i nnovation Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit と GeneChip® One-Cycle Target Labeling and Control Reagents を用いた単一細胞マイクロアレイ解析法 江角 重行、玉巻 伸章 熊本大学大学院 医学薬学研究部 脳回路構造学 ■ 単一神経細胞のプロファイリング解析の必要性 脳神経系や免疫系のように高度に多様化した細胞集団から Labeling and Control Reagents に よ る 増 幅 を 行 っ て 成り立つ組織においては、近接して存在し形態が似通った ナル強度を比較した（図 2） 。 マイクロアレイ解析を行った場合で、サンプル間のシグ 細胞ですら異なった遺伝子発現パターンを持つことが知ら PrimeScript®による 逆転写と共役した （dC）のtailing れている。中でも哺乳類の中枢神経系組織は、他に類を見 ないほどに多様な細胞により構成され、神経回路が形成さ れ、神経活動が営まれている。多様化した神経回路の成り PrimeScript®による 伸長とTemplate switching 立ちや機能を調べるためには、個々の単一中枢神経系細胞 RT step 42° C、90分 の発現遺伝子プロファイルを調べることが重要である。 これまでにも単一細胞より得た cDNA を増幅して発現遺伝 子プロファイリングを行った例は幾つか報告されている が 1, 2, 3, 4）、それらの報告にある方法のプロセスは難しく、分 1 cycle 子生物学者でも再現性を持って繰り返し実施できず、他分 2∼22 cycles 野の研究者であれば分子生物学者の助けなくして利用でき る技術ではなかった。我々は、他分野の研究者が技術の修 5’ 末端にT7プロモーター 配列を付加するために 10cycleのPCRを行う 練なく短期間で再現性を持って単一細胞発現遺伝子プロファ イリングを行える方法を確立すべく、研究を重ねてきた。 T7プロモーター配列が 付加された Super SMART PCR products 現 在 ま で に 、Clontech 社 の Super SMART™ PCR cDNA ® Synthesis Kit と ア フ ィメトリク ス 社 の GeneChip OneCycle Target Labeling and Control Reagents を組み合わせ て、単一細胞に含まれる mRNA を歪曲が生じないように PCR step 95° C、5秒 65° C、5秒 68° C、6分 mRNA Same sequence DNA 5' PCR Primer II A DNA T7 promoter sequence SMARTTM II A Oligonucleotide 3’ SMARTTM CDS Primer II A PCR サイクルを最小限に抑えて増幅させ、アフィメトリク ® ス社の GeneChip 4 枚程度の実験を行うのに十分な量の 5） biotin 標識が入った cRNA まで増幅することに成功した 。 図 1 Super SMART ™ PCR cDNA Synthesis Kit を用いた mRNA の増幅と T7 プロモーター配列の付加 さらに我々は胎生 18 日∼生後 0 日目（E18-P0）の GAD67- その結果、1 µg の total RNA を初発材料としたサンプルで GFP ノックインマウス 6）の脳室下帯より単一の GFP 陽性細 発現が統計的に有意にあると判断されて Present call が 胞を単離し、単一細胞マイクロアレイ法を用いて GABA 神 付いた遺伝子の約 55 ％に、10 pg から増幅したサンプル 経前駆細胞の発現プロファイルの解析を行った。 においても再び Present call が付き、その 90 ％の遺伝子 の相対的シグナル値が 5 倍以内で再現されることがわかっ ■ 単一細胞マイクロアレイ法の精度 増幅の再現性、信頼度を確かめるため、GABA 神経細胞が た（図 2C-1）。これは、10 万個の細胞から採取した total GFP により蛍光ラベルされている GAD67-GFP ノックイン でき、mRNA の発現量に 10 倍以上の変化があった場合に マウスを使用した。GAD67-GFP ノックインヘテロマウス は 90 ％以上の確率で検出できることを意味している。次 （E18-P0）の脳室下帯より、GFP 陽性細胞をセルソーター により分離して得た 1 µg の total RNA からアフィメトリク に、GABA 神経細胞で実際に発現することがわかっている ス社のプロトコールに従ってマイクロアレイ解析を行った ル強度は 5 倍以内に収まっていた（図 2C-2）。これらの遺 場 合 と、同 total RNA を 10 万 倍 希 釈し 、単 一 細 胞レ ベ 伝子ごとのシグナル値は、実際に細胞内での相対的発現 ルの total RNA 量と考えられる 10 pg から Super SMART™ 量を示していると考えられる。最後に、希釈したサンプル キット（図 1）とアフィメトリクス社の One-Cycle Target 間でのばらつきと再現性を調べるため、別々に増幅したサ 32 ● BIO VIEW No.56 RNA で確認された発現遺伝子の 55 ％が単一細胞でも確認 遺伝子のシグナル強度をプロットしたところ、そのシグナ i nnovation ンプル間でシグナル強度の比較を行ったところ、85 ％以 ■ 大脳皮質 GABA 神経前駆細胞の単一細胞マイクロ 上の遺伝子が 5 倍以内で再現されることから、高い再現性 アレイ解析 上記の方法を用いて、GAD67-GFP ノックインへテロマウ で増幅が行われていることがわかった（図 2D） 。 ス（E18-P0）の大脳皮質の脳室下帯から分離した GFP （A）開発した単一細胞マイクロアレイ法の増幅効率を評価するための 実験デザイン 陽性細胞の、単一神経細胞マイクロアレイ解析を行った。 