熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
テルミサルタンのもつ選択的peroxisome proliferatoractivated receptor-γ作用の2型糖尿病マウスにおける
血管障害への有効性
Author(s)
外山, 研介
Citation
Issue date
2013-03-25
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/28555
Right
学位論文
Doctoral Thesis
テルミサルタンのもつ選択的 peroxisome proliferator-activated receptor-γ 作用の
2 型糖尿病マウスにおける血管障害への有効性
(Beneficial effect of selective peroxisome proliferator-activated receptor-γ activity
of Telmisartan on vascular injury in type 2 diabetic mice)
外山研介
Kensuke Toyama
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻生体機能薬理学
指導教員
光山
勝慶教授
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻生体機能薬理学
２０１３年３月
学
位
論
文
Doctoral Thesis
論文題名
：テルミサルタンのもつ選択的 peroxisome proliferator-activated receptor-γ 作用の
2 型糖尿病マウスにおける血管障害への有効性
(Beneficial effect of selective peroxisome proliferator-activated receptor-γ activity of Telmisartan
on vascular injury in type 2 diabetic mice)
外山研介
Kensuke Toyama
著者名：
指導教員名：
審査委員名
：
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻生体機能薬理学
分子遺伝学担当教授
尾池
雄一
代謝内科学担当教授
荒木
栄一
病態生化学担当教授
山縣
和也
心臓血管外科学担当教授
川筋
道雄
２０１３年３月
光山勝慶
教授
目次
1. 要旨
2
2. 発表論文
3
3. 謝辞
4
4. 略語一覧
5
5. 研究の背景と目的
5-1 ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体と糖代謝の関係
5-2 糖尿病とレニン・アンギオテンシン系の関係
5-3 本研究の目的
6
6. 実験方法
6-1 実験動物
6-2 薬剤
6-3 実験プロトコール
6-4 血圧測定
6-5 血管弛緩反応の評価
6-6 Western blot analysis
6-7 空腹時血糖と血漿インスリン濃度の測定
6-8 統計解析
13
7. 実験結果
7-1 血圧に対する影響
7-2 食餌量、飲水量、尿量に対する影響
7-3 耐糖能に及ぼす影響
7-4 各臓器重量に及ぼす影響
7-5 血管内皮機能の変化
7-6 血管におけるAktとeNOSの変化
7-7 血管におけるPPARγへの影響
7-8 血管におけるNFκB活性化への影響
7-9 血管に対する抗炎症効果について
7-10 冠動脈への影響
16
8. 考察
8-1 研究結果の概要
8-2 PPARγの糖尿病への関与
8-3 テルミサルタンの血管保護効果
8-4 テルミサルタンのPPARγ活性化作用
27
9. 結語
29
10. 参考文献
30
-1-
1. 要旨
【背景】アンギオテンシンII受容体遮断薬(ARB)であるテルミサルタンはAT1受容体を阻害するだけでな
く、選択的peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ)作用を有することが報告されている。しかし、
テルミサルタンのもつ選択的PPARγ作用の糖尿病性血管障害における意義については不明である。我々は
テルミサルタンのもつ選択的PPARγ作用を介した血管保護効果の意義について検討を行った。
【方法】2型糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)を、(1)Vehicle群、(2)テルミサルタン単独群(10mg/kg/day)、
(3)テルミサルタン(10mg/kg/day)+GW9662 (PPARγ antagonist, 10mg/kg/day)併用群、(4)GW9662単独群
(10mg/kg/day)、(5)ロサルタン単独群(10mg/kg/day)に分け、各薬剤を8週間投与し、血管の内皮機能、血管
リモデリング、炎症、eNOS、NFκB活性化(リン酸化IκBα抗体を用いた蛍光免疫染色法による定量化)等に
対する効果について比較検討した。
【結果】非糖尿病のdb/mマウス(コントロール)と比べて、db/dbマウスは内皮依存性血管弛緩反応の障害、
冠動脈壁肥厚、冠動脈周囲のマクロファージ浸潤と線維化が著明であった。テルミサルタンはdb/dbマウ
スの上述の血管障害を有意に改善し、その効果はロサルタンよりも強力であった。コントロールマウスと
比べてdb/dbマウスの血管eNOSリン酸化は著明に低下していたが、テルミサルタンはロサルタンよりもリ
ン酸化を有意に改善した。さらに、コントロールマウスと比べてdb/dbマウスでは大動脈と冠動脈内皮・
中膜でNFκB活性およびTNFαの発現が著明に増加していたが、テルミサルタンはいずれも有意に抑制した
のに対して、ロサルタンは抑制しなかった。上記のテルミサルタンによる効果はいずれもPPARγ antagonist
の同時投与により抑制された。また、db/dbマウスで認められた血管におけるPPARγ発現の減少はテルミ
サルタンで改善されたが、テルミサルタンとGW9662を併用するとその効果は消失した。
【結論】(1)テルミサルタンは 2 型糖尿病による血管内皮機能障害、冠動脈リモデリング、炎症をロサルタ
ンと比べて有意に改善した。(2)テルミサルタンの血管保護作用には、選択的 PPARγ 作用を介する eNOS
活性化と NFκB 活性化抑制が関与している。(3)PPARγ 作用をもつ ARB は、糖尿病による血管障害に対す
る有用な治療薬剤となり得る。
-2-
2. 発表論文
①
関連論文
1.
