第9回 広島大学・産総研バイオマスオープンセミナー Studies on cell morphogenesis during the cell cycle in fission yeast (分裂酵母の細胞周期における細胞形態形成に関する研究) 2011年5月20日 産業技術総合研究所 バイオマス研究センター エタノール・バイオ変換チーム 五島 徹也 1 Studies on cell morphogenesis during the cell cycle in fission yeast 分裂酵母の細胞周期における細胞形態形成に関する研究 背景 ・細胞形態について ・分裂酵母の紹介とこれまでの研究 ・ガン抑制経路について 結果 ・細胞形態形成におけるPpk11の機能解析 まとめ 現在の研究 2 Introduction 神経細胞 細胞形態は機能発現に重要である 感覚神経 介在神経 運動神経 感覚器官 筋肉 INPUT 樹状突起 軸索 OUTPUT シグナル伝達物質 糸状菌 （例：セルラーゼ生産） 分泌 核 酵素（セルラーゼ等） 小胞体 ゴルジ体 先端 菌糸の先端からタンパク質（セルラーゼなどの酵素）を分泌3 ガン細胞は細胞周期制御と細胞形態が異常である G2期 M期 チェックポイント 変異 ガン細胞 >細胞形態の異常 >過剰増殖 >エネルギー代謝の変化 S期 G1期 4 分裂酵母 学名 Schizosaccharomyces pombe ・アフリカのビールから単離された（1893年） ・子嚢菌の単細胞真核生物 ・細胞長13μm、直径3μmの円筒形の細胞形態をとる ・出芽酵母とは、10億年以上前に分化した ・細胞の中央で分裂して増殖する ・真核生物では6番目に、全ゲノム塩基配列が解読されている（2002年） ・遺伝子の半数がイントロンを持つことやタンパク質のアミノ酸配列の相同性 が、出芽酵母よりヒトと近い ・出芽酵母の遺伝学が利用できる ・耐塩性があり、スウェーデンAlfa-Laval社が開発したエタノール発酵法 （Biostilプロセス）で使用される 5 分裂酵母の細胞周期と細胞極性制御 3. 隔壁形成（細胞質分裂） 4. 細胞分離 1. 増殖開始点 New end Old end G1 M S G2 NE 微小管 アクチン MTOC iMTOC SPB eMTOC MTOC：Microtubule Organization Center OE 2. 細胞極性変換 NETO: New End Take Off 6 これまでに多数の極性変異体が取得されている 正常細胞（円筒形）変異体（球形） （分岐） （湾曲） Verde F, Mata J, Nurse P. J Cell Biol.131:1529-1538 (1995) 正常細胞 変異体 高温感受性 細胞極性異常 G2期遅延 極性変異体 mor (Morphological Round) mutant mor2, mor4/nak1 Hirata et al., EMBO J. 21: 4863-4874 (2002) 7 分裂酵母の細胞極性制御ネットワーク SIN Septation Initiation Network Cdc7 MOR Morphogenesis Orb6 Network SPB SIN GCK GCK Germinal Center Kinase NDRK Nuclear Dbf2-Related Kinase Sid1 MOR NDRK Sid2 Sid2 Pmo25 Nak1 Pmo25 Nak1 Mob2 Orb6 Mor2 アクチンリング 隔壁形成 細胞分離 GCK 隔壁, 細胞端 NDRK Kanai et al, EMBO J. 24: 3012-3025 (2005) 細胞極性制御 8 ガン抑制経路 Hippo経路 LKB1-AMPK経路 D. melanogaster Mammals Ex FERM6 Mer GCK NDRK Kibra STRAD NF2 Hpo Kibra MO25 LKB1 Mst1/2 MST4 AMPK Sav WW45 Mats Mob1 Wts Lats1/2 Yki YAP/TAZ mTOR 増殖 MRLC2 細胞極性 ? 細胞増殖 アポトーシス ? Ezrin ? ポイツ・ジェガース ガン症候群 (PJS) 細胞のガン化 9 Hippo経路は進化上保存されている MO25 分裂酵母 SIN GCK Interactor UpstreamK NDR NDRK MOB Furry Function Co-activator Scaffold アクチンリング・隔壁形成 Spg1 Sid1 Sid2 Mob1 Pmo25 Nak1 Orb6 Mob2 Mor2 細胞分離 細胞極性制御 MEN Tem1 Cdc15 Dbf2 Mob2 Nud1 細胞質分裂 RAM Hym1 Kic1 Cbk1 Mob1 Tao3 MOP-25.2 GCK-1 SAX-1 Hippo Trc Mats Furry 神経突起形成 Gck III Warts Mats Sav 神経突起維持 MOR Cdc11 細胞質分裂 出芽酵母 線虫 ハエ MO25 ヒト MO25 細胞極性制御 SAX-2 神経突起形成 M期進行 アポトーシス Mst1/2 Lats1/2 MOB1 WW45 Mst3 NDR1/2 MOB1 Furry1/2 神経細胞分化 STRAD Mst4 細胞極性 PJS癌症候群 LKB1 Ezrin 細胞極性形成 10 Germinal Center Kianse (GCK)の構造 N CRIB Kinase Domain STE20 Cdc42/Rac Interactive Binding PAK I II Regulatory Domain C GTPyWMAPEv STE20 signature sequence - - - - - VIII - X XI GCK Sp Ppk11 Sp Sid1 Sp Nak1 Sc Kic1 Dm Fray Hs MST4 Hs STRAD 298 307 314 350 351 317 422 NT GN TA EG HR EN EE I A A D T N L D D S V V T E E V VWD F G I E DWT F E D D GWE F G E MKWD F D T G EWVWS H P EWS F T V D DWE F T T T S S T V V I L E V RR KK KQ SS EE RK 312 321 328 364 365 331 431 471 652 1070 552 416 MO25-binding site Boudeau J. et al., EMBO J. 22: 5102-14 (2003) Sp GCK Deletion Localization Function Sid1 Nak1 Ppk11 Inviable Inviable Viable SPB SPB, Septum 細胞質分裂 細胞分離, 細胞極性制御 ? ? 