実験のフローチャートを図 3 に示す。まず、胎生 18 日∼ 860,000 細胞のGAD67 陽性細胞から 1μgのtotal RNAを抽出 生後 0 日目の大脳皮質から脳室下帯を切り出し、トリプシ ンを用いて組織を dissociate した。バラバラになった細胞 1μgのtotal RNAを10万倍希釈する を蛍光倒立顕微鏡下で観察し GFP 陽性細胞をピック アップしてチューブに移し、Super SMART™キットを Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kitを用いた増幅 T7 RNA ポリメラーゼによる biotinラベル 用いて逆転写を行った（図 1）後、スピンカラムで cDNA を精製し、引き続いて PCR 反応を 22 サイクル行った。 T7 RNA ポリメラーゼによる biotinラベル 次に、T 7 プロモーター配列を含むプライマーをサンプル に加え、10 サイクルの PCR を行った（このサンプルを以 降 Super SMART PCR Products と呼ぶ）。単一細胞を由 マイクロアレイ解析 来とする Super SMART PCR Products の一部をテンプ レートとして、β-actin（ハウスキーピング遺伝子） 、β III40 320 240 10 tubulin（初期の神経細胞マーカー） 、GAD67（GABA 神経細 胞のマーカー）を PCR で確認し、増幅が認められたサンプ ソートした細胞 160 320 ルのみを次の工程に進めた。選別された Super SMART 80 PCR Products をカラム精製し、アフィメトリクス社の 0 0 80 160 240 40 （B）実験に用いた細胞群 0 10 1 10 2 10 野生型マウス 0 10 1 10 ® 2 GeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagents GAD67＋/−マウス を用いて biotin ラベルされた cRNA とし、マイクロアレイ にハイブリダイズさせた後、計測・解析を行った。このよ C-1 100000 10 pgのtotal RNAを増幅した サンプルのシグナル値 10 pgのtotal RNAを増幅した サンプルのシグナル値 （C）シグナル強度の比較 100000 どちらもPresent call（55.2％） 一方のみPresent call 10000 どちらもAbsent call 10000 1000 1000 100 100 10 10 10倍 1 0.1 0.01 1 5倍 R2=0.48 0.1 1 10 100 0.1 1000 10000 100000 C-2 100000 100000 10000 10000 1000 1000 100 100 1 μgの total RNA 由来のシグナル値 10 5倍 0.1 0.01 1 R2=0.84 0.1 とがないという利点がある。 10 10倍 1 うな工程を経ることは、高価なアレイを無駄に使用するこ 1 10 100 脳室下帯の切り出し 生後0日目のGAD67＋/−マウス の大脳皮質から脳室下帯を切り出す 0.1 1000 10000 100000 1 μgの total RNA 由来のシグナル値 1μgのtotal RNAをそのままT7 RNA amplificationを行って解析 したサンプル（横軸）と10万倍希釈してSuper SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kitで増幅したサンプル（縦軸）とのシグナル強度をプロット （C-1）し、さらに、GABA神経細胞に発現している遺伝子のシグナル 強度をマーキングした（C-2）。 組織をdissociateする 細胞のピックアップ GFP陽性の単一細胞の ピックアップ （D）別々に増幅を行ったサンプル間で検出されたシグナル強度を比較 100000 10 pgの total RNAを増幅した サンプルのシグナル値（＃１） 100000 どちらもPresent call 一方のみPresent call どちらもAbsent call 10000 10000 1000 1000 100 100 10 10倍 ClontechのSuper SMARTTM cDNA PCR Synthesis Kitを 用いた逆転写反応と PCRによる増幅とT7配列の付加 PCR detection 10 β-actin 5倍 1 1 2 R =0.85 0.1 0.1 1 10 100 1000 10000 0.1 100000 β-actin､ βIII-tubulin､ GAD67 遺伝子をPCRにより検出する βIII-tubulin GAD67 10 pgの total RNA を増幅したサンプルのシグナル値（＃2） 図 2 単一細胞マイクロアレイ法の増幅効率の評価 我々の開発した方法では PCR による増幅後にも約 55 ％の遺伝子の発現を確 認することができ、その 90 ％の相対的発現量が 5 倍以内で再現されることが わかった。これは、単一細胞の発現遺伝子の 55 ％を確認でき、発現量に 10 倍 以上の変化があった場合には、90 ％以上の確率で検出できることを意味して いる。 アフィメトリクス社T7 RNA ポリメラーゼによるbiotinラベル Microarray analysis マイクロアレイ解析 図 3 単一細胞マイクロアレイ解析のフローチャート BIO VIEW No.56 ● 33 i nnovation この実験系を用いて行った、GABA 神経前駆細胞を用 ■ 単一細胞マイクロアレイ解析の結果とリアルタイム いた単一細胞マイクロアレイ解析の結果を示したのが図 4 である。解析した 8 つの細胞において、それぞれの細胞 PCR 解析の結果は一致する 本解析では、単一細胞マイクロアレイ解析を行った全て ごとに異なった発現プロファイリングを得ることができ のサンプルでβ-actin、β III-tubulin、GAD67 の発現を PCR た。