Cycleave® ICAN™カンキツグリーニング病 (HLB) - タカラバイオ株式

製品コード
CY111
研究用
Cycleave® ICAN™
カンキツグリーニング病 (HLB)
原因菌検出キット
説明書
v201209Da
カンキツグリーニング病（Citrus greening disease; Citrus Huanglongbing; HLB）は、Candidatus
Liberibacter asiaticus（Ca . L. asiaticus）という病原体の感染により発症する柑橘類の重要病害で、接ぎ
木による伝染やミカンキジラミによる媒介により広まります。罹病した樹木では、葉に黄化症状を示し、
果実は黄化せず緑色のままとなります。病気が進行すると、果実や株全体の生育不良がおこり、最終的
に枯死に至ります。
感染拡大を防止するためには罹病樹の早期発見、除去が不可欠となりますが、カンキツグリーニング病
の病徴は要素欠乏症と類似しており、外見から見分けることは困難です。
本キットは、カンキツグリーニング病の病原体である Ca . L. asiaticus を、Cycleave ICAN 法により簡便
に検出するためのキットです。
Cycleave ICAN 法とは、等温核酸増幅法である ICAN 法と検出特異性が非常に高いサイクリングプロー
ブ法を組み合わせた方法です。ICAN 反応後のチューブにそのまま UV を照射して蛍光を目視確認するこ
Ca. L. asiaticus DNA 由来の増幅産物の有無を判定することができます。目的産物が増幅された場合、
とで、
反応液は UV 照射でピンク色を呈します。
【反応の原理】
1．サイクリングプローブ法
サイクリングプローブ法は、RNA と DNA からなるキメラプローブと RNase H の組み合わ
せによる高感度な検出法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出する
ことができます。プローブは RNA 部分を挟んで片方は蛍光物質で、もう一方はその蛍光
物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されています。このプローブは、
インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはありませんが、増幅産物中
の相補的な配列とハイブリッドを形成した後に RNase H により RNA 部分で切断されるこ
とにより、強い蛍光を発するようになります。この蛍光強度を測定することで、増幅産物
量をモニターすることができます。プローブの RNA 部分がミスマッチであれば RNase H
により切断されることはないので、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出方
法です。
F
Q
F
Q
F
Q
F
Q
2．ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法
（1）RNA（3' 側）と DNA（5' 側）からなるキメラプライマー
（2）鎖置換型 DNA 合成酵素（BcaBEST DNA ポリメラーゼ）
（3）
DNA-RNA ハイブリッド部位を切断するリボヌクレアーゼ（RNase H）
（4）
基質のデオキシヌクレオシドリン酸を用い、DNA の任意の領域を、50℃～ 65℃の一定
温度で増幅する方法です。
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2
製品コード CY111
キメラプライマーセット
鋳型DNA
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
DNA部分 RNA部分
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
5'
5'
3'
3'
5'
（50℃∼65℃）
strand displacement reaction
ステップ1
キメラプライマーの
アニーリング
（50℃∼65℃）
5'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
ステップ2
鋳型交換反応
3'
反応中間物Ａ
5'
RNaseH
5'
3'
3'
5'
RNaseH
5'
3'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
ステップ3
切れ目導入反応
ステップ4
鎖置換反応
ステップ5
鋳型交換反応
5'
3'
3'
反応生成物Ｂ
5'
5'
3'
3'
5' 反応中間物Ｃ
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
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3'
ステップ6
5'
鋳型交換反応
3'
反応中間物Ａ
5'
3
製品コード CY111
I．キットの内容（25 μl 反応　100 反応）
1．ICAN Enzyme Mix
2．HLB Primer / Probe Mix ＊
3．Sterilized dH2O
4．Positive Control DNA
＊：遮光保存に留意してください。
1,000 μl
500 μl
1,000 μl
40 μl（20 回分）
II．キット以外に必要な試薬、機器（主なもの）
[ 器具 ]
1．耐エアロゾル性マイクロピペット
2．マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）
3．0.2 ml マイクロチューブ（製品コード NJ200 など）
4．2.0 ml および 1.5 ml マイクロチューブ
5．ベンチトップクーラー（Agilent 社製 Code 410109 など）
6．ディスポーザブルグローブ（パウダーフリーがよい）