Kensuke Toyama, Taishi Nakamura, Keiichiro Kataoka, Osamu Yasuda, Masaya Fukuda,
Yoshiko Tokutomi, Yi-Fei Dong, Hisao Ogawa, Shokei Kim-Mitsuyama, Telmisartan
protects against diabetic vascular complications in a mouse model of obesity and type 2
diabetes, partially through peroxisome proliferator activated receptor-γ-dependent activity,
Biochem Biophys Res Commun, 2011, 410: 508-513.
② その他の論文5編
1.
5冊
Kensuke Toyama, Seigo Sugiyama, Hideki Oka, Hitoshi Sumida, Hisao Ogawa, Exercise
therapy correlates with improving renal function through modifying lipid metabo lism in
patients with cardiovascular disease and chronic kidney disease, J Cardiol, 2010, 56:
142-146.
2.
Kensuke Toyama, Seigo Sugiyama, Hideki Oka, Yuri Iwasaki, Hitoshi Sumida, Tomoko
Tanaka, Shinji Tayama, Hideaki Jinnouchi, Kunihiko Matsui, Hisao Ogawa, Rosuvastatin
combined with regular exercise preserves coenzyme Q10 levels associated with a
significant increase in high-density lipoprotein cholesterol in patients with coronary
artery disease, Atherosclerosis, 2011, 217: 158-164.
3.
Kensuke Toyama, Seigo Sugiyama, Hideki Oka, Yuri Iwasaki, Hitoshi Sumida, Tomoko
Tanaka, Shinji Tayama, Hideaki Jinnouchi, Hisao Ogawa, Combination Treatment of
Rosuvastatin or Atorvastatin, with Regular Exercise Improves Arterial Wall Stiffness in
Patients with Coronary Artery Disease, PLoS One, 2012, 7: e41369.
4.
Kensuke Toyama, Hiroshige Yamabe, Takashi Uemura, Yasuhiro Nagayoshi, Kenji
Morihisa, Junjiroh Koyama, Hisanori Kanazawa, Tadashi Hoshiyama, Hisao Ogawa,
Analysis of oxidative stress expressed by urinary level of 8 -hydroxy-2'-deoxyguanosine
and biopyrrin in atrial fibrillation: Effect of sinus rhythm restoration, Int J Cardiol, 2012
(In Press).
5.
Yi-Fei Dong, Keiichiro Kataoka, Kensuke Toyama, Daisuke Sueta, Nobutaka Koibuchi, Eiichiro
Yamamoto, Kenichiro Yata, Hidekazu Tomimoto, Hisao Ogawa, Shokei Kim-Mitsuyama,
Attenuation of Brain Damage and Cognitive Impairment by Direct Renin Inhibition in Mice with
Chronic Cerebral Hypoperfusion, Hypertension, 2011, 58: 635-642.
-3-
3. 謝辞
本研究を行うにあたり、直接ご指導を頂きました光山勝慶教授に深甚なる謝意を表します。
また、本研究の遂行にご支援頂いた小川久雄教授をはじめ、多くの先生方に深く御礼申し上げ
ます。本研究を遂行するにあたりご協力頂いた、生体機能薬理学教室の教官、大学院生、実験技
官、秘書の皆様方にも心より御礼申し上げます。
最後に、陰で研究生活を支えてくれた妻と子どもたちに感謝します。
-4-
4. 略語一覧
ARB
= Angiotensin receptor blocker
eNOS
= Endothelial nitric oxide synthase
HOMA-IR = Homeostasis model assessment of insulin resistance
NFκB
= Nuclear factor kappa B
PPARα
= Peroxisome proliferator activated receptor α
PPARγ
= Peroxisome proliferator activated receptor γ
RAS
= Renin-angiotensin system
SHRSP
= Spontaneously hypertensive stroke prone
NADPH
= Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
TNFα
= Tumor necrosis factor α
-5-
5. 研究の背景と目的
5-1 ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体と糖代謝の関係
