Th17細胞機能に及ぼす牛乳・乳発酵食品摂取の影響

Th17細胞機能に及ぼす牛乳・乳発酵食品摂取の影響
広島大学大学院生物圏科学研究科：田辺
創一
１．緒言
1-1. Th17細胞
免疫反応の制御にヘルパーT（Th）細胞が深く関わっていることが示されてきた。Th細胞は高等
生物にのみ存在する獲得免疫系において中心的な役割を担っている。Th細胞は胸腺で成熟した後、
外来抗原と遭遇していないナイーブTh（Th0）細胞として末梢のリンパ節などに分布する。Th0細
胞は抗原提示細胞から外来抗原を提示される際に、共刺激分子や周囲のサイトカイン環境などに
依存して、積極的な免疫応答を行うエフェクターTh細胞へと分化する。
エフェクターTh細胞には、主にインターフェロン（interferon, IFN）-γを産生するTh1細胞と、
主にインターロイキン（interleukin, IL）-4，IL-5、IL-13を産生するTh2細胞が存在し、それぞ
れ細胞性免疫と液性免疫の獲得免疫機構を担っている。両者のバランスが免疫調節に重要である
ことから「Th1/Th2バランス」という概念が提唱された（Mosmann et al., 1986）16)。その後、マ
ウスだけでなくヒトにおいてもTh1/Th2バランスの当てはまることが判明し（Romagnani, 1991）
20)
、さらに、Th1とTh2のマスターレギュレータが発見された（Murphy et al., 200017）; Murphy and
Reiner , 2002）18)ことで免疫学においてTh1/Th2バランスは隆盛を極めた。
自己免疫疾患とアレルギー疾患もTh1/Th2バランスで説明できるとされ、Th1細胞とTh2細胞の過
剰な免疫応答によって、自己免疫疾患とアレルギー疾患がそれぞれ発症すると考えられていた。
その後、1990年代に、制御性T細胞（regulatory T cell, Treg細胞）と呼ばれる免疫抑制性のTh
細胞が同定された（Chen et al., 19944）; Groux et al., 19979)）が、やはりTh1/Th2バランス
は定説として根付いていた。
しかし、Th1/Th2セオリーとは矛盾した実験結果も増えてきた
自己免疫疾患の一つである関節リウマチや多発性硬化症の動物モデルとしてコラーゲン誘導
関節炎（ collagen-induced arthritis, CIA）や実験的自己免疫性脳脊髄炎（ experimental
autoimmune encephalomyelitis, EAE）がそれぞれよく知られている。これらのモデルではTh1細
胞分化に中心的な役割を担うIL-12の構成分子であるIL-12p40に対する中和抗体によって病態が
緩和され、IL-12p40欠損マウスではCIAやEAEが発症しないことが知られている。このことから、
これらの疾患ではTh1細胞が病原因子であると考えられてきた（Gately et al., 1998）8)。しか
し、Th1細胞が産生するIFN-γの中和抗体投与やIFN-γ欠損マウスにおいては、CIAやEAEの病態
が逆に悪化することも報告されていた（Ferber et al., 19967）; Matthys et al., 199814)）。こ
のことからTh1細胞がこれらの疾患の病原因子か否かについては疑問がもたれ始めていた。そし
て、この矛盾は、IL-12p40がIL-12だけでなくIL-23も共通の構成分子であることから生じている
ことが分かった。事実、IL-12p35欠損マウスではCIAとEAEに感受性であるのに対し、IL-23p19欠
損マウスでは抵抗性であった（Cua et al., 2003）6)。このことからCIAとEAEの自己免疫応答に
関与しているのはIL-12でなく、IL-23であることが証明された。
- 57 -
この事実はCIAやEAEにおけるサイトカインの病的役割を示しているだけでなく、病原因子とし
てのTh細胞サブセットの役割を覆した。2000年にTh1細胞でもTh2細胞でもない、IL-17A（以下、
IL-17と表記）産生性のTh細胞が発見された（Infante-Duarte et al., 2000）10)が、2005年、IL-23
によって誘導されるIL-17産生細胞がEAEの病態に関わることが判明し、EAEの病原因子はTh1細胞
でなく、IL-17産生Th細胞であることが立証された（Langrish et al., 2005）12)。以後、IL-17
産生Th細胞は新たなTh細胞サブセットである「Th17細胞」として同定されるに至った。
このように、Th1/Th2バランスの概念を根底から覆したTh17細胞について、この数年で多くの
知見が得られてきた。Th17細胞は特徴的なサイトカインであるIL-17とIL-17Fの他に、IL-21、
