2. 試験管内（in vitro）試験法の開発

2.　試験管内（in vitro）
試験法の開発
財団法人化学物質評価研究機構
2.1　発表内容
(1) 受容体結合試験法の開発
(2) レポーター遺伝子アッセイの開発
(3) アロマターゼ・アッセイの開発
(4) 開発途上にある試験法
1) TRへの受容体結合試験法
2) TRへのレポーター遺伝子アッセイ
3) 甲状腺ホルモン合成系への作用物質検出法
4) AhRへのアゴニスト様作用物質の検出法
5) 性ステロイドホルモン生合成系への作用物質検出法
(5) まとめ
（1）受容体結合試験法の開発
(1) 受容体結合試験法の開発
目的および取組み
目的:
女性ホルモン受容体(ER)または男性ホルモン
受容体(AR)結合試験系の構築とデータ収集
QSAR予測モデル構築用のデータ取得
取組み:
GST融合ヒトER αリガンド結合ドメインおよ
びMBP融合ヒトARリガンド結合ドメイン(東洋
紡) を用いた実験方法を構築し、データ収集を実
施。
(1) 受容体結合試験法の開発
試験の概要
ER: GST融合ヒトER αリガンド結合ドメイン
AR: MBP融合ヒトARリガンド結合ドメイン(東洋紡)
データ解析:
100
B/B0 (%)
Competitor X
Standard
80
60
40
IC50
20
0
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log[compound] (M)
RBA (%) = 100×
標準リガンドのIC50値
試験物質のIC50値
(1) 受容体結合試験法の開発
試験の再現性（ER）
29試験のIC50 (E2)の平均値:
0.62 ± 0.099 nM (変動係数： 16％)
95%信頼区間: 0.58 nM ～ 0.65 nM
(1) 受容体結合試験法の開発
試験の再現性（AR）
30試験のIC50 (DHT)の平均値:
7.2 ± 0.84 nM (変動係数： 12％)
95%信頼区間: 6.9 nM ～ 7.6 nM
(1) 受容体結合試験法の開発
試験法としての評価（ER）
試験法の検証
CERI
ICCVAM
計
陽性
陰性
計
陽性
15
陰性
4
19
0
15
3
7
3
22
Presumed Positive
一致率＝82%
(15物質＋3物質)/22物質
(1) 受容体結合試験法の開発
試験法としての評価（AR）
試験法の検証
CERI
ICCVAM
計
陽性
陰性
陽性
15
1
16
陰性
2
1
3
一致率＝84%
(15物質＋1物質)/19物質
計
17
2
19
データ収集結果(H12-H16)
ER：1,457物質
AR：765物質
ER
AR
H12
500
H13
448
－
－
H14
－
251
H15
250
250
H16 合計 Binder
259 1,457 348
264 765 254
(1) 受容体結合試験法の開発
今後の課題
In vivo試験との相関の詳細な解析によるスク
リーニング法としての適用範囲の明確化
評価スキーム上の位置づけ：検出限界の関係
作用メカニズムに基づいたカットオフ値の設
定
（2）レポーター遺伝子アッセイの開発
(2) レポーター遺伝子アッセイの開発
目的および取組み
目的:
多量の化学物質の女性ホルモン受容体(ER)また
は男性ホルモン受容体(AR)への化学物質の結合性、
ホルモン活性を効率よくスクリーニングするための試
験方法としての、レポーター遺伝子アッセイ法を確立
し、基礎的なデータを取得する。
取組み:
ヒトER αおよび ARを介するアゴニスト/アンタ
ゴニスト検出系、ヒトER αおよびER βを介するアゴ
ニスト検出系について開発を実施。
試験法の概略
アゴニスト検出系
使用細胞：hER α -HeLa9903 （住友化学）
100%
8
6
50%
4
2
10%
PC10 PC50
化学物質暴露濃度(M)
-5
10
-6
10 7
10
10 8
10
-9
0
10
-1
1
0
10
-1
転写活性化倍率
100 pM E2
Negative Positive
Control Control
試験系の検証1
（ ER α アゴニスト検出系既存データとの比較）
Chemical
Ethynyl Estradiol
Diethylstilbestrol
Alpha-Estradiol
Beta-Estradiol
Estriol
Estrone
Zearalenone
17alpha-Methyltestosterone
Beta-Zearalenol
Coumestrol
4-Tert-Octylphenol
Genistein
4-Nonylphenol
Testosterone,19-Nor
Daidzein
Phloretin
Levonorogestrel
Bisphenol A
Naringenin
Methoxychlor
Progesterone
Atrazine
Cas No.