核内受容体のひとつであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPARγ）は、グルコース・脂
質代謝に関係する転写促進因子のひとつとして知られている。リガンドが結合し、レチノイドX受容
体(RXR)と二量体を形成したPPARsは、PPARγとコアクチベータ複合体によるヒストンのアセチル化
によるDNA結合のゆるみと、クロマチン再構築によるヌクレオソームのスライドによって凝集した
クロマチン構造を変化させ表れたPPAR応答領域（PPRE）に結合し、転写を開始する（図1）。
図1
（生活習慣とPPARs、ライフサイエンス出版より引用）
-6-
PPARγは、多様な組織で発現しているが特に脂肪細胞、マクロファージでの発現量が多い1,2。PPARγ
の著明な活性化は脂肪細胞分化によって新たに生じた脂肪細胞の増殖とアポトーシスによ
る大型脂肪細胞の減少によりインスリン抵抗性惹起分子（ FFA、TNFα、レジスチン）の発
現・分泌を低下、インスリン感受性ホルモン（アディポネクチン）を増加させてインスリ
ン感受性の低下を改善すると考えられている（図 2）。このため、PPARγ活性化作用を持つピオ
グリタゾンやロシグリタゾンといったチアゾリジン系誘導体は、糖尿病患者のインスリン抵抗性を改
善する治療薬としてよく使用されている。しかし、PPARγ作動薬は単に血糖を下げるのみならず、大
血管障害合併2型糖尿病患者に対するピオグリタゾンの心血管イベント抑制効果を検討した
PROactive試験において心筋梗塞や脳卒中の再発を有意に抑制する効果があることも報告されている。
図2
（生活習慣とPPARs、ライフサイエンス出版より引用・改変）
-7-
In vivoを用いた基礎研究においても(当教室より報告)、脳卒中易発症高血圧(SHRSP)ラットにおい
てPPARγ活性薬であるピオグリタゾンが脳卒中の発症ならびに脳卒中による死亡率を有意に抑制す
ることが報告されている(図3)。これは、ピオグリタゾンがSHRSPラットにおける脳組織・頸動脈で
の酸化ストレス亢進を抑制したことがひとつの機序であると報告している(図4)。つまり、PPARγ活
性化薬は抗酸化ストレス療法としても有用と考えられる3。
図3
図4
アンジオテンシンIIはAT1受容体を介してNADPH Oxidaseを活性化し、酸化ストレスを亢進するた
め、ARBもまた抗酸化ストレス療法として有用である。このため、ピオグリタゾンとARB（カンデ
サルタン）を併用した場合のSHRSPラットにおける血管内皮機能障害への効果について引き続き検証
すると、ARBとPPARγ活性化薬の併用は各単独処方と比べて血管におけるNADPH Oxidase活性抑制
を介した酸化ストレスの抑制による血管弛緩反応の改善効果が認められることが分かった(図5, 6) 4。
図5
図6
-8-
5-2 糖尿病とレニン・アンギオテンシン系の関係
腎臓から放出されたレニンが、肝臓で産生されるアンジオテンシノーゲンを切断してアンジオテ
ンシンIを産出し、さらに肺と血管内皮細胞のACEなどによりアンジオテンシンIが切断される、循環
血中のアンジオテンシンII産生系を循環レニン・アンギオテンシン（RAS）系という（図7）。一方、
脳・心臓・腎臓や血管などで組織特異的に発現調整されているRAS系を組織RAS系とよび、循環RAS
とは独立した調整を行うことが解明されている。
RAS系は高血圧性の臓器障害のみならず、肥満やインスリン抵抗性による臓器障害にも深く関与し
ていることが報告されている
5-7
。これは脂肪細胞で産生されるアンジオテンシノーゲンによるアン
ジオテンシンIIの産生亢進が一因として考えられており、アンジオテンシンIIによるインスリン受容
体(ISR-1)におけるチロシンリン酸化の阻害やISR-1とPI3Kinaseとの結合阻害が、アンジオテンシンII
によるインスリン感受性の低下の原因と考えられている（図8）。
図7
図8
（分子生物学講義中継羊土社出版より引用）
-9-
ARBやACE阻害剤が他の降圧剤と比べて2型糖尿病の新規発症を抑え、インスリン抵抗性を改善す
ることが報告されており8、我が国で日本人高血圧患者を対象としたCASE-J試験のサブ解析でもARB
とCa拮抗剤の糖尿病新規発症率の差は肥満者ほど顕著にあらわれることが報告されている（図9）9。
この点からも、肥満におけるインスリン抵抗性の病態にはRAが重要な役割を演じていることが分か
る。このため、RAS系阻害剤は２型糖尿病を合併した高血圧の降圧治療における第一選択薬として期
待される
10
。
我々はARBとPPARγ活性化薬を併用した場合の効果について、次に2型糖尿病モデルマウスを用い
て検証したところ、SHRSPラットで認められた効果と同じく、ARBとPPARγ活性化薬の併用は各単
独処方と比べて血管におけるNADPH Oxidase活性抑制を介した酸化ストレスの抑制とeNOSリン酸化
低下の改善による血管弛緩反応の改善効果が確認された(図10) 11。
図9
(Ogihara T, et al. Hypertension Research 34: 1295–1301, 2011より引用)
図10
- 10 -
興味深いことに、既に市販されているARBのひとつであるテルミサルタンは、AT1受容体への拮抗
作用に加えこのPPARγ活性化作用を持つことが報告されている
12-15
（図11）。PPARγ活性化作用を持
たない他のARBと比べ、テルミサルタンは、肥満動物モデルにおいてエネルギー消費量の増加をもた
らし、インスリン抵抗性や内臓脂肪の集積、また脂肪肝を改善することなどが報告されている
14,16,17
。
よって、RASの阻害作用に加えてPPARγ活性化作用をもつテルミサルタンは、糖尿病患者における有
効な薬剤であると考えらえる。しかし、PPARγ活性化作用を持たない他のARBと比べ、テルミサルタ
ンの糖尿病性心血管障害への効果は明らかでない点が多い。
図11
（Benson SC, et al.Hypertension 43: 993-1002, 2004より引用）
- 11 -
5-3 本研究の目的
テルミサルタンが、PPARγ活性化作用を持たないARB（ロサルタン）と比べ、糖尿病による心・血
管障害において有効な治療薬剤となり得るのかを検証するため、2型糖尿病発症モデルであるdb/dbマ
ウスを用いて実験を行った。
- 12 -
6. 実験方法
6-1 実験動物