IL-22、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor, TNF）-αを産生するTh細胞である。さらに、マ
ウスで発見されたTh17細胞はヒトにも存在することが確認され（Acosta-Rodriguez et al.,
20071）; Annunziato et al., 20072)）
、その発生はマウスにおいてはTh0細胞にトランスフォーミ
ング増殖因子（transforming growth factor, TGF）-βとIL-6の刺激を加えることで分化される
ことが決定づけられた（Bettelli et al., 20063）; Mangan et al., 200613)）。また、マスターレ
ギュレータとしてTGF-β+IL-6刺激によって誘導されるレチノイン酸レセプター関連オーファン
レセプター（retinoic acid receptor-related orphan receptor, ROR）γtが同定され（Ivanov
et al., 2006）11)、Th17細胞の独立なThサブセットとしての地位が確固たるものとして築かれて
きた。
その後の動物実験や臨床実験の結果、EAEだけでなく、Th1/Th2バランスで説明されてきた多く
の免疫疾患動物モデルやヒト免疫疾患でTh17細胞の関与が示されてきており（Oboki et al.,
200819）; Mesquita et al., 200915)）
、Th17細胞をターゲットとした免疫疾患の病態・治療の研究
が医学分野において急速に進むとともに、Th1/Th2バランスにTreg細胞とTh17細胞を加えた包括的
なTh細胞バランスを考える必要があると認識され始めている。
1-2. 本研究の目的
炎症性腸疾患などの自己免疫疾患やアレルギー性疾患に対して、牛乳・乳発酵食品などの摂取
が有効であることが動物レベルのみならず臨床的にも明らかにされつつある。例えばヨーグルト
の摂取がマウスの腸炎を抑制することが報告されている。とりわけヨーグルト製造に用いられる
プロバイオティクス乳酸菌による腸炎抑制については報告が増えてきている。本研究では、ビフ
ィズス菌と並ぶプロバイオティクス菌である乳酸菌のうち、ヨーグルト製造のスターターとして
最も汎用的に用いられるStreptococcus thermophilusに着目した。S. thermophilusは耐熱性の高
さからヨーグルト製造のスターターとして用いられてきただけでなく、ヨーグルトのテクスチャ
ーや官能特性を向上させる意味でも重要である。S. thermophilusはその発酵産物も含めて種々の
保健効果が報告されてきたが、Th17細胞への影響は未だ報告されていない。
我々は、Th17を抑制する食品因子として、ビフィズス菌体の効果について報告した（Tanabe et
al., 2008）21)。続いて本評価系を用いて、大麦発酵エキスやフラボノイドも同様の効果を有する
ことを報告してきた（Iguchi et al., 2009）。但し、これらはマウスの脾細胞を用いて検討した
ものであった。脾細胞と腸管免疫細胞とでは、微生物に対する応答が異なると考えられる。そこ
で、本研究では、腸管免疫細胞を用いて、牛乳・乳発酵食品・S. thermophilus菌体のTh17抑制効
- 58 -
果の確認とメカニズムの解明を行うとともに、経口投与時の有効性を判断するために腸炎モデル
マウスを用いた検討を行うこととした。ここでは、結果のまとまったS. thermophilusについて報
告する。
２．材料および方法
2-1. 用いた菌と培養方法
S. thermophilus ST28をM17培地で37℃、17～65時間培養した。培養後の菌を1,500 ×gで5分間
遠心分離し、培養上清を除去した。滅菌蒸留水を加えて懸濁後、再度1,500 ×gで5分間遠心分離
し、洗浄した。この洗浄を3回繰り返し、培地を滅菌蒸留水で置換した後、沸騰中の湯浴で50分間
加熱処理をした。これを凍結乾燥したものを、目的の菌数になるように細胞培養用の培地で希釈
して用いた。
2-2. マウス全脾細胞を用いた評価
マウス（BALB/c、雌、6週齢）を頸椎脱臼した後、脾臓を摘出し、脾細胞を培養した。細胞培養
培地の組成は、RPMI1640に、10%非働化ウシ胎児血清（FBS）、10μM 2-メルカプトエタノール、50
IU/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、0.01M 4-（2-ヒドロキシジメチル）-1-ピペラ
ジンエタンスルホン酸（HEPES）を加えたものとした。滅菌ナイロンメッシュと培地5 mLを予め入
れておいた6cmシャーレに、摘出した脾臓を入れ、滅菌ナイロンメッシュで挟んだ。5mLシリンジ
のブランジャーの裏側を使って脾臓を押しつぶし15mL遠沈管に回収した。350×g で5分間遠心し