11 Result Ppk11は細胞分離に重要である Mono Septated Bi Separating 100 2-nuclei WT, 36 ℃ 75 50 25 0 100 ppk11, 36 ℃ 75 50 25 0 0 60 120 (min) 180 240 12 Ppk11 はM期に隔壁形成部位に局在する G2 M G1/S G2 Ppk11-GFP Sad1-RED （SPB/中心体) 0 min 0 min 10 25 30 5 35 40 45 10 50 55 60 15 65 5 mm 13 SIN活性はPpk11の隔壁形成部位への局在に重要である SIN Cdc7 （核） SPB Sid1 Sid2 隔壁 Cdc15 Sid2 アクチンリング アクチンリング収縮 隔壁形成 修飾 （SPB/中心体) 14 Ppk11 はMOR経路の補助的役割をする MOR Pmo25 Nak1 Ppk11 100 80 60 Septated cells (%) 0.01 * pp << 0.05 ** * ** * 40 Mor2 Orb6 20 0 細胞分離 細胞極性制御 Length Diameter rod D/L 0.30 0.58 0.72 D/L 0.32 0.65 0.77 0.88 0.62 round D/L 1 0.92 0.80 15 Ppk11とPmo25は相互作用する 酵母2-ハイブリッドアッセイ Pmo25 Ppk11 Nak1 2-hybrid Co-IP Orb6 Mor2 共免疫沈降法（Co-IP） １６ Ppk11とPmo25は隔壁形成部位で共局在する １７ Ppk11はPmo25の隔壁形成部位への蓄積に重要である Pmo25-GFP Nak1-GFP GFP-Mor2 Orb6-GFP WT ppk11 １８ Ppk11はPmo25の隔壁形成部位への蓄積に重要である （アクチン) １９ Ppk11のWDF配列が細胞分離（Pmo25の隔壁局在）に重要である Septated cells 60 (%) 40 ppk11+ ppk11Δ8 ppk11-WDF/AAA * 20 GFP-RI 0 Ppk11-GFP 1.0 Sp Ppk11 Sp Sid1 Sp Nak1 Sc Kic1 Dm Fray Hs MST4 Hs STRAD * 0.5 0 GFP-RI Pmo25-GFP * 1.0 0.5 0 *P < 0.01 300 309 316 352 353 319 424 AAA I D E V V WD F G T V R R A D I E DW T F E T V K K A S D D GW E F G T I K Q D V E M KWD F D S L S S T V T G EWVW S S E E E N T H P EWS F T T V R K L E V D DWE F DB AD - - - Pmo25 Ppk11 - Ppk11 Pmo25 Ppk11WDF/AAA +His 312 321 328 364 365 331 431 +3AT - Ppk11WDF/AAA Pmo25 ２０ Summary Cdc7 SIN MOR SPB Pmo25 Sid1 Nak1 Sid2 隔壁 (細胞端) Ppk11 Sid2 Pmo25 WDF Pmo25 Nak1 Orb6 Mor2 隔壁形成 細胞分離 細胞極性制御 Ppk11 Nak1 Pmo25 Nucleus Goshima et al., J. Biol. Chem. 285: 35196-35205 (2010) ２１ 現在の研究 酵素糖化・発酵技術の研究開発 発酵の研究開発 同時糖化発酵（SSF）に適したエタノール発酵酵母の開発 糖化酵素の至適温度 約50℃ エタノール発酵の最適温度 25-30℃ C6C5同時発酵能に加えて高温耐性・耐酸耐塩性を有する酵母の育種が必要 NEDOプロジェクト 王子製紙との共同実験 Issatchenkia orientalis 特徴 酸塩熱耐性酵母 • 42℃の高温で生育可能 • pH2.0、塩濃度5％の培養条件下で生育可能で、 エタノール発酵可能 • キシロースを炭素源として使用可能だが、エタノールは生産しない ブラジルプロジェクト Kluyveromyces marxianus 特徴 耐熱性酵母 • 47-52℃の高温で生育可能 • 40℃以上の高温でもエタノール生産が可能 • キシロースやアラビノースなどを炭素源として 生育。エタノールは生産しない 今後の方針 分裂酵母、出芽酵母のバイオロジーを生かして、キシロースからエタ ノール発酵をする耐熱性酵母 を育種・開発する。 ２２ 謝辞 英国癌研究所 細胞制御部門長 登田 隆 先生 東京大学 大学院新領域創成科学研究科 教授 大矢 禎一 先生 The National University of Singapore Prof. Mohan K. Balasubramanian Cancer Research UK Prof. Iain M. Hagan 広島大学 大学院先端物質科学研究科 教授 教授 教授 教授 教授 准教授 助教 平田 下飯 土屋 山下 山田 大 先生 仁 先生 英子 先生 一郎 先生 隆 先生 水沼 正樹 久米 一規 School of Life Sciences at EPFL Assoc. Prof. Viesturs Simanis University of Massachusetts Medical School Assoc. Prof. Dannel McCollum University of Miami Miller School of Medicine Assoc. Prof. Fulvia Verde 広島大学 大学院生物圏科学研究科 教授 水田 啓子 先生 先生 広島大学 大学院先端物質科学研究科 先生 教授 小埜 和久 先生 ２3
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