2型糖尿病発症モデルであるC57BL/KsJ db/db雄性マウス(db/dbマウス)とコントロールの
C57BL/KsJ db/mマウス(db/mマウス)を財団法人動物繁殖研究所 (茨城)から購入し、実験中は標準
的飼料 (オリエンタル酵母工業 )と水道水を適宜与えた。実験動物は12時間毎の明暗の照明の調
節が行なわれている部屋で適切な標準の温度・湿度下で飼育・実験を行った。全ての実験操作は、
動物実験に関する施設内ガイドラインに基づいて行った。
6-2 薬剤
テルミサルタンはベーリンガーインゲルハイム社からご提供いただいた。PPARγのアンタゴニストで
あるGW9662とロサルタンは、それぞれSigma-Aldrich社とLKT Laboratories社から購入した。
6-3 実験プロトコール
既に高インスリン抵抗性と高血糖を呈している6週齢のdb/db肥満マウスを、(1)Vehicle群（0.5%カ
ルボキシメチルセルロース）、(2)テルミサルタン単独群 (10mg/kg/day)、(3)テルミサルタン
(10mg/kg/day)とGW9662 (PPARγ antagonist, 10mg/kg/day)併用群、(4)GW9662単独群
(10mg/kg/day)、(5)ロサルタン単独群 (10mg/kg/day)に分け、各薬剤を1日 1回強制的に8週間経口
投与した。実験期間中に食餌量、水分摂取量、血圧、空腹時血糖と血中インスリン濃度を測定した。
8週間の治療後エーテルによる吸入麻酔を行った後、すみやかに血液を採取し、
Phosphate-buffered Saline で潅流後に心臓と胸部大動脈を速やかに摘出し、後述する評価項目
を測定した。採取した血液は、遠心により血漿を分離し、－80℃ で保存した。
6-4 血圧測定
プレスチモグラフィー(BP-98A; Softron Co、東京)とカフを用い、マウス尾動脈で非観血的に測定した。
- 13 -
6-5 血管弛緩反応の評価
血管用のオーガンチャンバーは37℃に保ち、95%O2、5%CO2の混合ガスで飽和させたModified Tyrode
Buffer(pH 7.4; NaCl 121 mM, KCl 5.9 mM, CaCl2 2.5mM, MgCl2 1.2mM, NaH2PO4 1.2mM, NaHCO3
15.5mM, D(+) - Glucose 11.5mM)で満たした。マウスから摘出した胸部大動脈を1.0mm のリングにカットし、
血管内皮を傷付けないようにオーガンチャンバーの張力測定用のフックにセットし、PowerLab
(ADInstrument)で張力を記録した。初期張力を1.0gとし、KCl(50mM)で収縮のコントロールを取った後に、Lフェニレフリン(10-7M)で前収縮させ、その後、AcetylcholineとSodium Nitroprussideの濃度を漸増させながら、
張力を記録し、弛緩物質濃度と血管弛緩の関係を記録した。
6-6 Western blot analysis
心臓・血管の組織を、凍結粉砕し、タンパク質抽出緩衝液を加え、さらに氷上で5 秒間ソニケーションを行
い、遠心分離機で得た上清をタンパク溶液とした。タンパク濃度をBradford 法で測定し、サンプル間の濃度
を一定に調整した後、95℃で熱変性させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った。
SDS-PAGEで分離したタンパクをセミドライ転写装置にてPVDFメンブレンに転写し、以下の一次抗体を用い
てそれぞれのタンパク検出を行った。
anti-phospho-eNOS (BD Transduction Laboratories)
anti-phospho-Akt (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA)
anti-TNFα (abcam, Plc., Cambridge, UK)
anti-PPARγ (Cell Signaling Technology)
anti-PPARα (abcam, Plc., Cambridge, UK)
anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)
適切な二次抗体との反応後、Enhanced Chemiluminescence Methodで発光させ、フィルムに感光すること
でバンドを可視化した。バンドの濃さは画像処理ソフト(ImageJ, NIH)を用いて数値化し、個々のデータとし
た。
- 14 -
6-7 空腹時血糖と血漿インスリン濃度の測定
マウスの尾静脈から血液を採取し、空腹時血糖はグルコース測定キット（WAKO, 大阪）を用いて測定した。
血中のインスリン濃度はELISA kit (Morinaga、東京)を用いて測定した。インスリン抵抗性の指標となる
Homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR)は、以下の計算式を用いて算出した。
HOMA-IR = ［空腹時血糖 (mmol/L) × 血中インスリン濃度 (pmol/L) ]/ 405
6-8 統計解析
データは全て平均値±標準誤差で表記した。多群間の統計値の比較はOne-way ANOVA 後に Tukey’s
testでpost hocを行った。統計ソフトはSPSS statistical software, version 11.0J (SPSS Inc., Chicago, IL,
USA)を用い、P<0.05を以て統計学的有意とした。
- 15 -
7. 実験結果
7-1 血圧に対する影響
db/mマウスと比べてdb/dbマウスでは血圧が有意に上昇していた。投薬期間中、テルミサル
タン群、テルミサルタンとGW9662の併用群、およびロサルタン群では各群同等に血圧が下
がっていたが、GW9662単独投与による血圧への影響は認められなかった (Figure 1)。
Figure 1: 各種薬剤による降圧効果
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te, telmisartan-treated db/db
mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice;G, GW9662-treated db/db mice; Lo,
losartan-treated db/db mice.