7．UV防護用具類
[ 機器 ]
1．ヒートブロック（100℃まで温度を上げられるもの）
0.2 ml 反応チューブが使用できるサーマルサイクラーでも可。
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Standard（製品コード TP650）など
2．卓上型微量遠心機（室温用も使用可）
3．UV ランプ
ハンディ UV ランプ , 長波長 365 nm タイプ（アズワン社製 Code 1-5479-01 LUV-4 など）
III．保存
－ 20℃
（6 ヶ月以内であれば、4℃での保存も可能です。融解時は激しい撹拌は避けてください。融解後は、
均一になるように軽くチューブを転倒混和してからご使用ください。融解時に沈殿物が生じた場
合は、軽くチューブを転倒混和して沈殿物を溶解後ご使用ください。）
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IV．実験上の注意点
増幅産物の混入（キャリーオーバーコンタミネーション）、反応チューブ間での混入（クロスコン
タミネーション）を防止するために、以下の事項をよくお読みください。
コンタミネーションの原因
1．実験者（特に、手や腕）
2．白衣（特に、袖口付近）、手袋
3．ピペットおよびチップ（検体 DNA を扱ったもの）
4．チューブ立て
5．実験ノート、筆記用具
6．その他、検体 DNA に触れたもの
つまり、検体 DNA に触れたものはもちろん、検体 DNA を扱うエリアで使用しているも
の全てが、コンタミネーションの原因になります。コンタミネーション防止のため、実験
手順の全段階で、以下の注意点をお守りください。
◎反応液の調製から検出まで次の 3 つのエリアを設定し、物理的に隔離することを推奨
します。
○エリア 1：反応液の調製、分注を行います。増幅産物や、検体の入ったチュー
ブの開閉は避けてください。
○エリア 2：検体の調製を行います。増幅産物の入ったチューブの開閉は避けて
ください。
○エリア 3：反応液への検体の添加と、反応、検出を行います。増幅産物の入っ
たチューブの開閉は避けてください。
◎ディスポーザブル手袋を着用し、汚染した場合はすぐに交換してください。
◎それぞれのエリア専用のピペット、フィルター付きのチップを使用してください。
◎検体 DNA を含むチューブを開閉する際、検体 DNA を反応液に添加する際に、エアロ
ゾルが発生しないように、十分注意してピペットを操作してください。キャップ開閉
時に手袋などから汚染しないように十分注意してください。
◎ICAN 反応に使用するプライマー、プローブには RNA 部分を含むため、RNase のコン
タミネーションには十分注意してください。
◎本キットでは、ICAN 反応終了後のチューブに、直接 UV 照射を行って判定を行うため、
ICAN 反応終了後の増幅産物を電気泳動などに使用する必要はありません。コンタミネ
ーション発生の原因となるので、増幅産物をチューブから取り出さないでください。
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V．サンプル DNA の調製法（エリア 2 で実施）
V-1. 植物からの DNA の調製方法
V-1-1 サンプリング
1） 5 ～ 10 枚の葉を採取する。
2）中肋＊ 1 を切り出し、滅菌したハサミでまとめて 5 mm 程度に切る。
＊ 1：葉の中央をとおっている太い脈
3）切片をよく混ぜ、0.1 g を秤量する。残りは再検査用として凍結保存しておく。
V-1-2 CTAB 法による抽出
1）滅菌した乳鉢に秤量した切片を入れ、液体窒素を適量加え、滅菌乳棒を用いて粉状に
すりつぶす。
2） CTAB 緩衝液＊2 を 1,500 μl 加え、軽く混合する。
＊ 2：1% CTAB, 200 mM Tris-HCl, pH 9.0, 100 mM EDTA, 8.1% NaCl
3）チューブに 750 μl を取り、恒温槽やヒートブロックで 65℃、30 分処理する。
4）フェノール／クロロホルム（1：1）を 750 μl 加え、十分に混合する。（よく混合する
ことがポイント）
5） 15,000 rpm で 2 分遠心する。
6）新しいチューブに上層 500 μl を回収する。
7）フェノール／クロロホルム（1：1）を 500 μl 加え、十分に混合する。（よく混合する
ことがポイント）
8） 15,000 rpm で 2 分遠心する。
9）新しいチューブに上層 400 μl を回収する。
10）イソプロパノール 400 μl を加え、混合したのち 5 分静置する。
11）12,000 rpm で 10 分遠心する。
12）上清を捨てる。（沈殿が透明な場合があるため、消失しないように注意）
13）70% エタノール 200 μl を加え、混合する。
14）12,000 rpm で 10 分遠心する。
15）上清を捨て、室温で短時間放置し乾燥する。（沈殿が透明な場合があるため、消失し
ないように注意）
16）滅菌蒸留水を 100 μl 加えて混合し、DNA を溶解する。
17）－ 20℃で保存する。
V-1-3 DNA 抽出キットを使用する方法
新芽、新葉などを用いた場合、V-1-2 の CTAB 法で調製した DNA では調製したサンプル
中に反応を阻害する物質や不純物が多く存在するため、期待される結果が得られない場合
がある。このような場合は精製純度の高い調製を行う必要があるため、市販の DNA 調製
キットを使用して調製する（例； QIAGEN DNeasy Plant Mini kit など）。DNA の調製は各
キットの説明書に従って行う。
V-2. ミカンキジラミからの DNA の調製方法　（簡易法）
1．ミカンキジラミを１匹ずつ 200 μl マイクロチューブに入れる。
2．各チューブに、100 μl の TE Buffer と 5 μl の 10 mg/ml Proteinase K を加え､滅菌した爪