また、個々の細胞において成熟した GABA ニューロン により確認しているが、図 4（A）の GAD67 の解析結果に 7） に特徴的な遺伝子 を発現していることが確認できたが、 注目すると、8 細胞のうち 3 細胞でしか GAD67 遺伝子に 成熟したグルタミン酸ニューロンに特徴的な遺伝子の発 おいて Present call は得られず、結果に矛盾が生じた。そ 7） 現 はほとんど確認できなかった。一方、ハウスキーピン こ で 、マ イ ク ロ アレ イ の シ グ ナ ル 値 と Super SMART グ遺伝子の発現は全ての細胞において確認することがで PCR Products に含まれるコピー数を調べるためにリアル きた。また、# 8 細胞での NPY や、# 5 と # 6 細胞で Reelin （Reln）といった GABA ニューロンのサブタイプに特徴的 タイム PCR を用いてコピー数を定量した（図 5）。その結 果、Present call が得られた # 4、# 5、# 8 のサンプルでは 1 µl な発現が確認できた。これらの結果から、取得した単一神 あたり 1 × 105 コピー以上の GAD67 の cDNA が含まれて 経細胞発現プロファイリングは解析した細胞の性質を反 おり、Absent call が付いた他のサンプルでも少なくとも、 映したものであると考えることができる。 50 コピー以上の cDNA が含まれていることがわかった。 (A) Genes expressed in GABAergic neurons Gad1/GAD67 Gad2 Dlx1 Dlx2 Dlx3 Dlx4 Dlx5 Dlx6 Arx Sox2 Col19a1 Slc6a1 Slc32a1 Ptprm Calb1 Calb2 Vip Cck Sst Pvalb Npy Nos1 Rein #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Reelin（Reln）の場合は # 5、# 6、# 8 で cDNA が検出された が、1 µl あたり 1 × 107 コピー以上のコピーがあった # 5、 # 6 では Present call が付いたが、80 コピーであった # 8 の サンプルは Absent call が付いた。一方、全てのサンプル において Present call であったβ-actin では、全て 1 × 103 以上の cDNA を検出することができた。このことから、 単 一 細 胞 マ イ ク ロ アレ イ 解 析 の シ グ ナ ル 値 と S u p e r SMART PCR Products に含まれるコピー数は相対的に一 致していることがわかった。さらに、これまでに Present call が示された遺伝子の発現を single-cell RT-PCR や免疫 組織化学法で調べてみたところ、いずれかの方法で全て検 出できたという経験から、false negative は頻発するが false positive は起きないことが示唆されている。false positive が起きないことは、実験方法として非常に重要で High signal intensity (B) Genes expressed in Glutamatergic neurons Plxnd1 Nfe213 Tcrb-V13 Col5a1 Diap3 Pdlim1 Adcyap1 Npnt Alox12b Dcn Ptprc Crym Neurod Ndrg Zfp312 Tyro3 Krtap121 Thy1 lfi203 Cdh9 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 ある。 単一細胞由来のSuper SMART PCR Products 1μlあたりのコピー数 Low signal intensity A 1×107 1×106 1×105 1×104 1×103 1×102 1×101 1 Absolute call #8 B (C) House keeping genes GAD67 reelin β-actin AAP AAP AAP PAP PPP APP AAP PAP #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Actb Tubba #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 β-actin A: GABA 神経細胞に特徴的な遺伝子群における単一細胞マイクロ アレイ解析の結果。 B: グルタミン酸神経細胞に特徴的な遺伝子群における単一細胞マ イクロアレイ解析の結果。 C: ハウスキーピング遺伝子における単一神経細胞マイクロアレイ 解析の結果。 GAD67 A、B、C共に、シグナル強度の黒い囲みは Present call が付いたことを示す。 reelin 図 4 GABA 神経前駆細胞を用いた単一神経細胞マイクロアレイ 解析結果 A: 単一細胞由来のSuper SMART PCR Products 1μlあたりの コピー数。 PはPresent call、AはAbsent callを示す。 B: リアルタイムPCR産物の電気泳動の結果 図 5 リアルタイム PCR による Super SMART PCR Products のコピー数の定量 34 ● BIO VIEW No.56 i nnovation ■ おわりに 近年、幾つかのグループから単一細胞レベルのマイクロ アレイ解析によって、多様化した神経細胞の性質を探ろう とした研究が報告されている 5, 8, 9, 10）。