Values are means ± SEM (n=7-8)
- 16 -
7-2食餌量、飲水量、尿量に対する影響
db/mマウスと比べて、食餌量・飲水量・尿量はいずれもdb/dbマウスで有意に増加していた
が、各投薬群間で有意な差は認められなかった (Figure 2A‐C)。
Figure 2: 食餌量 (A), 飲水量 (B), and 尿量 (C)
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te, telmisartan-treated db/db
mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice;G, GW9662-treated db/db mice; Lo,
losartan-treated db/db mice.
Values are means ± SEM (n=7-8)
- 17 -
7-3 耐糖能に及ぼす影響
db/dbマウスでは空腹時血糖が高値を示したが、投薬群間で空腹時血糖に有意な差は認めら
れなかった（Figure 3A）。Figure 3Bに示すように、db/dbマウスではインスリン抵抗性を示
すHOMA-IR値が高値を示していた。テルミサルタンはHOMA-IR値を改善させたが、この効
果はGW9662を併用することにより減弱された。一方、ロサルタンにはHOMA-IRを改善する
効果は認められなかった。
(C)
Figure 3: 空腹時血糖 (A) とHOMA-IR (B)と血中インスリン濃度（C）
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te, telmisartan-treated db/db
mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice;G, GW9662-treated db/db mice; Lo,
losartan-treated db/db mice.
Values are means ± SEM (n=7-8)
- 18 -
7-4 各臓器重量に及ぼす影響
db/mマウスと比べて2型糖尿病モデルのdb/dbマウスでは精巣上脂肪、腸管周囲脂肪、皮下
脂肪と腎周囲脂肪量が有意に増加していたが、各薬剤投与群間では差は認められなかった
(Table 1)。
Table 1: 体重と脂肪重量
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te, telmisartan-treated db/db mice;
T+G, combination of telmisartan and GW9662-treated db/db mice; G, GW9662-treated db/db mice; Lo,
losartan-treated db/db mice.
Values are mean ± SEM (n=8). *p < 0.01, compared with Ve.
- 19 -
7-5 血管内皮機能の変化
Figure 4Aに示すように、db/dbマウスのアセチルコリン依存性血管内皮弛緩反応は、db/m
マウスと比べ有意に悪化していた。テルミサルタンは、アセチルコリン濃度3×10-8～
10-5mol/Lの間で血管内皮弛緩反応の悪化を有意に改善した。一方、ロサルタンではアセチル
コリン濃度3×10-6～10-5 mol/Lの範囲でのみ血管内皮弛緩反応の改善が認められた。さらにテ
ルミサルタンにGW9662を併用した場合、テルミサルタンによる血管内皮弛緩反応の改善効
果は有意に抑制された。GW9662単独投与による血管内皮弛緩反応への影響は認められなか
った。なお、ニトロプルシドナトリウムによる内皮非依存性の弛緩反応は各群間において顕
著な差は認められなかった（Figure 4B）。
(B)
Figure 4: アセチルコリン依存性血管内皮弛緩反応(A)、内皮非依存性の弛緩反応(B).
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te, telmisartan-treated db/db
mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice; G, GW9662-treated db/db mice; Lo,
losartan-treated db/db mice.
Values are means ± SEM (n=6-8 for (A) and (B)).
- 20 -
7-6 血管におけるAktとeNOSの変化
db/dbマウスの血管におけるAktとeNOSのリン酸化はdb/mマウスと比べ有意に減少してい
た。テルミサルタン投与群ではAktとeNOSのリン酸化の減少を有意に改善したが、ロサルタ
ン投与群ではその効果は認められなかった。テルミサルタンにGW9662を併用すると、テル
ミサルタン単独投与群で認められたAktとeNOSのリン酸化減少の改善効果は認められなく
なった(Figure 5A, 5B)。
(A)
(B)
Figure 5: 血管におけるphospho-Akt (A) and phospho-eNOS (B)のタンパク発現
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te,
telmisartan-treated db/db mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice; G,
GW9662-treated db/db mice; Lo, losartan-treated db/db mice. Upper panels in (A) and
(B) indicate representative Western blots. The lanes were run on the same gel but were
noncontiguous.
