生理的条件下で作用する高温溶解型高分子

生理的条件下で作用する
高温溶解型高分子
バイオマテリアルへの応用を目指した
感温性高分子の設計
九州大学先導物質化学研究所
嶋田直彦丸山厚
1
Stimuli Responsive Polymer : 刺激応答性高分子
応答
刺激
光照射
pH変化
溶媒、塩の添加
温度変化
磁場変化
表面物性変化
力学的変化
相変化
電気化学的変化
化学物質の添
加
力学的負荷
光化学的変化
化学的変化
D. Schmaljohann, Adv. Drug Deliv. Rev.,58, 1655-1670 (2006)
刺激に応答してその物理化学的性質を変化させる高分子
九州大学, 2012
2
温度応答性高分子（相変化）
LCST型高分子
LCST: 下限臨界溶液温度 (Lower Critical Solution Temperature)
加熱
溶媒分子
高分子
冷却
液体（溶解）
沈殿（不溶）
UCST型高分子
UCST: 上限臨界溶液温度 (Upper Critical Solution Temperature)
加熱
冷却
沈殿（不溶）
液体（溶解）
九州大学, 2012
3
温度応答性高分子を使ったバイオテクノロジー
Cell-sheet technology
加熱
CH2 CH
n
C O
NH
冷却
CH
H 3C
CH3
疎水性
PNIPAM
生理的条件下で相転移
LCSTが体温付近(32 ºC)
Polymer shield
親水性
M. Heskins et al.,
J. Macromol. Sci.Chem.,
2, 1968, 1441
M. Nakayama,T.Okano et al. Material Matters (Sigma Aldrich) 5,2010 56-58
N. Yamada; T. Okano et al Makromol. Chem. Rapid Commun. 11,1990, 571-576.
Drug Release
PNIPAM
Heat
Z. Ding, A. S. Hoffman et al.
Nature 411, 2001, 59-62
Y-Z. You, D.Oupicky et al.
Chem Mater. 20, 2008, 3354-3359
九州大学, 2012
4
生理的条件下でUCST型挙動を示す合成高分子
poly(N-acryloylglycinamide)-co-poly(N-acetylacrylamide)
HN
O HN
O
O
O
NH2
Seuring, J.; Agarwal, S.
Macromol. Chem. Phys. 2010, 211, 2109.
poly(N-acryloylasparaginamide)
O
HN
O
NH2
H2 N
O
Glatzel, S.; Laschewsky,A., Luｔ, J.F. Macromolecules 2011, 44, 413
生理的条件下において、水素結合を駆動力にＵＣＳＴ挙動を示すが、相転移温度は体温以下。
九州大学, 2012
5
ウレイド高分子
+
+
Ureido group
poly(allylamine)-co-poly(allylurea)
PAU
九州大学, 2012
6
生理的条件下におけるPAUの相変化
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5) containing blue dye
0 mM NaCl
150 mM NaCl
Heating
NaCl
10 ˚C
10 ˚C
Cooling
Microscopic
observation
50 ˚C
O/N incubation
5mm
Coacervate formation
Two liquid phase
PAUは生理的条件下において、UCST挙動を示した。
九州大学, 2012
7
Transmittance at 500 nm / %
Transmittance at 500 nm / %
ウレイド導入率と主鎖分子量が相分離温度に与える影響
A15K64
100
80
A15K84
60
A15K88
40
A15K90
20
A15K93
0
0
20
40
60
80
100
100
80
A5K91
A15K90
60
A150K91
40
DTp
~ 30˚C
20
0
0
20
Temperature / ºC
[PAU] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) containing 150 mM NaCl
Scanning rate: 1 ˚C / min
40
60
80
100
Temperature / ºC
A15K90
Mw of PAA
Ureido content
(%)
ウレイド基の導入率の上昇にともなって、相分離温度は高くなった。
主鎖ポリアリルアミンが高分子量であるほど、相分離温度は高くなった。九州大学, 2012
8
ウレイド導入率と主鎖分子量が相分離温度に与える影響
70
A150K
60
T p / ºC
50
A15K
体温
PNIPAMのLCST
40
30
A5K
20
10
0
80
82
84
86
88
90
Ureido content / %
92
94
[PAU] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
containing 150 mM NaCl
Scanning rate: 1 ˚C / min
ウレイド基の増加にともなって、 PAUの相分離温度は直線的に上昇した。
生理的条件下において、65 ºCまでの相分離温度をもつPAUを設計可能であった。
九州大学, 2012
9
PAUのUCST挙動の予想メカニズム
Ureido group
+
Amino group
+
+
+
+
+
+
Heating
+
+
+
+
+
+
NaCl
10
10 ˚C
˚C
アミノ基間の静電的反発
Cooling
10
10˚C
˚C
50 ˚C
NaClによる静電的反発の抑制
PAUのUCST挙動はアミノ基も重要な役割を果たしていると考えられる。
塩濃度・種類及び、pHがPAUの相転移挙動に与える影響を調べる。九州大学, 2012
10
水溶液のpHが相分離温度に与える影響
60
50
A15K93
Tp / ºC
40
A15K90
30
A15K88
20
10 mM buffer
containing 150 mM NaCl
A15K84
10
+
+
NH3
0
NH2
6
NH3
7
8
9
10
NH2
pH
Lower pH
Higher pH
アミノ基の脱プロトネーションにより、
カチオン基間の静電反発が抑制され相転移温度が上昇。
九州大学, 2012
11
塩添加の効果
Reducing of the
repulsion by NaCl Chaotropic effect?