楊枝でキジラミを磨り潰す。
3．12,000 rpm で 5 分遠心する。
4．55℃で 60 分インキューベート後、96℃で 15 分処理する。
5．粗汁液を試料とする。
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VI．操作
1．反応液の調製　（エリア 1 で実施）
氷上で＊ 1 サンプル DNA 等の鋳型以外のコンポーネント（15 ～ 24 μl）を必要本数 + α調
製し、各反応チューブに分注する。その内の 1 本は陰性コントロールとして、サンプル
DNA の代わりに全量が 25 μlとなるようにSterilized dH2Oを加えしっかりとふたをする。
必要本数は、サンプル数 +2 本（陰性コントロール反応、陽性コントロール反応）と設定する。
< 1 反応あたり >
ICAN Enzyme Mix
10 μl
HLB Primer / Probe Mix
5 μl
サンプル DNA or Sterilized dH2O or Positive Control DNA （1 ～ 10 μl）＊ 2
Sterilized dH2O
適宜
total
25 μl
＊ 1：ICAN 反応試薬は、常に氷中または保冷したベンチトップクーラーにて、0 ～ 4℃に
保冷しながら使用する。また、分注した試薬を他エリアへ移動させる際も、ベンチ
トップクーラーなどに入れ、常に 0 ～ 4℃を保持する。
＊ 2：サンプル DNA、Positive Control DNA はこの段階で加えない。全量が 25 μl となる
ように滅菌水の量を調整する。
2．サンプルの添加（エリア 3 に移動）
サンプル DNA（1 ～ 10 μl）を添加し、しっかりとふたをする。（全量 25 μl）
陽性コントロール反応には、Positive Control DNA 2 μlを添加し、しっかりとふたをする。
（全量25 μl）
3．卓上微量遠心機で軽く遠心を行った後、各チューブをサーマルサイクラー等にセットし、以
下の条件で反応を行う。（エリア 3 で実施）
70℃、5 分 → 57℃、90 ～ 120 分
4．反応終了後、チューブのフタは開けずに、そのまま UV を照射し、蛍光（ピンク色）の有無を
確認する。
（注意）
蛍光を確認する際は、UV 防護用具（めがね）を使用してください。または、UV ランプと組み合
わせて使用する暗箱（UVP 社　クロマトビューキャビネトなど）のご使用をお勧めします。
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VII．反応例
非感染葉サンプル DNA と Ca. L. asiaticus 陽性葉サンプル DNA を TE Buffer で 10 倍ずつ段階希釈し、
その 1 μl を反応に供した。反応後 UV 照射し、写真撮影を行った。
1
2
3
4
5
6
7
1．Negative Control
（Sterilized dH2O）
2．非感染葉サンプル 10 倍希釈
3．非感染葉サンプル原液
4．陽性葉サンプル 103 倍希釈
5．陽性葉サンプル 102 倍希釈
6．陽性葉サンプル 10 倍希釈
7．陽性葉サンプル原液
陽性葉サンプル（レーン 4, 5, 6, 7）
レーン 3 はサンプルによる反応液の白濁によるもの
陽性の場合：反応液はピンク色の蛍光を発する。
陰性の場合：反応液は蛍光を発しない。
※白濁したサンプルを使用した場合、反応液が白濁することがありますが、蛍光での
検出には影響ありません。
【注意】
判定は、ICAN 反応終了後、直ちに行ってください。
すぐに判定できない場合は、チューブを 4℃で保存し、1 日以内に判定してください。
※ UV の波長は、365 nm でより明瞭に確認できます。（254 nm でも確認できます）
※ 陽性の場合、UV 照射したチューブを目視すると、ピンク色に見えます。
■結果判定に関する注意事項
以下の検体を測定した場合、偽陰性になることがあります。
1．検体の DNA 量が少ない場合
2．不適切な検体処理により、DNA 抽出が不十分、または分解している場合
偽陰性が疑われる場合は、再度検体を採取し、DNA 抽出操作を行い、再測定を行ってください。
その他の原因でも偽陰性となる場合があります。確実な検出結果を得るために、1 検体につ
き 2 連で反応を行うことをお勧めします。
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VIII．参考文献
1. Hiroyuki Mukai, Takashi Uemori, Osamu Takeda, Eiji Kobayashi, Junko Yamamoto,
Kazue Nishiwaki, Tatsuji Enoki, Hiroaki Sagawa, Kiyozo Asada, and Ikunoshin Kato :
Highly Efficient IsothermalDNAAmplification System Using Three Elements of 5’-DNARNA-3’ Chimeric Primers, RNaseH and Strand-displacingDNAPolymerase. Journal of
Biochemistry 142 (2) : 273-281, 2007
2. Takashi Uemori, Hiroyuki Mukai, Osamu Takeda, Mariko Moriyama, Yoshimi Sato,
Shigekazu Hokazono, Nariaki Takatsu, Kiyozo Asada,* and Ikunoshin Kato : nvestigation
of the Molecular Mechanism of ICAN, a Novel Gene Amplification Method. Journal of