Values are means ± SEM (n=3-4 for (A) and (B))
- 21 -
7-7 血管におけるPPARγへの影響
db/dbマウスの血管におけるPPARγの発現は、対照であるdb/mマウスと比べ有意に減少して
いた。テルミサルタンはdb/dbマウスで減少したPPARγの発現を有意に増加させたが、ロサル
タンにはその効果は認められなかった。テルミサルタンにGW9662を併用すると、テルミサ
ルタン単独によって得られたPPARγの発現増加は認められなくなった(Figure 6A）。なお、血
管におけるPPARαの発現レベルは各群において有意な差は認められなかった(Figure 6B）。
Figure 6: 血管におけるPPARγ (A)とPPARα (B)のタンパク発現
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te,
telmisartan-treated db/db mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice; G,
GW9662-treated db/db mice; Lo, losartan-treated db/db mice. Upper panels in (A) and
(B) indicate representative Western blots. The lanes were run on the same gel but were
noncontiguous.
Values are means ± SEM (n=3-4)
- 22 -
7-8 血管におけるNFκB活性化への影響
リン酸化IκBα抗体を用いた蛍光免疫染色法により血管内皮及び血管中膜におけるNFκBの活性化を
定量化した(Figure 7A-C)。db/dbマウスの血管内皮及び中膜におけるリン酸化IκBα陽性細胞はdb/mマ
ウスに比べ有意に増加していた。テルミサルタンはdb/dbマウスで増加したリン酸化IκBα陽性細胞を
減少させたが、テルミサルタンとGW9662併用群、GW9662単独投与群及びロサルタン投薬群ではそ
の効果は認められなかった。
Figure 7: 血管内皮 (B)および中膜 (C)におけるNFκB活性化への影響
Abbreviations used: db/m, db/m mice; Ve, vehicle-treated db/db mice; Te,
telmisartan-treated db/db mice; Te+G, both telmisartan and GW9662-treated db/db mice; G,
GW9662-treated db/db mice; Lo, losartan-treated db/db mice; DAPI: 4', 6-diamino-2-phenylindole,
p-IκBα: phosphorylated-IκBα, PECAM-1: platelet endothelial cell adhesion molecule-1.
Values are means ± SEM (n=7-8).
- 23 -
7-9 血管に対する抗炎症効果について
Figure 8Aと8Cに示すように、db/dbマウスの血管におけるTNFαの発現と血中TNFα濃度はdb/mマウ
スと比べ有意に増加していたが、テルミサルタン投与群ではこれらの増加が有意に抑制された。一方
テルミサルタンとGW9662の併用群、GW9662単独投与群及びロサルタン投与群では上述の変化は認
められなかった。また、TNFαの変化と同様、血中CRP濃度もdb/mマウスよりdb/dbマウスで上昇して
いたが、テルミサルタンの投与により有意に抑制された。
(A)
(C)
(D)
(B)
Figure 8: 血管におけるTNFα発現 (A)(B)と血中TNFα(C)、血中CRP値 (D)の変化
Abbreviations used are the same as in Figure 1. L: lumen, M: medial layer.
Upper panels in (A) indicate representative Western blots. The lanes were run on the same gel but
were noncontiguous.
(A) Values are mean ± SEM (n=3-4).
(B) Values are mean ± SEM (n=6-8)
- 24 -
7-10 冠動脈への影響
Figure 9A-Cに示すように、db/dbマウスで認められる冠動脈壁肥厚と冠動脈周囲の線維化はテルミ
サルタンにより有意に改善されたが、テルミサルタンとGW9662併用群、GW9662単独群とロサルタ
ン投薬群では改善効果は認められなかった。
対照のdb/mマウスと比べてdb/dbマウスの冠動脈内皮と中膜のそれぞれでリン酸化IκBα陽性細胞の
数が有意に増加していたが、他の投薬群に比べてテルミサルタンのみが有意にリン酸化IκBα陽性細胞
数を抑制していた (Figure 10A, 10B)。
(A)
(B)
(C)
Figure 9: シリウスレッド染色による冠動脈壁肥厚 (A)(B)と冠動脈周囲の線維化(C)の評価
Abbreviations used are the same as in Supplementary Figure I. Values are mean ± SEM (n=7-8)
- 25 -
(A)
(B)
Figure 10: 冠動脈の内皮(A)と中膜(B)におけるphospho-IκBα発現への変化
The arrows indicate both phospho- IκBα-positive and PECAM-1-positive cells. DAPI: 4',
6-diamino-2-phenylindole, p- IκBα: phosphorylated- IκBα, PECAM-1:platelet endothelial cell adhesion
molecule-1, α-SMA: α-smooth muscle actin. Other abbreviations are the same as in Supplementary Figure I.