57-63-6
56-53-1
57-91-0
50-28-2
50-27-1
53-16-7
17924-92-4
58-18-4
71030-11-0
479-13-0
140-66-9
446-72-0
84852-15-3
434-22-0
486-66-8
60-82-2
797-63-7
1980-5-7
480-41-1
72-43-5
57-83-0
1912-24-9
EC50(M) in CERI Reference EC50 (M)*
( 1.00E-11 )
1.10E-11
2.40E-11
1.89E-11
6.04E-10
4.60E-11
( 1.00E-11 )
1.00E-10
1.91E-11
7.10E-10
4.89E-10
3.20E-09
9.05E-10
3.43E-09
( 4.11E-06 )
1.08E-08
4.79E-09
1.50E-08
6.05E-08
1.50E-08
1.01E-07
5.00E-08
( 2.45E-08 )
6.20E-08
4.91E-07
9.45E-08
5.91E-08
2.12E-07
4.99E-06
2.90E-07
( 4.95E-06 )
3.00E-07
3.30E-07
4.55E-07
3.99E-07
( 1.48E-06 )
1.00E-06
8.85E-06
-
*: Reference EC50 (M) are quoted from "Current status of test methods for detecting endocrine
disruptors: in vitro estrogen receptor transcriptional activation assays. NIEHS, 2002".
-: Negative response or EC values could not be calculated.
The EC values in the parenthesis indicates PC50 value in stead of EC50, because the response curve was
flattened or non-sigmoidal one.
試験系の検証2
（ ER αアゴニスト検出系再現性）
試験物質：E2, Testosterone, Bisphenol A
繰り返し回数：　13回
結果： Mean EC50 ±SD → 7.73 ± 3.63 pM
95%信頼区間
→ 5.76 - 9.70 pM
変動係数
→ 47%
E2
Testosterone
0.5
-12
-11
-10
-9
-8
-7
n
Concentration (10 M)
-6
-5
Relative potency
(100pM E2=1)
1.0
0.0
-13
Bisphenol A
1.5
1.5
Relative potency
(100pM E2=1)
Relative potency
(100pM E2=1)
1.5
1.0
0.5
0.0
-13
-12
-11
-10
-9
-8
-7
n
Concentration (10 M)
-6
-5
1.0
0.5
0.0
-13
-12
-11
-10
-9
-8
-7
n
Concentration (10 M)
-6
-5
試験系の検証3
（ ER αアゴニスト検出系試験施設間再現性試験）
Test Substance
Log10[ PC50 (M) ]
Mean
SD
Log 10[ EC50 (M) ]
CV
Mean SD
CV
17β-Estradiol
-10.79 0.20 1.8
-10.78 0.23
2.1
alpha-Estradiol
-8.93 0.35 3.9
-8.98 0.15
1.6
Genistein
-7.34 0.11 1.5
-5.20 0.42
8.0
4-tert-Octylphenol
-6.94 0.19 2.8
-6.82 0.24
3.5
Bisphenol A
-6.41 0.15 2.4
-6.13 0.13
2.2
p-tert-Pentylphenol
-6.13 0.22 3.5
-5.86 0.29
5.0
17a-Methyltestosterone
-5.79 0.34 5.8
-5.11 1.11 21.7
Hematoxylin
-
-
-
-
-
-
Diethylhexyl phthalate
-
-
-
-
-
-
Benzophenone
-
-
-
-
-
-
参加施設：CERIを含む、国内4機関
データ収集結果
（ ER α アゴニスト、H12-H16）
PC10算出
PC10算出
PC50算出
PC50算出
物質数
物質数（%）
物質数
物質数（%）
ベンゼン単環
70
130
492
4
66
88
6%
51%
18%
0
53
41
0%
41%
8%
非縮合ベンゼン多環
345
151
44%
76
22%
縮合ベンゼン多環
133
62
47%
33
25%
287
1457
43
414
15%
28%
15
218
5%
15%
構造分類
脂肪族
ステロイド類
その他
合計
試験物質数
試験方法の概要
（ER α アンタゴニスト検出系）
使用細胞：hER α -HeLa9903 （住友化学）
＊天然リガンド存在下での転写活性阻害を評価
100%
50%
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
10
-8
10
-9
0
10
-1
1
10
-1
10
-1
2
IC50
化学物質暴露濃度(M)
＊別途細胞毒性試験を実施し、細胞毒性による活性低下を補正
試験系の検証結果
既存データとの比較
化合物名
4-Hydroxytamoxifen
CAS No.