て上清を除去し、red blood cell lysing bufferを2mL/spleen加えて混合し、氷上で5分間静置し
た。washing buffer（50IU/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、3%非働化FBSを含むHBSS
溶液）を10 mL/spleen加えて混合し、350×gで5分間遠心した。上清を除去し、10mL/spleenの
washing bufferで2 回洗浄した。1×107 cells/mLになるように培地を懸濁し、96穴プレートに
120μL/wellずつ播種した。Th17細胞への分化を誘導するために2ng/mLのhuman TGF-βと20ng/mL
のrecombinant mouse IL-6を添加し、S. thermophilus ST28（1×107cells/mL）とともに37°C
で72時間培養した。
2-3. サイトカイン濃度の測定
マウス脾細胞培養上清中のサイトカイン濃度は、IL-17を除き、Bio-Plexサスペンションアレイ
により測定した。まず、フィルタープレートにcytokine assay bufferを各wellに100μL添加し、
吸引ろ過した。
サイトカインに対するビーズ抗体を各wellに50μL添加し、bufferを吸引ろ過した。
各wellにcytokine wash bufferを100μL加え、吸引ろ過した。この洗浄操作を2回行った。各well
にサンプルまたはスタンダードを加え、プレートをシールし、30分間振とうした（室温、遮光）。
各wellにcytokine wash bufferを100μL加え、吸引ろ過した。この洗浄操作を3回行った。二次
抗体（ビオチンラベル抗体）を25μL添加し、プレートをシールし、30分間振とうした（室温、遮
光）
。各wellにcytokine wash bufferを100μL加え、吸引ろ過した。この洗浄操作を3回行った。
各wellにストレプトアビジン-フィコトリエン溶液を50μL添加し、プレートをシールし、10分間
振とうした（室温、遮光）
。各wellにcytokine wash bufferを100μL加え、吸引ろ過した。この洗
- 59 -
浄操作を3回行った。assay buffer を各wellに125μL加え、プレートをシールし、30秒間振とう
した。シールを剥がし、array readerで測定した。
IL-17濃度は、ELISAキットを用いて測定した。各wellに一次抗体（ラット抗マウスIL-17抗体、
2.0μg/mL）を100μL添加し、室温で一晩放置した。各wellにwashing buffer（0.05% Tween20 in
PBS、pH 7.2～7.4）を400μLずつ添加し、プレートの残余の水分を除去する操作を3回行った。以
下、この操作を「3回洗浄した」と略した。各wellにblocking buffer（1% BSA in PBS）を300μL/well
加え室温で1時間放置した。washing bufferで3回洗浄し、培養上清サンプルまたはスタンダード
（マウスIL-17）を100μLずつ加え室温で2時間放置した。washing bufferで3回洗浄し、各well
に二次抗体（ヤギ抗マウスIL-17抗体、200ng/mL）を100μL添加し、室温で2時間放置した。washing
bufferで3回洗浄し、各wellにstreptavidin-HRPを100μL加え暗室で20分間放置した。washing
bufferで3回洗浄し、各wellに基質溶液（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine（TMB））を100μL
加え、遮光条件で20分間放置した。各wellに反応停止液（1N H2SO4）を100μL加え、マイクロプ
レートリーダー（Model 680、Bio-rad）により450nmにおける吸光度を測定した。
2-4. DSS大腸炎マウスへのS. thermophilus No.28投与
デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与により腸炎を発症するマウスモデルを作成した。 6
週齢のBALB/cマウス雌性を購入した。
一定室温、12時間明暗サイクルに制御された部屋で飼育し、
飼育期間中は飼料と水道水を自由摂取させた。実験プロトコールをFigure 1に示した。急性大腸
炎は3.5％（w/v）DSS（分子量, 36,000-50,000; MP Biomedicals）を飲み水に混合し、5日間摂取
させることで発症させた。
マウスはランダムに3つのグループに分けた（n=4）
。Group1（control群）に、1日目から3日目
にPBSを経口投与した。またGroup 2（DSS群）には3.5% DSSを飲み水として、自由摂取させ、control
