薬物作用研究の媒体としての 生体膜モデル 東京大学 理学系研究科化学専攻 教授 橘 和夫 助教 福沢世傑 大学院生 佐々木啓孝 （現 UC Irvine PD） 理化学研究所ゲノム科学センター 菊池 淳、廣田 洋、横山茂之 膜タンパク質の機能研究 全タンパク質の約1/3 細胞内外のシグナル媒体 （GPCR、イオンチャネルなど） 水溶性タンパク質ほどには構造機能研究が進んでいない 原因 • 脂質中のみで構造と機能を維持する 精製が困難 生体膜モデルへの再構成が必要 生体膜モデルの長所と短所 目的膜タンパク質 精製 再構成 細胞 可溶化状態 夾雑タンパク質 各種機器測定に適した 脂質二重膜環境（生体膜モデル） 小さな集合体サイズ ○ → 溶液NMR分光に適 ミセル ベシクル × 脂質二重膜構造の欠如 → 可溶化状態における膜タンパク質の変性 ○ 脂質二重膜構造を有する → 膜タンパク質再構成後もある程度の機能保持 × 巨大な集合体サイズ（LUV, GUV, MLV） → 溶液NMR分光に不適 × 大きな曲率（SUV） → 再構成状態における膜タンパク質の変性 機能媒体としての生体膜モデルについての研究が重要 バイセル（bicelle）＝脂質二重膜構造をもつミセル（bilayered micelle） DHPC N O O O P O O OO DMPC O 1,2-dihexanoyl-3-sn-phosphatidylcholine N O O P O O O OO O 1,2-dimyristoyl-3-sn-phosphatidylcholine ~ 5 nm ~ 20 nm ○特徴 平面二重膜構造をもつ最小の集合体 ベシクルに比べ均一系の調製が容易 ○利用例 NMRにおける配向媒体 膜タンパク質結晶化媒体 → 膜タンパク質機能解析のための生体膜モデル Tjandra, N.; Bax, A. Science 1997, 278, 1111. Prestegard, J. H.; Kishore, A. I. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 584. Bax, A. Protein Sci. 2003, 12, 1. Faham, S. and Bowie, J. U. J. Mol. Biol. 2002, 316, 1. 生体膜モデルとしてのバイセル バイセルの温度依存的形状変化の詳細な解析 膜作用性ペプチド（メリチン）の作用解析のための媒体 膜タンパク質（バクテリオロドプシン）を用いた再構成系 生体膜モデルとしてのバイセルの評価 バイセルの状態変化 ＜バイセルの調製パラメータ＞ DMPC + DHPC solvent [DMPC] 脂質混合比（モル比）； q = [DHPC] 脂質濃度（g/mL）； c = これまでの測定法 ： SANS, SAXS, NMR, cryo-TEM, etc. 温度依存性大 Nieh, M. -P. et al. Langmuir 2001, 17, 2629. Gaemers, S.; Bax, A. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12343. Nieh, M. -P. et al. Biophys. J. 2002, 82, 2487. Nieh, M. -P. et al. Langmuir 2003, 19, 6936. Wang, H. et al. Phys. Rev. E 2003, 67, 060902. Nieh, M. -P. et al. Langmuir 2004, 20, 7893. Dam, L, V. et al. Biochim. Biophys. Acta 2004, 1664, 241. cryo-TEM（極低温透過型電子顕微鏡） による観察から提唱された形態変化モデル 示差走査型熱量分析（DSC）により温度連続的に状態変化を追跡 DSC ( cal/sec) 発熱 吸熱 DSC (ucal/s) 0.00 0 -50.00 -50 DMPC/DHPCバイセルの相転移 DMPC二重膜の相転移 をもとに解釈すると・・・ 脂質濃度 0.01 g/mL [DMPC]/[DHPC] = 3.0 相転移４ 多孔膜（L ）→ラメラ（L ） -100.00 -100 -150.00 -150 多孔膜（L ） ネットワーク 20.0 40.0 60.0 紐状ミセル TEMP (℃) DSC ( cal/sec2) 