Jpn. J. Protozool. Vol. 40, No. 2. (2007) 157 Mini Review 時間を知るミドリゾウリムシ堀口人士茨城大学理学部自然機能科学科〒310-8512 茨城県水戸市文京2-1-1 Paramecium bursaria has circadian clock Hitoshi Horiguchi Faculty of Science, Ibaraki University, 2-1-1 Bunkyo, Mito, Ibaraki 310-8512 はじめに地球上の生物は、体内時計をもつことで時間を知ることが出来る。生物にとって時間を知るということは生活をする上で重要である。体内時計は様々なリズムを生み出すが、中でも最も研究されているのは周期が約24時間の概日リズム（circadian rhythm）である。概日リズム概日リズムは、原核生物～ヒトまで地球上のすべての生物がもっている普遍的な現象と考えられている。概日リズムは、大きく分けて３つの特徴をもつ。１）周期は約24時間。内在する概日時計の働きによって生み出されるリズムの周期はどの生物でも約 24時間であり、周囲の環境（光や温度など）が一定の状態でもそのリズムは継続していく。その継続を自由継続（free-running）といい、その周期を自由継続周期（free-running period）という。 *Corresponding author Tel/Fax: +81-90-9085-7194 E-mail: [email protected] Received: 15 January 2007 ２）同調性を持つ。光や温度といった適切な刺激（同調因子）によって、自身の時計を同調し概日リズムが修正される。例えば、ヒトの場合自由継続周期が約25時間であるが、起床後太陽の光を浴びることでそのリズムの周期を同調し、地球の自転周期である24時間にリズムを修正している。３）温度補償性を持つ。概日リズムの約24時間という周期は、温度に依存しない。単純な生化学反応であれば温度が10℃違えばその反応速度は倍近くになる。しかし、概日リズムの周期は常に一定である。よって、概日リズムの制御は単純な生化学反応によるものではないということがわかる。こうした特長をもつ概日リズムをミドリゾウリムシも持っている。ミドリゾウリムシは、単細胞であるため、光や温度といった外部の刺激を受容し時計本体に伝達する「入力系」、そして時計の本体である「振動体」、時計からのリズムを生理機能として現す「出力系」が一つの細胞内に存在する。多細胞生物ではこれらが独立した場所に存在することを考えれば、ミドリゾウリムシは概日時計の研究をするのに適した材料であるといえる。現在、概日リズムの様々な生物において概日リズムを制御する分子機構が明らかとなっている。はじめ、ショウジョウバエで発見されたper遺伝子は、他の生物でもそのホモログが同定されて、per遺伝子は転写・翻訳後PERタンパクとなり自身の転写を抑制する「負のフィードバックループ」を形成すること原生動物学雑誌第 40 巻第 2 号 2007 年 158 図1. 接合活性リズムリズムはLL条件でも維持される。約２週間でその振幅がなくなるが、一定の暗期で振幅は回復する。が明らかとなった。この遺伝子のフィードバックループは様々な生物で確認されており、時計の中心機構として働いていることがわかっている。ミドリゾウリムシにおいては、まだ時計遺伝子の同定はされていないが、転写・翻訳の阻害剤を添加することでリズムが発現しなくなり、またフィードバックループを形成する上で重要なリン酸化を阻害することでリズムの周期が延長することから、他の生物と同様な機構が存在することが考えられる。ミドリゾウリムシの概日リズムミドリゾウリムシは接合活性リズム、集光性リズム、活動性リズム、負の重力走性リズムなどの概日リズムを示す。他の種のゾウリムシが性的に成熟すると常に接合活性を示すが、ミドリゾウリムシは成熟しても一日の特定の時間しか接合活性を示さない。当研究室では、LD12：12で培養しているので、接合活性はL（明期）の中間でピークを迎える。接合活性率は、３時間ごとに60匹中活性を示す個体が何個体あるかを調べることで得られる。接合活性リズムは、LL（恒明）条件下で約２週間するとリズムは消失し約50％の活性率を示す。そこに９時間の暗期を与えるとリズムが再び現れるようになる。これは、接合活性リズムは集団のリズムをみているためで、細胞個々のリズムは自由継続している。しかし、細胞個々のリズムの位相が脱同調しているために、接合活性が全体の平均となる約50％となったのである。そのため、暗パルスを与え個々の細胞を同調させることで集団のリズムは回復する。この接合活性リズムには二つの生物時計が関係している。一つ目は概日時計、二つ目は発生時計である。接合活性発現には性的な成熟が必要であり、日中の特定の時間が必要となる。概日時計の周期が短い株は成熟までの時間が短く、概日時計の周期が長い株は成熟までの時間が長いといったことから、性的な成熟を計る発生時計と一日の時間を計る概日時計の間に密接なかかわりがあることが考えられる。接合活性とともに、当研究室で実験を行っていたものに集光性リズムがある。集光性リズムは、特殊な容器の上部にスリットを通して光が照射される。光軸に細胞が集ると透過率が減少するので、集光性はその光の透過性の減少率を１時間ごとに調べることで得られる。