群と同様に1日目から3日目にPBSを経口投与した。Group 3（S. thermophilus ST28投与群）には、
3.5% DSSを飲み水として自由摂取させ、DSS投与開始時間の24時間後から3日間S. thermophilus
ST28死菌（1×10⁷ CFU/mouse/day）をそれぞれ経口投与した。
体重測定を毎日同じ時刻に行い、DSS投与から5日目に頸椎脱臼により屠殺後、解剖した。小腸
および盲腸から直腸までの大腸全体を摘出し、炎症の指標として大腸の長さを測定した。
2-5. 腸管粘膜固有層リンパ球（LPL）の調製
マウスを頸椎脱臼にて屠殺し、直ちに開腹して小腸と大腸の腸管を採取した。腸管に付着した
脂肪を取り除き、冷却したPBSの入った5㎝ディッシュに入れた。腸管内の糞などを除去し、PBS
で洗浄した。次に小腸にみられるパイエル板を除去した。腸管を開き、0.5cmに切断し、10mLのPBS
入った遠心チューブで洗浄後、5分間600×gで遠心した。上清を取り除き、5mM EDTA/1mM DTT-HBSS
で37℃ 140rpm 振とう湯浴で30分間振とうした。滅菌ナイロンメッシュを入れた10mLシリンジで
ろ過後、残った腸組織を10mLの5%FBS-HBSSで洗浄し、5分間 600×gで遠心した。上清を除去後、
残った組織をさらに細かく切断した。組織は1 mg/mL collagenase Dと3 mg/mL dispase IIで37℃
100rpm 振とう湯浴で30分間振とうした。上清はガラスウールの入った10ｍLシリンジでろ過し、5
分間600×gで遠心した。
5%FBS-HBSSで3回洗浄した後、
沈殿した細胞を40%パーコールに懸濁した。
- 60 -
別の50mL遠沈管に入れておいた80%パーコールの上に40%パーコールに懸濁した細胞液を重層し、
20分間1000×gで遠心し、40%と80%パーコールの境界面に浮遊細胞が集積した細胞をLPLとし、回
収した。回収後、HBSSで3回洗浄した。
また、パイエル板を小腸から切除し、5mLのRPMI培地が入ったシャーレに入れた。パイエル板を
ナイロンメッシュで挟み、シリンジのプランジャー部分で押しつぶした。溶液を15mL遠沈管に移
し、5分間350×gで遠心後、上清を除去した。そこへ、1.5mg/mL DispaseⅡを5mL加え、30分間 37℃
でインキュベートした。その後、5分間350×gで遠心し、RPMI培地で3回洗浄した。LPLは5×105
cells/mL、PPは１×106cells/mLになるように培地を懸濁し、24穴プレートに1.2mL/wellずつ播種
した。IL-17の発現を誘導するために50ng/mLのphorbol myristate acetateと1µg/mLのionomycin
を添加し、S. thermophilus ST28（1×107cells/mL）とともに37°Cで4時間培養した。
培養上清を回収後、プレートに付着した細胞にTRIzol1mLを加え、ピペットでこすって細胞を剥
がし、マイクロチューブに回収した。これにクロロホルム200μL加え、20秒間ボルテックスミキ
サーで攪拌し、室温で5 分間静置した。8,800×g、4℃で15分間遠心分離して層分離させた。RNA
層（水層）を新しいエッペンチューブに回収した。等量のイソプロパノールを加えてボルテック
スミキサーで攪拌し、室温で10分間インキュベートした。10分間遠心分離した後、沈殿を残して
上清を慎重に除去した。
75%エタノールを500μL加え、
転倒混和しながら沈殿を洗浄した。2,200×g、
4 ℃で5分間遠心分離した後、沈殿を残して75%エタノールを除去し、total RNAを得た。
2-6. mRNA発現解析
抽出したtotal RNAからのcDNA合成にはhigh-capacity cDNA reverse transcriptionキットを用
いた。PCRチューブにマスターミックス10 μL（10×RT buffer 2.0μL、25×dNTP mix 0.8μL、
10×RT randam primers 2.0 μL、MultiscribeTM reverse transcriptase 1.0μL、RNase inhibitor
1.0μL、
ミリQ水3.2μL）
と100ng/mLに調製したRNA溶液10μLを入れ、サーマルサイクラーにて25℃
10分間、37℃ 120分間、85℃ 5分間でcDNA合成を行った。
リアルタイムPCR反応には、KAPA™ SYBRR® Fast qPCRキットを用いた。8連チューブに、ミリQ
水 10μL、2×KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 12.5μL、Rox High 0.5μL、forwardとreverse
各プライマー（10μM）をそれぞれ0.5μLずつ、テンプレートcDNA（10ng/μL）を1 μL入れ、穏