60
50
A15K93
Tp / ºC
40
A15K90
30
A15K88
20
A15K84
10
[PAU15K] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
0
0
200
400
600
800
1000
[NaCl] / mM
NaCl濃度の上昇に伴って、相分離温度が上昇したことから、
塩(Clアニオン)の添加によってアミノ基間の静電的反発が抑制されたと考えられる。
九州大学, 2012
12
塩の種類が相分離温度に与える影響
effect of CATION species
60
60
50
50
40
40
30
NaCl
NaNO3
20
NaBr
Tp / ºC
Tp / ºC
effect of ANION species
NaCl
CsCl
NH4Cl
LiCl
30
20
Urea
NaI
10
+
150 mM NaCl
10
GdmCl
0
0
0
200
400
600
800
1000
[Salt] / mM
0
200
400
600
800
1000
[Salt] / mM
[A15K88] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
相分離温度はアニオン種に強く依存していた。
カオトロピック剤であるグアニジン塩酸塩や尿素は濃度依存的に相分離温度
を減少させたことから、PAUのUCST挙動は水素結合によって引き起こされている。
九州大学, 2012
13
置換基の効果（サクシニル化の影響）
A15K87
CH2 CH
Suc-A15K87
Succinylation
CH2 CH
CH2
CH2 CH
CH2
CH2
NH 0.87
C O
NH2
CH2 CH
0.87
NH
C O
NH2
NH2 0.13
CH2
NH
0.13
C O
CH2
CH2
C O
OH
pH 4.5 ~ 8.5
Tp = ~ 24 ˚C
100
100
80
80
pH 9.5
Tp = 30 ˚C
60
T/%
T/%
pH 5.5 ~ 10.5
Tp < 5˚C
40
pH 10.5
Tp = 36 ˚C
20
60
40
pH 5.0
Tp = 8 ˚C
pH 4.5
Tp = 30 ˚C
20
0
0
10
20
30 40 50 60
Temperature / ºC
70
10
20
30 40 50 60
Temperature / ºC
70
10 mM buffer containing 150 mM NaCl
九州大学, 2012
14
R = NH2
= NH(C=O)CH2CH2COOH
hydrogen boding
group
pH and/or salt
responsive
group
PAU derivatives
○生理的条件下においてUCST挙動を発現
○任意の温度のUCSTを設定可能
ウレイド基によるUCST挙動の一般性の確認
バイオマテリアルとしての応用を考え、
生分解性の高分子へのウレイド基の導入を検討
九州大学, 2012
15
生理的条件下におけるPOCのUCST挙動
O
C150K73
Transmittance / %
100
H
N
C30K88
60
C150K84
H
N
CH C
CH2
80
O
1-n
CH2
CH2
CH2
NH2
NH
C
O
NH2
C150K93
20
n
CH2
CH2
C30K93
40
CH C
C150K93
0
Mw of PLO
Citrulline content
(%)
5
10
15
20
25
30
Temperature / ºC
35
40
[POC] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5), 150 mM NaCl
POCも生理的条件下において、UCST型の挙動が示された。
PAUの時と同様、相分離温度の分子量およびウレイド導入率依存性も示された。
九州大学, 2012
16
プロテアーゼによるPOC分解が相分離挙動に与える影響
+
NH3
Proteinase K
+
+
NH3
NH3
Transmittance / %
POC150K93
100
80
60
1h
40
0.5h
0h
20
0
0
10
20
30
40
Temperature / ºC
50
60
POCはプロテアーゼにより分解され、相分離温度が低下したことが示唆された。
九州大学, 2012
17
まとめ
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)
150 mM NaCl
PAU
CH2 CH
CH2
Heating
CH2 CH
CH2
n
NH
1-n
NH2
C O
NH2
Transmittance / %
10 ˚C
Cooling
50 ˚C
O
100
POC
80
60
H
N
CH C
CH2
40
20
0
0
20
40
60
Temperature / ºC
80
O
H
N
n
CH C
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
NH2
C
1-n
O
NH2
ウレイド基が導入されたPAUやPOCは生理的条件下においてUCST挙動を示した。
ウレイド基の導入率、主鎖分子量を変えることで相分離温度を制御できた。
Shimada, N., et al. Biomacromolecules 2011, 12, 3418−3422
九州大学, 2012
18
本技術に関する知的財産権
発明の名称：感温性ポリアミノ酸またはその塩
出願番号：特願2011-118869
出願人
：国立大学法人九州大学
発明者
：嶋田直彦、丸山厚
九州大学, 2012
19
お問い合わせ先
九州大学知的財産本部
技術移転グループ
ＴＥＬ 092－642 －4361
ＦＡＸ 092－642 －4365
e-mail [email protected]
九州大学, 2012

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