ß-脱炭酸脱水素酵素の阻害剤-補酵素複合体構造解析 Structure analysis of ß-decarboxylation dehydrogenase in complex with an inhibitor and NAD + 南後恵理子（研究技術開発室） Eriko Nango (Division of Synchrotron Radiation Instrumentation RIKEN SPring-8 Center) [email protected] ３-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（IPM DH）は、微生物、植物などが有するロイシン生合成経路に存在し、 NAD＋を補酵素、Mn２＋あるいは Mg２＋イオンを必須として、連続する酸化、脱炭酸反応を触媒する酵素である。 (IPMDH Reaction) H HO H H CO2 CO2 IPMDH NAD+ O NADH CO2 CO2 Isopropylmalate O CO2 O CO2 CO2 2-Oxocaproate 本酵素は、ß-脱炭酸脱水素酵素ファミリーに属し、類似酵素としては、クエン酸経路に存在するイソクエン酸脱水素酵素（ICDH）、リシン生合成酵素の一つであるホモイソクエン酸脱水素酵素（HICDH）などが知られている。本酵素は、抗菌剤や除草剤のターゲットとして注目されており、本酵素と基質、補酵素の認識機構の解明は重要である。我々は IPM DH の基質類縁体を各種合成し、活性検討を行ったところ、いくつかの類縁体で阻害活性を示した。阻害剤は一般的に酵素との良い複合体を形成することから、これら阻害剤を用いた IPMDH 複合体構造解析を行い、活性部位の詳細を明らかにすることを目的とした。また、同様に HICDH の阻害剤も開発したので、 HICDH 複合体構造解析の検討も併せて行った。酵素、阻害剤、補酵素との各種共結晶化スクリーニングを行い、得られた結晶について測定を行った。その結果、4 M ギ酸ナトリウム存在下で生成した Themus thermophilus 由来 IPMDH 複合体の結晶が、分解能 2.5 Å の反射を示し、空間群 P6122, a = 103.37, b = 103.37, c = 186.89 Å であることがわかった。 Themus thermophilus IPMDH-NAD ＋複合体構造 (PDB ID: 1HEX) をモデルとして分子置換法にて構造決定を行ったところ、阻害剤と NAD＋を含んでいることが明らかとなった。現在、精密化を行い、解析を進めている。また、各種 HICDH 複合体の共結晶化の検討も行っている。 3-Isopropylmalate dehydrogenase (IPMDH) and homoisocitrate dehydrogenase (HICDH) belong to a unique family of bifunctional decarboxylating dehydrogenases. IPMDH is a key enzyme in leucine biosynthesis of microorganism and plants, and catalyzes the NAD dependent oxidative decarboxylation of the substrate 3-isopropylmalate to 2-oxoisocaproate. HICDH is involved in the α-aminoadipate pathway of L-lysine biosynthesis in higher fungi such as yeast and human pathogenic fungi. This enzyme catalyzes the oxidative decarboxylation of homoisocitrate into 2-ketoadipate using NAD+ as a coenzyme. In order to clarify substrate recognition, we carried out structure analyses of IPM DH or HICDH complexes with synthesized inhibitors and NAD+ . As a result of co-crystallization screening, Themus thermophilus IPMDH-inhibitor-NAD+ crystals were obtained from the reservoir condition of 4 M sodium formate. The crystal belongs to the space group of P6122 with cell dimensions of a = 103.37, b = 103.37, c = 186.89 Å and diffracted beyond 2.5 Å resolution. The structure was solved by molecular replacement method using Themus thermophilus IPMDH structure (PDB ID: 1HEX). [参考文献 / References] (HICDH Reaction) H O2 C HO H CO2 CO2 Homoisocitrate HICDH NAD+ O2 C NADH O CO2 α-Ketoadipate Chiba, A.; Aoyama, T.; Suzuki, R.; Eguchi, T.; Oshima, T.; Kakinuma, K.; J. Org. Chem., 1999, 64, 6159-6165. Chiba, A.; Arai, N.; Eguchi, T.; Kakinuma, K.; Chem. Lett., 1999, 12, 1313-1314. Yamamoto, T.; Eguchi, T.; Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 3372-3376 Yamamoto, T.; Miyazaki, K.; Eguchi, T.; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 1346-1355