やかに混和した後、ABI PRISM® 7700 sequence detection systemにて反応を行った。まず95℃で
2分間、酵素の活性化を行った。続いて95℃で3秒の熱変性、60℃で30秒のアニーリングおよび伸
張反応のサイクルを40サイクル繰り返し、目的のDNAを増幅させた。さらに、95℃ 15秒間、60℃ 15
秒間で融解曲線分析を行い、単一のDNAのみが増幅されていることを確認した。使用したプライマ
ーとその配列をTable 1に示した。
発現解析には、比較Ct法（ΔΔCt法）を用い、測定したい目的の遺伝子とハウスキーピング遺
伝子のCt値の差（ΔCt）を比較して、相対定量した。
2-7. 腸間膜リンパ節（MLN）の調製とフローサイトメトリー解析
BALB/cマウスを頸椎脱臼により屠殺後、開腹し、腸間膜リンパ節（MLN）を切除した。付着した
脂肪組織を取り除き、培地5mLを予め入れておいたシャーレに移した。MLNを滅菌ナイロンメッシ
- 61 -
ュで挟み、
5mLシリンジのプランジャーの裏側を使って組織を押しつぶし、15mL遠沈管に回収した。
350×g で5分間遠心して上清を除去し、培地で2 回洗浄した。
調製したMLNを2 × 105cells/mLになるように5% FBS-HBSSに懸濁した。適量のfluorescein
isothiocyanate（FITC）-抗マウスCD11c抗体およびFITC-Armenian hamster IgGを細胞懸濁液に加
え、4℃暗所で30分間インキュベートした。細胞を5% FBS-HBSSで2回洗浄した後、300µLの5%
FBS-HBSSに懸濁した。蛍光強度はGuava Easycyte 6HT/2L flow cytometry systemを使用して測定
した。
2-8. 統計処理
結果はすべて平均値±標準偏差で表した。平均値の比較にはTukey-Kramer法を用い、p値が0.05
未満の場合、統計的に有意とした。
３．結果および考察
3-1. 正常マウス脾細胞におけるS. thermophilus ST28のサイトカインバランス調節効果（Table
2）
脾細胞をTGF-β+IL-6で刺激した結果、
（―）のカラムにある通り、IL-17産生が顕著に亢進した。
この時、検討したその他のサイトカイン、即ちIFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70),
TNF-α, GM-CSFの変化はほとんど見られなかった。従って、TGF-β+IL-6刺激が特異的にIL-17産
生のみを誘導し、Th17-skewed conditionとなったことが明らかとなった。
この培養液にS. thermophilus ST28を加えると、IL-17産生はほとんどコントロールレベルにま
で大きく低下した。従って、本アッセイ系においてS. thermophilus ST28がIL-17産生抑制能を有
することが明らかとなった。比較のために、S. thermophilus のtype strainである ATCC 19258 株
でも同様の検討を行ったが、IL-17産生抑制能はST28株の方が強かった。
ATCC株と比較すると、ST28株はIL-10を高産生し、IL-12をあまり誘導しなかった。抗炎症活性
の評価には、しばしばIL-10/IL-12比が検討され、IL-10高産生なほど、即ちIL-10/IL-12比が高い
ほど炎症抑制活性が高いとされることもある。この点で、IL-10高産生なST28株の方が強く制御性
T細胞を誘導し、Th17をより強く抑制した可能性が考えられた。
3-2. デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導性大腸炎モデルマウスの症状変化（Figure 1）
DSS誘導性大腸炎モデルは、最も広く用いられている炎症性腸疾患の動物モデルの一つである。
DSSが腸炎を誘導するメカニズムは、マクロファージの活性化、腸管上皮への障害、大腸細菌叢の
変化などが考えられている。
DSS処理により急性大腸炎を誘導した結果、体重減少および大腸の萎縮が確認された。これらの
減少は腸炎重症度の指標として用いられる。また、所見観察では、3日目からDSS群の2匹で下痢を
引き起こし、肛門周辺部が紅く腫れていた。このことから、DSS群では大腸炎が発症していること
が確認された。
体重変化はDSS群で減少していたが、S. thermophilus ST28投与群した場合、若干の回復傾向が
見られた（データ省略）
。また、大腸萎縮もDSS群と比較して、S. thermophilus ST28投与群では
- 62 -
抑制されていた（Figure 1B）
。これは、大腸においてS. thermophilus ST28が大腸炎の発症を抑
制したことを意味している。