Values are mean ± SEM (n=7-8)
- 26 -
8. 考察
8-1 本研究の結果の概要
テルミサルタンがAT1受容体を阻害するだけではなく、選択的PPARγ作用を有することはよく知ら
れているが
12-15
、2型糖尿病性の血管障害に対するテルミサルタンのもつPPARγ作用の有効性につい
てはよく知られていない。本試験では、テルミサルタンの持つPPARγ作用が糖尿病性血管障害に対し
保護効果があるのかを検証した。結果、テルミサルタンはロサルタン（PPARγ作用のないARB）より
も糖尿病性血管障害に対して保護的な効果があり、その効果が得られる過程においてPPARγ活性化が
重要な役割を担っていることが分かった。さらに、テルミサルタンはPPARγ活性化を介して糖尿病性
血管障害で認められるPPARγ発現の低下を正常化することが今回新たに示された。テルミサルタンは
糖尿病を合併した高血圧性の血管障害の治療において有効な手段であると考えられる。
8-2 PPARγの糖尿病への関与
PPARγ活性化作用を持つチアゾリヂン誘導体のひとつであるピオグリタゾンの抗動脈硬化作用が
多数の大規模臨床試験において報告されている
18-21
。なかでも、大血管障害合併2型糖尿病患者に対
するピオグリタゾンの心血管イベント抑制効果を検討したPROactive試験において、ピオグリタゾン
が糖尿病性大血管障害の二次予防効果を有し、心筋梗塞や脳卒中の再発を予防することが証明された
ことは記憶に新しい。このピオグリタゾンはグリメピリドと比べ、冠動脈疾患を合併した糖尿病患者
の冠動脈硬化の進展抑制20 や糖尿病患者における頚動脈壁肥厚の進展を抑制
19
することが報告され
ており、他にも抗動脈硬化を検証した基礎研究報告が多数認められる3,22,23。我々の基礎研究において
も、糖尿病発症マウスや高血圧発症ラットで認められる心・血管障害に対しては、カンデサルタン単
独投与よりもカンデサルタンにピオグリタゾンを併用したほうがより強力な心・血管保護効果が認め
られることを報告してきた
4,11
。つまりPPARγ作用のないARBよりも、AT1受容体拮抗作用とPPARγ
作用を併せ持つテルミサルタンは、糖尿病を合併した高血圧患者において有効な薬剤となりえると考
えられ、今回の実験を行うこととなった。
- 27 -
8-3
テルミサルタンの血管保護効果
動脈硬化の進展には、血管内皮機能障害や血管リモデリング進展が重要である
24,25
。今回、テルミ
サルタンは、糖尿病性の血管内皮機能障害と冠動脈リモデリングをロサルタンと比べて顕著に改善し
た。さらに、ロサルタンに対してテルミサルタンは糖尿病性の血管障害で生じたAktとeNOSのリン酸
化の減少を顕著に改善することも分かった。テルミサルタンによる血管内皮機能障害の改善は、この
AktとeNOSの正常化を介した作用によるものと考えられる。さらにロサルタンと比べテルミサルタン
は血管におけるNFκBの活性化を抑制し、またNFκBにより誘導されたと考えられる炎症性サイトカイ
ンであるTNFαの血管における発現をも有意に抑制することが分かった。上述の結果から考えて、テ
ルミサルタンはPPARγ作用をもたないロサルタンと比べて、より強力な抗炎症作用を持つものと考え
られる。上述したテルミサルタンの保護効果は、PPARγアンタゴニストであるGW9662を加えると減
弱されたため、これらの作用はすべてPPARγを介したものと考えられる。
8-4
テルミサルタンのPPARγ活性化作用
注目すべきことに、今回db/dbマウスの心血管組織ではPPARγの発現が減少していることが新たに
分かった（PPARαは変化なし）。そして、テルミサルタンはこの心血管組織におけるPPARγの減少を
有意に改善したが、ロサルタンやテルミサルタンとGW9662の併用群ではこの効果は認められなかっ
た。つまり、テルミサルタンのもつPPARγ活性化作用を介して心血管疾患組織で減少したPPARγタン
パク量が正常化したものと考えられる。糖尿病におけるテルミサルタンの血管保護効果はこの心血管
組織におけるPPARγ減少の正常化によるものと考えられる。
テルミサルタン
PPARγ↑
NFκB↓
PPARγ↑
PPARγ↑
Akt / eNOS リン酸化↑
血管内皮
TNFα↓
血管内皮・中膜
血管内皮機能障害の改善
- 28 -
血管内皮・中膜
9. 結語
今回我々はテルミサルタンが一部持つPPARγ活性化作用が糖尿病マウスにおいて強力な血管保護
効果を持つことを証明した。このメカニズムにはNFκBとTNFαの抑制による抗炎症効果とAkt-eNOS
のリン酸化減少の改善効果が深く関わっていた。さらに、テルミサルタンのPPARγ活性化作用は、心
血管組織において減少したPPARγを正常化することに関係していることが分かった。テルミサルタン
はPPARγ作用のないARBと比べ糖尿病性血管障害を合併した患者において強力な治療戦略のツール
となるものと考えられ、大規模臨床試験を通じた更なる検証が必要である。
- 29 -
10. 参考文献
1.
Hsueh, W.A. & Bruemmer, D. Peroxisome proliferator -activated receptor gamma:
implications for cardiovascular disease. Hypertension 43, 297-305 (2004).