我々の確立した単一 細胞マイクロアレイ法は簡便ではあるが、精度において は今までに報告のあった手法と比べても劣らない単一細 ■ 本稿でご使用いただいた製品 ・Super SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit 製品コード 635000 7 回 ¥190,000 ® ・PrimeScript Reverse Transcriptase 製品コード 2680A 10,000 U 製品コード 639201 100 回 胞のプロファイリングを得ることができている。この方法 または は、今後、これまでは見つけることができなかった現象や ・Advantage 2 PCR Kit メカニズムを捉えることができる有効な手段となると考 えている。 ¥28,000 ® ・Advantage 2 Polymerase Mix ¥34,000 ® 製品コード 639207 30 回 ¥19,000 本文中の製品に該当するライセンス確認事項は47 ページをご覧ください。 ⁄2 ¤33 ¤7 ‹0 ‹7 ■ 補足 本稿に用いている Super SMART TM cDNA PCR Synthesis Kit は 7 回分であるが、我々が行った条件検討では、さら に実験回数を増やすことも可能であった。 本プロトコールの詳細については、我々の研究室のホー ムページよりダウンロードできる。 http://www.medic.kumamoto-u.ac.jp/dept/morneuro/ microarray.html 【参考文献】 1） Tietjen, I., Rihel, JM., Cao, Y., Koentges, G., Zakhary, L ., Dulac, C., :Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.（2003） Neuron, 38, 161-175. 2） Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, DT., Zhu, J., Luo, L., Bittner, A., Guo, HQ., Miller, N., Wan, J., Erlander, M.,:Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. （2003）J. Neurosci, 23, 3607-3615. 3） Iscove, NN., Barbara, M., Gu, M., Gibson, M., Modi, C., Winegarden, N., :Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.（ 2002）Nat. Biotechnol., 20（9）, 940-943. 4） Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M.,:Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.（2007）Nat. Protoc., 2, 739-752. 5） Esumi, S., Wu, SX., Yanagawa, Y., Obata, K., Sugimoto, Y., Tamamaki, N.,:Method for single-cell microarray analysis and application to geneexpression profiling of GABAergic neuron progenitors.（ 2008） Neurosci. Res., 60（4）, 439-445. 6） Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T.,:Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.（2003）J. Comp. Neurol., 467, 60-79. 7） Sugino, K., Hempel, CM., Miller, MN., Hattox, AM., Shapiro, P., Wu, C., Huang, ZJ., Nelson, SB.,:Molecular taxonomy of major neuronal classes in the adult mouse forebrain.（2006）Nat. Neurosci., 9, 99-107. 8） Kawaguchi, A., Ikawa, T., Kasukawa, T., Ueda, HR., Kurimoto, K., Saitou, M., Matsuzaki, F.,:Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.（2008）Development., 135（18）, 3113-3124. 9） Trimarchi, JM., Stadler, MB., Roska, B., Billings, N., Sun, B., Bartch, B., Cepko, CL.,:Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. （2007）J. Comp. Neurol., 502, 1047-1065. 10）Gustincich, S., Contini, M., Gariboldi, M., Puopolo, M., Kadota, K., Bono, H., LeMieux, J., Walsh, P., Carninci, P., Hayashizaki, Y., Okazaki, Y., Raviola, E.,:Gene discovery in genetically labeled single dopaminergic neurons of the retina.（2004） Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 101（14）, 5069-5074. BIO VIEW No.56 ● 35
© Copyright 2024 ExpyDoc