68047-06-3
文献
1)
陽性
RU-486
84371-65-3
陽性
2)
陽性
1847-63-8
陽性
3)
陽性
80-05-7
陰性
1)
陰性
486-66-8
陰性
1)
陰性
Nafoxidine
Bisphenol A
Daidzein
1) ICCVAM, 2003.
2) Zou A. et al, 1999.
3) Meyers, F.H. et al, 1980.
本測定
陽性
再現性
Log10 [ IC50 (M) ]
化合物名
1
2
3
4
n
5
6
7
8
9
4-Hydroxytamoxifen
-9.51
-9.86
-9.49
-9.70
-9.14
-9.33
-9.49
-9.17
Nafoxidine
-7.51
-7.82
-7.54
-7.77
-7.57
-7.21
-7.49
4,4'-(Octahydro-4,7-methano-7.74
5H-inden-5-ylidene)
-7.29
-7.30
-7.18
-7.02
-6.99
RU-486
-5.99
-5.89
-5.87
-5.83
-5.53
-5.75
平均
( IC50 (M) )
SD
2SD
CV(%)
-9.85
-9.51
( 3.12×10-10 )
0.26
0.53
2.8
-7.11
-7.54
-7.51
( 3.11×10-8 )
0.23
0.46
3.1
-6.96
-6.86
-6.99
-7.15
( 7.10×10-8 )
0.27
0.54
3.8
-5.84
-5.59
-5.69
-5.77
( 1.68×10-6 )
0.15
0.30
2.6
データ収集結果
（ ER α アンタゴニスト、H1４）
IC30算出
PC30算出
IC50算出
IC50算出
物質数
物質数（%）
物質数
物質数（%）
7
3
42.9
ステロイド類
39
5
12.8
ベンゼン単環
57
6
10.5
1（1）*
1.8
102
8
7.8
4（2）*
3.9
縮合ベンゼン多環
30
5
16.7
3
10.0
その他
15
1
6.7
0
0.0
250
28
11.2
13
5.2
構造分類
脂肪族
非縮合ベンゼン多環
合計
試験物質数
＊細胞毒性によるfalse positiveと考えられるもの。
2（1）*
3
28.6
7.7
試験方法の概要
（ER α / β アゴニスト検出系）
• 使用細胞：HeLa (ATCC #CCL-2)
• 一過性発現系
使用プラスミド
データ収集結果
（H1４）
C
10-11
10-10
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
B
PC50(M)
PC10(M)
D
E
1
10
-1
-1
0
ND
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
10
ERβ PC50 (PC10) （M）
A
ERα PC50 (PC10) （M）
A領域 12 ER β
B領域 27 ER β > ER α
C領域 99 ER β = ER α
D領域 43 ER β< ER α
E領域 38 ER α
陰性 81
合計 300物質
今後の課題
ERαアゴニスト検出系
国際貢献としてのOECDテストガイドライン化に向けた作業
Genistein等にみられる過剰応答メカニズムの解明
ERαアンタゴニスト検出系
in vivo試験との相違を生じるメカニズムの解明
ER α /ERβ測定系
これらの受容体に対する反応性の違いと毒性影響との関
連性の明確化
試験方法の概要
（AR レポーター遺伝子アッセイ）
antagonist
ligand
ligand
cytoplasm
cytoplasm
AR
AR
nucleus
luciferase
5
’ ARE
5’
nucleus
luciferase
5’
3
’
3’
ARE
3’
light emission
Antagonist Detection Assay
Luc. activity
Luc. activity
Agonist Detection Assay
0
10-12
10-10
10-8 M
Cell
Viability
Index
0 10-12 10-11 10-10 10-9M
一過性発現系と安定形質株の比較
発現受容体
宿主細胞
宿主細胞の由来
Enhancerの由来
Promoter
Promoterの由来
レポーター遺伝子
一過性発現系
安定形質転換株
human AR
CV-1
african green monkey
MMTV ARE ×3
Alpha 2u globulin
Rat
Luc+
human AR
CHO
chinese hamster
C3 ARE ×4
Thymidine Kinase
Rat
Luc+
Two-by-two table analysis
一過性発現系
安定形質転換株
計
計
陽性
陰性
陽性
47
28
75
陰性
8
168
176
55
196
251
一致率＝86%
試験系の検証1（再現性）
• 同時再現性
Agonist
CV=4.35%
Antagonist
CV=5.51
• 日差間再現性試験
DHT, R1881, testosterone, methyltestosterone
のEC50値(n=3) CV値30%以下
結果；
実用的に十分な再現性が認められる
ことが確認された。
試験系の検証2（既存データとの比較）
-Two-by-Two table analysisAgonist Detection
posi. nega. total
ICCVAM posi.