Biochemistry 142 (2) : 283-292, 2007
3. Naoya Urasaki, Shinji Kawano, Hiroyuki Mukai, Takashi Uemori, Osamu Takeda and
Teruo Sano : Rapid and sensitive detection of “Candidatus Liberibacter asiaticus” by
cycleave isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids. J.
Gen. Plant Pathol. 74 : 151-155, 2008
IX．関連製品
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Standard（製品コード TP650）
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Gradient（製品コード TP600）
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® mini（製品コード TP100）
0.2 ml Hi-Tube Dome Cap（製品コード NJ200）
0.2 ml Hi-Tube Flat Cap（製品コード NJ202）
0.2 ml Hi-8-Tube（製品コード NJ300）
0.2 ml Hi-8-Dome Cap（製品コード NJ301）
0.2 ml Hi-8-Flat Cap（製品コード NJ302）
Cycleave® ICAN™ キクわい化病原因ウイロイド（CSVd）検出キット（製品コード CY110）
Cycleave® ICAN™ PSTVd/TCDVd 検出キット（製品コード CY113）
X．注意
・本製品は研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用し
ないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の
製造に使用することは禁止されています。
・検査結果判定により発生する問題に関してタカラバイオ株式会社は一切の責任を負いま
せん。
・ライセンスに関する最新の情報は弊社ウェブカタログをご覧ください。
・本説明書に記載されている会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みも
しくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
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ご注意
本製品は、Epoch Biosciences, Inc. のクエンチャーのライセンスを受け、製造・販売されています。
本製品は、生命科学研究分野、食品検査を含む工業的検査分野、環境分析、法医学や動物診断における検出用です。また、
これらの分野において、第三者に検出サービスを提供するために、本製品を商業目的で使用することができます。
ヒトの医療、治療、診断や動物の医療、治療、およびバイオテロに関連する分析、患者の処置あるいは治療方法を選
択するための用途には使用できません。
本製品は、Epoch Biosciences, Inc. 保有の特許（US20020155484, WO0142505, WO02099141, US10/113,445,
US09/876,830）のライセンスのもと製造・販売されており、本製品と関連技術に関する権利は、上記特許の及ぶ範囲
において Epoch Biosciences, Inc. に属します。下記注にある商業用途のライセンスは包含されていませんので、当該
商業目的の使用には、Epoch Biosciences, Inc. からの別途ライセンスが必要です。
（注）別途ライセンスが必要な商業用途には以下の用途を含みます。
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なうこと。
C：本製品を含有するキットを販売・リース・ライセンス・その他の方法で第三者に引き渡すこと。
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NOTICE TO PURCHASER : LIMITED LICENSE
[L4] Quencher
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the services for patient management or care) and (II) any research or services where the results of any test or assay
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[M21] Bca BEST DNA Polymerase
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[M40] Thermostable RNase H
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[M44] ICAN technology
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[M46] PCR-Cycleave
This product is covered by the claims of Japanese Patent No. 4022522.
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