なお、本試験ではS. thermophilus ST28生菌ではなく、加熱死菌を用いた。従って、本試験で
見られた大腸炎抑制効果は、S. thermophilus ST28が腸内で増殖し腸内細菌叢を直接的に変化さ
せた結果ではないこと、炎症抑制効果はS. thermophilus ST28の菌体成分によることが示唆され
た。
3-3. 大腸炎マウス脾細胞におけるS. thermophilus ST28の炎症抑制効果（Figure 2）
次に、炎症時の脾細胞からのサイトカイン産生を検証した。脾細胞に対して、サイトカイン産
生を促す刺激（例えばTGF-β+IL-6）を行っていなかったことから、DSS群でも比較的IL-17産生は
低かった。しかし、ST28投与によってDSS群の脾細胞からのIL-17産生を有意に抑制していること
が証明された。これは、Table 2（in vitro）試験でST28がIL-17産生を抑制したことと一致した。
その他のサイトカイン、即ちIFN-γ (Th1), IL-4 (Th2), IL-10 (Treg) には大きな変化が認めら
れなかった。
3-4. 大腸炎マウスLPLにおけるS. thermophilus ST28の炎症抑制効果（Figure 3）
炎症が起こっている腸管でのIL-17抑制を直接評価するため、real-time PCRによって大腸から
単離したLPLにおけるTh17関連の遺伝子、IL-17およびROR-γtのmRNA発現変化を検証した。DSS群
のLPLでは両者の発現がともに大幅に増加していたが、ST28投与群は著しくこれらの発現を抑制し
た。このことから、ST28がLPLにおいて、ナイーブT細胞からTh17細胞への分化を抑制したことが
示唆された。さらにLPLにおけるCD11c⁺細胞発現も抑制していたことから、次に樹状細胞の解析を
することとした。
3-5. 大腸炎マウスMLNにおけるS. thermophilus ST28の炎症抑制効果（Figure 4）
MLNは炎症応答により活性化した粘膜固有層における免疫細胞の輸送経路として知られている。
また、炎症時には粘膜固有層だけではなく、他の器官からも細胞が流入してくると考えられてい
る。そこで、MLNにおけるCD11c⁺樹状細胞の割合をフローサイトメーターにより検討した。
その結果、ST28の経口投与によってCD11c⁺細胞が減少したことから、炎症による樹状細胞の活
性化を抑制することが示唆された。ヒト潰瘍性大腸炎およびDSS誘導性大腸炎マウスのMLNにおい
てCD11c⁺樹状細胞の割合が増加することが知られていることからも（Cruickshank et al.,2005）5)、
ST28はIBDの症状軽減に役立つことが期待される。
3-6. 要約と今後の課題
S. thermophilus ST28の経口投与による炎症抑制効果を、DSS誘導性大腸炎マウスを用いて評価
した。S. thermophilus ST28の経口投与は、
DSS誘導性大腸炎マウスの脾細胞において、大幅にIL-17
産生を減少させた。さらに、S. thermophilus ST28はLPLにおけるRORγtのmRNA発現を抑制した。
このことから、S. thermophilus ST28は炎症が起こっている腸でTh17細胞応答を抑えることが示
- 63 -
された。同時に、DSS処理したマウスのMLNではCD11c⁺細胞数の割合が上昇していた。これはDSS
誘導性大腸炎の特徴でもあるが、ST28の経口投与によってCD11c⁺細胞は減少した。これらの結果
より、ST28の摂取は炎症性腸疾患のようなTh17疾患の治療に役立つことが示唆された。
今後、ST28をはじめとする乳酸菌・ビフィズス菌によるTh17抑制作用をより詳細に検討するこ
とが望まれる。
文献
1
Acosta-Rodriguez E. V., Rivino L., Geginat J., Jarrossay D., Gattorno M., Lanzavecchia
A., Sallusto F., Napolitani G., Surface phenotype and antigenic specificity of human
interleukin 17-producing T helper memory cells., Nat. Immunol., 8: 639-646 (2007)
2
Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B., Parente
E., Fili L., Ferri S., Frosali F., Giudici F., Romagnani P., Parronchi P., Tonelli F.,
Maggi E., Romagnani S., Phenotypic and functional features of human Th17 cells., J.