こちらも接合活性リズム同様にきれいな概日リズムを見ることが出来る。共生クロレラの影響集光性のリズムの研究から、緑色細胞と白色細胞の周期に違いがあることがわかった。白色細胞では LLとDD（恒暗）条件でその周期に違いは現れないのだが、緑色細胞はLL条件でDD条件よりも約2.5時間周期が長くなった。そこで、光合成阻害剤である DCMUで処理し集光性リズムを計ってみると、緑色 Jpn. J. Protozool. Vol. 40, No. 2. (2007) 細胞でも周期の延長は見られなかった。このことから、細胞内にあるクロレラ、特に光合成がミドリゾウリムシの概日リズムに影響を与えているということがわかった。そこで、恒暗条件で大量培養することにより細胞内のクロレラの数を減らした薄緑細胞を作成し、そのリズムを測ってみると、白色細胞と緑色細胞の中間の周期を示した。細胞内の共生クロレラのミドリゾウリムシに与える影響は、そのクロレラ数に依存することが考えられる。白色細胞は、単離された共生クロレラを取り込み再び共生関係を築くという特徴（再感染）をもっているので、ミドリゾウリムシと共生クロレラのリズムの関係を、この再感染実験を用いて調べた。白色細胞と逆位相で培養した緑色細胞から単離された共生クロレラを、白色細胞に再感染させると、そのリズムは約３周期で白色細胞の位相から共生クロレラの位相へとシフトする。共生クロレラの概日時計によって生み出される概日リズム（光合成リズム）が、ミドリゾウリムシの概日時計に作用し、生み出される概日リズムの位相を変化させたと考えられる。この、共生クロレラによるミドリゾウリムシの位相の逆転は、集光性リズムで最初に発見され、その後接合活性リズムでも確認された。また、LLで無周期となる突然変異体に共生クロレラを感染させその後のリズムを調べた実験では、LLでもリズムを示すようになるという結果も得られた。 159 以上のことから、ミドリゾウリムシの概日時計と共生クロレラの概日時計の間には密接な関係があり、その二つが競合した場合は共生クロレラの概日時計が主導的な役割を果たすということがわかった。これは、共生クロレラが与える光合成産物がミドリゾウリムシにとって同調因子として働いているためと考えられている。また今回は取り上げなかったが、恒常条件で無周期となる突然変異が細胞質遺伝を行うことが分かっているので、細胞内小器官であるミトコンドリアなどが作用している可能性も考えられる。さいごにミドリゾウリムシは、細胞内に存在する概日時計によって様々な概日リズムを示す原生動物である。他の多細胞生物と異なり一つの細胞に入力系や出力系、概日時計が存在するため概日時計を研究する上で便利な細胞であり、また細胞内にミドリゾウリムシの細胞と共生クロレラの二つの概日時計を持つ非常に面白い動物である。さらに、共生クロレラは単離培養が可能で容易に再感染を行わせることができるので、細胞内共生機構に関しても研究が盛んに行われている。共生と概日時計という二つを関連させて研究を行うことで、他の生物では調べられないよ図2. 共生クロレラの概日リズムに対する影響逆位相で培養されたミドリゾウリムシから取られた共生クロレラは、白色細胞に再感染したのち、白色細胞のリズムの位相を変化させる。 160 原生動物学雑誌第 40 巻第 2 号 2007 年うな事実が発見できるかもしない。しかし、現在の概日時計の研究は、遺伝子の同定など分子生物学的なアプローチが不可欠となっている。ミドリゾウリムシでは、時計遺伝子の同定が行われていないため、概日時計のモデル生物として面白い材料ながら非常に出遅れた生物となってしまった。ミドリゾウリムシにおいても、時計遺伝子の同定が行われ研究が大きく進むことを期待する。参考文献 Isoji, M., Hiroyuki, N. and Toshihiro, H. (1987) Circadian rhythmicity within Single cells of Paramecium bursaria. Johnson, C. H. and Hasting, J. W. (1986) The elusive mechanism of the circadian clock. American Scientist 74: 29-36. Kondo, T., Strayer, C. A., Kulkarmi, R. D., Taylor, W., Ishiura, M., Golden, S. S. and Johnson, C. H. （1993） Circadian rhythms in prokaryotes: luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 56725676. Miho, T. and Isoji, M. (1996) Significance of photosynthetic products of symbiotic Chlorella to establish the endosymbiosis and to express the mating reactivity rhythm in Paramecium bursaria. 三輪五十二（1989）ミドリゾウリムシの接合活性リズム遺伝 43巻12: 12-17. 三輪五十二（1998）生物は時計を複数もっている遺伝 52巻 8:31-36