時間微分 相転移３ バイセル ΔDSC (ncal/s2) 200.0 200 相転移２ バイセル 100.0 100 相転移１ バイセル 00.0 -100.0 -100 -200.0 -200 5 20.0 20 40.0 TEMP (℃) 40 温度（℃） 60.0 60 結晶相 （LC） ゲル相 （L ’） リップル相 （P ’） 液晶相 （L ） 温度と相転移の関係 温度 （℃） [DMPC] / [DHPC] DMPC/DHPC phase diagram 0.5 1.0 1.5 1.8 2.0 3.0 3.8 4.0 5.0 60.0 ラメラ（L ） 50.0 Temperature(dC) ラメラ（L ） 40.0 多孔膜（L ） 混合ミセル/小バイセル（L ） ネットワーク 紐状ミセル バイセル バイセル バイセル 30.0 20.0 10.0 混合ミセル/小バイセル バイセル 0.0 30 40 50 60 DMPC(mol%) [DMPC] [DMPC] + [DHPC] 70 80 90 × 100 (mol%) Sasaki, R.; Sasaki, H.; Fukuzawa, S.; Kikuchi, J.; Hirota, H.; Tachibana, K. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2007, 80, 1208-1216. Nieh, M.-P.; Raghunathan, V. A.; Wang, H.; Katsaras, J. Langmuir 2003, 19, 6936. Wang, H.; Nieh, M.-P.; Hobbie, E. K.; Glinka, C. J.; Katsaras, J. Phys. Rev. E 2003, 67, 060902. Raffard, G.; Steinbruckner, S.; Arnold, A.; Davis, J. H.; Dufourc, E. J. Langmuir 2000, 16, 7655. バイセルの多孔膜状態ヘの移行 31P NMR DHPC DMPC 温度（T） DHPC SANS （中性子小角散乱） Tm= ~24 ℃ DHPC DMPC 多孔膜状態になると磁場中においてDMPCの配向が揃うことで 化学シフトの異方性が復活し、シグナルが高磁場側にシフトする Nieh, M.-P.; Raghunathan, V. A.; Wang, H.; Katsaras, J. Langmuir 2003, 19, 6936. Wang, H.; Nieh, M.-P.; Hobbie, E. K.; Glinka, C. J.; Katsaras, J. Phys. Rev. E 2003, 67, 060902. DMPC ミツバチ毒メリチンによるバイセルの崩壊 メリチン GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 メリチン添加前 溶血、膜融合活性 メリチン添加後 [メリチン] = 0.55 mM 31P ppm [DMPC] + [DHPC] = 124 (mM) [DMPC] / [DHPC] = 1.8 30 ℃ (> DMPCの主転移温度) バイセルはメリチンによって生体膜やベシクルと同様に その構造が崩壊し、さらにベシクル （P/L = 3.3 mol% まで構造が保たれる） に比べて容易に崩壊が起こった メリチン/DMPC (P/L) = 0.69 mol% 31P ppm 動的光散乱 メリチン添加後 24 h メリチン添加前 （バイセル破壊後） [メリチン] = 1.0 mM （バイセル破壊前） 6 30 多孔膜 5 25 P/L = 1.6 mol% 4 残余 3 バイセル 強度 (%) 強度 (%) メリチンによるバイセル破壊後の膜融合 2 1 0 1 31P 15 10 5 0 10 100 1000 1000 直径 (nm) 直径 (nm) [DMPC] + [DHPC] = 80 mM, 30 ℃ DMPC / DHPC = 3.2 (モル比) 10000 NMR メリチン 添加前 10 20 メリチン 添加後 0.5h 0 [メリチン] = 1.0 mM P/L = 1.3 mol% メリチン 添加後 24h -10 10 0 -10 10 0 Chemical Shift (ppm from ext. H 3PO4 = 0 ppm) [メリチン] = 1.0 mM -10 [DMPC] + [DHPC] = 124 mM, [DMPC] / [DHPC] = 1.8, 30 ℃ メリチンはバイセル破壊後、膜融合活性を発現した Sasaki, H.; Fukuzawa, S.; Kikuchi, J.; Yokoyama, S.; Hirota, H.; Tachibana, K. Langmuir 2003, 19, 9841-9844. 