2.
Pascual, G., et al. A SUMOylation-dependent pathway mediates transrepression of
inflammatory response genes by PPAR-gamma. Nature 437, 759-763 (2005).
3.
Nakamura, T., et al. Pioglitazone exerts protective effects against stroke in
stroke-prone spontaneously hypertensive rats, independently of blood pressure.
Stroke 38, 3016-3022 (2007).
4.
Nakamura, T., et al. Beneficial effects of pioglitazone on hypertensive
cardiovascular injury are enhanced by combination with candesartan. Hypertension
51, 296-301 (2008).
5.
Gami, A.S., et al. Metabolic syndrome and risk of incident cardiovascular events
and death: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. J Am Coll
Cardiol 49, 403-414 (2007).
6.
Sowers, J.R., Epstein, M. & Frohlich, E.D. Diabetes, hypertension, and
cardiovascular disease: an update. Hypertension 37, 1053-1059 (2001).
7.
Verdecchia, P., et al. Adverse prognostic significance of new diabetes in treate d
hypertensive subjects. Hypertension 43, 963-969 (2004).
8.
Andraws, R. & Brown, D.L. Effect of inhibition of the renin -angiotensin system on
development of type 2 diabetes mellitus (meta-analysis of randomized trials). Am J
Cardiol 99, 1006-1012 (2007).
9.
Ogihara, T., et al. Long-term effects of candesartan and amlodipine on
cardiovascular morbidity and mortality in Japanese high -risk hypertensive patients:
the Candesartan Antihypertensive Survival Evaluation in Japan Extension Study
(CASE-J Ex). Hypertens Res 34, 1295-1301 (2011).
- 30 -
10.
Mancia, G., et al. 2007 ESH-ESC Practice Guidelines for the Management of
Arterial Hypertension: ESH-ESC Task Force on the Management of Arterial
Hypertension. J Hypertens 25, 1751-1762 (2007).
11.
Fukuda, M., et al. Potentiation by candesartan of protective effects of pioglitazone
against type 2 diabetic cardiovascular and renal complications in obese mice. J
Hypertens 28, 340-352 (2010).
12.
Benson, S.C., et al. Identification of telmisartan as a unique angiotensin II rece ptor
antagonist with selective PPARgamma-modulating activity. Hypertension 43,
993-1002 (2004).
13.
Kurtz, T.W. Beyond the classic angiotensin-receptor-blocker profile. Nat Clin Pract
Cardiovasc Med 5 Suppl 1, S19-26 (2008).
14.
Schupp, M., et al. Molecular characterization of new selective peroxisome
proliferator-activated receptor gamma modulators with angiotensin receptor
blocking activity. Diabetes 54, 3442-3452 (2005).
15.
Schupp, M., Janke, J., Clasen, R., Unger, T. & Kintscher, U. Angiotensin type 1
receptor blockers induce peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activity.
Circulation 109, 2054-2057 (2004).
16.
Sugimoto, K., et al. Telmisartan increases fatty acid oxidation in skeletal muscle
through a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma dependent pathway. J
Hypertens 26, 1209-1215 (2008).
17.
Sugimoto, K., et al. Telmisartan but not valsartan increases caloric expenditure and
protects against weight gain and hepatic steatosis. Hypertension 47, 1003-1009
(2006).
18.
Dormandy, J.A., et al. Secondary prevention of macrovascular events in patients
with type 2 diabetes in the PROactive Study (PROspective pioglitAzone Clinical
Trial In macroVascular Events): a randomised controlled trial. Lancet 366,
1279-1289 (2005).
- 31 -
19.
Mazzone, T., et al. Effect of pioglitazone compared with glimepiride on carotid
intima-media thickness in type 2 diabetes: a randomized trial. JAMA 296,
2572-2581 (2006).
20.
Nissen, S.E., et al. Comparison of pioglitazone vs glimepiride on progression of
coronary atherosclerosis in patients with type 2 diabetes: the PERISCOPE
randomized controlled trial. Jama 299, 1561-1573 (2008).
21.
Wilcox, R., et al. Effects of pioglitazone in patients with type 2 diabetes with or
without previous stroke: results from PROactive (PRO spective pioglitAzone
Clinical Trial In macroVascular Events 04). Stroke 38, 865-873 (2007).
22.
Li, A.C., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands inhibit
development of atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. J Clin Invest 106,
523-531 (2000).
23.
Mehta, J.L., Hu, B., Chen, J. & Li, D. Pioglitazone inhibits LOX -1 expression in
human coronary artery endothelial cells by reducing intracellular superoxide radical
generation. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 2203-2208 (2003).
24.
Forstermann, U. & Munzel, T. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease:
from marvel to menace. Circulation 113, 1708-1714 (2006).
25.
Kim, J.A., Montagnani, M., Koh, K.K. & Quon, M.J. Reciprocal relationships
between insulin resistance and endothelial dysfunction: molecular and
pathophysiological mechanisms. Circulation 113, 1888-1904 (2006).
- 32 -

Download Report