Exp. Med., 204: 1849-1861 (2007)
3
Bettelli E., Carrier Y., Gao W., Korn T., Strom T. B., Oukka M., Weiner H. L., Kuchroo
V. K., Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17
and regulatory T cells., Nature, 441: 235-238 (2006)
4
Chen Y., Kuchroo V. K., Inobe J., Hafler D. A., Weiner H. L., Regulatory T cell clones
induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalitis., Science, 265:
1237-1240 (1994)
5
Cruickshank S. M, English N. R., Felsburg P. J., Carding S. R., Characterization of
colonic dendritic cells in normal and colitic mice, World J. Gastroenterol., 11:
6338-6347 (2005)
6
Cua D. J., Sherlock J., Chen Y., Murphy C. A., Joyce B., Seymour B., Lucian L., Kwan
S., Churakova T., Zurawski S., Wiekowski M., Lira S. A., Gorman D., Kastelein R. A.,
Sedgwick J. D., Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for
autoimmune inflammation of the brain., Nature, 421: 744-748 (2003)
7
Ferber I. A., Brocke S., Taylor-Edwards C., Ridgway W., Dinisco C., Steinman L., Dalton
D., Fathman C. G., Mice with a disrupted IFN-gamma gene are susceptible to the induction
of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)., J. Immunol., 156: 5-7 (1996)
8
Gately M. K., Renzetti L. M., Magram J., Stern A. S., Adorini L., Gubler U., Presky
D. H., The interleukin-12/interleukin-12-receptor system: role in normal and
pathologic immune responses., Annu. Rev. Immunol., 16: 495-521 (1998)
9
Groux H., O'Garra A., Bigler M., Rouleau M., Antonenko S., de Vries J. E., Roncarolo
M. G., A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents
colitis., Nature, 389: 737-742 (1997)
10
Infante-Duarte C., Horton H. F., Byrne M. C., Kamradt T., Microbial lipopeptides induce
the production of IL-17 in Th cells., J. Immunol., 165: 6107-6115 (2000)
- 64 -
11
Ivanov I. I., Atarashi K., Manel N., Brodie E. L., Shima T., Karaoz U., Wei D., Goldfarb
K. C., Santee C. A., Lynch S. V., Tanoue T., Imaoka A., Itoh K., Takeda K., Umesaki
Y., Honda K., Littman D. R., Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous
bacteria., Cell, 139: 485-498 (2009)
12
Langrish C. L., Chen Y., Blumenschein W. M., Mattson J., Basham B., Sedgwick J. D.,
McClanahan T., Kastelein R. A., Cua D. J., IL-23 drives a pathogenic T cell population
that induces autoimmune inflammation., J. Exp. Med., 201: 233-240 (2005)
13
Mangan P. R., Harrington L. E., O’Quinn D. B., Helms W. S., Bullard D. C., Elson C.