二重膜平面拡大によるバイセルの安定化 [DMPC] + [DHPC] = 80 mM [DMPC] / [DHPC] = 3.4 [DMPC] + [DHPC] = 120 mM [DMPC] / [DHPC] = 1.8 30 ℃ 30 ℃ 0.30 mM 0.48 mM 0.22 mM 0.32 mM 0.15 mM 0.16 mM [メリチン] = 0 mM [メリチン] = 0 mM 10 0 -10 31P ppm 20 nm 10 0 -10 31P ppm 12 nm バイセルの安定性に対するコレステロールの効果 コレステロール非含有 30 ℃ 0.55 mM (0.69 mol%) [DMPC] + [DHPC] = 124 mM [DMPC] / [DHPC] = 1.8 1.6 mM (2.0 mol%) 0.22 mM (0.28 mol%) 1.2 mM (1.5 mol%) 0.11 mM (0.14 mol%) 0.80 mM (1.0 mol%) [メリチン] = 0 mM (P/L = 0 mol%) コレステロール含有 35 ℃ [コレステロール] = 6.7 mol% vs DMPC [メリチン] = 0 mM (P/L = 0 mol%) 31P ppm バイセルにコレステロールを含有させることに よってメリチンに対する安定性が約10倍向上した 31P ppm 膜タンパク質再構成系としてのバイセルの評価 Halobacterium salinalium クロモフォアに レチナールを持つ スクロース密度勾配遠心 紫膜 DHPCにより可溶化（4 ℃, 12 h） 遠心（4 ℃, 1200 x g, 120 min） バクテリオロドプシン (bR) 沈殿 上清 DMPC+コレステロール バクテリオロドプシン再構成バイセル 多孔膜形成時のバクテリオロドプシンの状態変化 2.5 22 ℃ (バイセル中) 26 ℃ (多孔膜中) 吸光度 2 T DMPCの主転移温度 ~~24 297℃ K 1.5 紫膜中 1 0.5 0 450 [DMPC] + [DHPC] = 110 mM [DMPC] / [DHPC] = 3.3 [bR] = 0.48 mM [コレステロール] = 3.0 mol% vs DMPC 多孔膜状態への移行に伴いバクテリオロドプシ ンが紫膜中に近い性質を有するようになった 490 max 530 570 波長 (nm) 610 552.4 nm (バイセル中) 560 .4 nm (多孔膜中) 559.8 nm (紫膜中 ) 650 まとめ 1 DSCを用いてバイセルの相転移と状態変化の相関を見いだした 2 バイセルはコレステロール添加で約10倍の安定化が実現できる 3 多孔膜状態では結合タンパク質分子が本来の三次元構造をと る バイセルは有用な生体膜モデルである 想定される用途 • 生体膜中での外来分子の挙動に関する 分光学的研究の有用媒体 • 膜結合タンパク質と外来分子の分子認 識に関する構造的解明 • 上記に関し従来なされていたコン ピュータ・モデリングの実験的検証 共同研究者 ○理学系研究科化学専攻天然物化学研究室 佐々木啓孝博士 佐々木亮修士 荒木真由美修士 福沢世傑助教 ○理化学研究所ゲノム科学総合研究センター 菊地淳博士 廣田洋教授 横山茂之教授 ○サントリー生物有機化学研究所 岩下孝博士 科学技術振興機構CREST「分子複合系の構築と機能」 お問い合わせ先 【技術内容について】 東京大学大学院 理学系研究科化学専攻 教授 橘 和夫 電話&FAX： 03-5841-4366 E-mail：[email protected] 【技術移転について】 科学技術振興機構（JST） シーズ展開課 技術移転プランナー 服部 修造 電話：０３－５２１４－７５１９ ＦＡＸ：０３－５２１４－８４５４ E-mail：s2hattor＠ｊｓｔ.ｇｏ.ｊｐ
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