O., Hatton R. D., Wahl S. M., Schoeb T. R., Weaver C. T., Transforming growth factor-beta
induces development of the T(H)17 lineage., Nature, 441: 231-234 (2006)
14 Matthys P., Vermeire K., Mitera T., Heremans H., Huang S., Billiau A., Anti-IL-12
antibody prevents the development and progression of collagen-induced arthritis in
IFN-gamma receptor-deficient mice., Eur. J. Immunol., 28: 2143-2151 (1998)
15
Mesquita D. Jr., Cruvinel W. M., Câmara N. O., Kállas E. G., Andrade L. E., Autoimmune
diseases in the TH17 era., Braz. J. Med. Biol. Res., 42: 476-486 (2009)
16 Mosmann T. R., Cherwinski H., Bond M. W., Giedlin M. A., Coffman R. L., Two types of
murine helper T cell clone. I. Definition according to proteins., J. Immunol., 136:
2348-2357 (1986)
17
Murphy K. M., Ouyang W., Farrar J. D., Yang J., Ranganath S., Asnagli H., Afkarian M.,
Murphy T. L., Signaling and transcription in T helper development., Annu. Rev. Immunol.,
18: 451-494 (2000)
18
Murphy K. M., Reiner S. L., The lineage decisions of helper T cells., Nat. Rev. Immunol.,
2: 933-944 (2002)
19 Oboki K., Ohno T., Saito H., Nakae S., Th17 and allergy., Allergol. Int., 57: 121-134
(2008)
20 Romagnani S., Human TH1 and TH2 subsets: doubt no more., Immunol. Today, 12: 256-257
(1991)
21
Tanabe S., Kinuta Y., Saito Y., Bifidobacterium infantis suppresses proinflammatory
interleukin-17 production in murine splenocytes and dextran sodium sulfate-induced
intestinal inflammation., Int. J. Mol. Med., 22: 181-185 (2008)
- 65 -
A: Experimental design
day
Balb/c
3.5% DSS
♀ 6 weeks 0
1
2
3
4
5
Oral administration of S. thermophilus ST28
(107 cfu/day/mouse)
B: Colon length on day 5
Control
DSS
DSS+ST28
1 cm
Fig. 1. マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）腸炎に対する S. thermophilus ST28 の効果
(A) 実験プロトコール
(B) DSS 腸炎マウスの腸長に対する S. thermophilus ST28 の効果
A: IFN-γ
70
Cytokine (pg/ml)
60
B: IL-4
30
12
300
20
10
250
8
200
6
150
4
100
2
50
0
0
15
10
20
10
0
D: IL-17
25
50
40
C: IL-10
5
0
Control
DSS
*
DSS+S. thermophilus ST28
Fig. 2. DSS 腸炎マウスの脾細胞からのサイトカイン産生に対する S. thermophilus ST28 の効果
健常マウス、DSS 腸炎マウスおよび ST28 を投与した DSS 腸炎マウス（各 n=4）の脾細胞を、抗 CD3 お
よび CD28 抗体の存在下で培養し、上清中の IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) および IL-17 (D)濃度を測
定した。
*, p < 0.05.
- 66 -
Relative expression
A: IL-17
B: ROR-γt
C: CD11c
50
50
50
40
40
40
30
30
30
20
20
20
10
10
10
0
0
0
DSS
Control
DSS+S. thermophilus ST28
Fig. 3. DSS 腸炎マウスの粘膜固有層における IL-17 (A)、ROR-γt (B)および CD11c mRNA 発現に対
する S. thermophilus ST28 の効果
健常マウス、DSS 腸炎マウスおよび ST28 を投与した DSS 腸炎マウス（各 n=4）の粘膜固有層
から RNA を単離し、mRNA 発現をリアルタイム PCR にて検討した。解析には ∆∆Ct 法を用い、
10
DSS-induced colitis mouse
ST28-administrated mouse
10,000
8.4±3.4 %
0
5,000
0
101
102
103
104
10
4.9±3.6 %
5,000
10,000
5,000
1.4±0.8 %
0
Side Scatter (SSC-HLin)
Control mouse
10,000
健常マウスとの変化率で表した。
101
102
103
104
10
101
102
103
104
FITC-CD11c
Fig. 4. DSS 腸炎マウスの腸管間リンパ節中 CD11c 陽性樹状細胞割合に対する S. thermophilus
ST28 の効果
フローサイトメトリーにより、健常マウス、DSS腸炎マウスおよびST28を投与したDSS腸炎マ
ウスの腸管間リンパ節中CD11c 陽性細胞割合を解析した。フローサイトメトリーデータは、各群
４匹のうちの代表例を示した。図中の数値は、CD11c 陽性細胞割合（平均±標準誤差）を示した。
- 67 -
Table1
本実験で用いたプライマーの配列
Table 2. Th17誘導したマウス脾細胞培養液にS. thermophilus ST28 あるいは S. thermophilus
ATCC 19258 を添加した時のサイトカイン産生パターンの変化
- 68 -

Download Report