16
2
18
class nega.
1
15
16
total
17
17
34*a
正確性
陰性判定率
陽性判定率
感度
特異性
擬陽性率
偽陽性率
偽陰性率
*a *b
91％
88％
94％
89％
94％
6％
11％
Antagonist Detection
posi. nega. total
ICCVAM posi
17
1
18
class nega.
0
5
5
total
17
6
23*b
正確性
陰性判定率
陽性判定率
感度
特異性
擬陽性率
偽陽性率
偽陰性率
96％
83％
100％
94％
100％
0％
6％
, , Positive/negative classification by ICCVAM was used for the comparison except presumptive classification.
34 = (total 40 test chemicals - 6 presumptive classification), *b23 = (total 40 test chemicals - 17 presumptive classification)
*a
データ収集結果
（ARアゴニスト、H15-H16）
構造分類
脂肪族
ステロイド類
ベンゼン単環
非縮合ベンゼン多環
縮合ベンゼン多環
その他
合計
PC10算出
PC10算出
PC50算出
PC50算出
物質数
物質数（%）
物質数
物質数（%）
0
1
0
7
4
5
17
0.0
50.0
0.0
8.0
11.8
4.6
3.3
0
1
0
0
0
0
1
0.0
50.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.2
試験物質数
30
2
187
88
34
108
514
データ収集結果
（ARアンタゴニスト、H15-H16）
IC30算出
IC30算出
IC50算出
IC50算出
物質数
物質数（%）
物質数
物質数（%）
30
2
187
0
0
6
0.0
0.0
3.2
0
0
5
0.0
0.0
2.7
非縮合ベンゼン多
環
88
15
17.0
8
9.1
縮合ベンゼン多環
34
108
514
0
5
26
0.0
4.6
5.1
0
5
18
0.0
4.6
3.5
構造分類
脂肪族
ステロイド類
ベンゼン単環
その他
合計
試験物質数
今後の課題
国際貢献としてOECDでのテストガイドライン
化作業の推進
一部の物質で観察されたDHTと共存したと
きのみ現れるこれらの協同的な活性上昇の
メカニズムの解明
（3）アロマターゼ・アッセイの開発
(3)アロマターゼ・アッセイの開発
目的および取組み
目的:
アロマターゼの活性を変動させ、内分泌作用
に影響を及ぼす可能性のある化学物質を簡便に
スクリーニングする方法を開発するとともに、
基礎的なデータを取得すること。
取組み:
ヒト卵巣顆粒膜細胞 (KGN)と高感度エスト
ロン特異ELISA測定キットを用いて非RI アロ
マターゼ活性測定法の開発を試みた。
(3)アロマターゼ・アッセイの開発
試験法の検証(報告例との比較)
Chemical name
Molecular formula
CAS No.
Reported IC50 values
KGN IC50 value
Flavone
C15H10O2
525525-8282-6
>100mM
>100mM
Weak inhibitor
7-Hydroxyflavone
C15H10O3
66656665-8686-7
0.35mM
0.35mM
5.31mM
5.31mM
Chrysin
C15H10O4
480480-4040-0
0.5mM
0.5mM
1.89mM
1.89mM
Apigenin
C15H10O5
520520-3636-5
0.18mM
0.18mM
2.58mM
2.58mM
Naringenin
C15H12O5
480480-4141-1
1.4mM
1.4mM
2.42mM
2.42mM
Fenarimol
C17H12Cl2N2O
6016860168-8888-9
2mM
2.00mM
2.00mM
Imazalil
C14H14Cl2N2O
3555435554-4444-0
0.1mM
0.1mM
0.00444mM
0.00444mM
Propiconazole
C15H17Cl2N3O2
6020760207-9090-1
5mM
0.968mM
0.968mM
o,p'-DDT
C14H9Cl5
789789-0202-6
no value
+/- *
p,p'-DDD
C14H10Cl4
7272-5454-8
no value
7.87mM
7.87mM
4-Hydroxy androstenedione
C19H26O3
566566-4848-3
0.08mM
0.08mM
0.00115mM
0.00115mM
Aminoglutethimide
C13H16N2O2
125125-8484-8
15.8mM
15.8mM
2.25mM
2.25mM
Tributyltin cloride (TBT)
C12H27ClSn
14611461-2222-9
no value
Triphenyltin cloride (TPT)
C18H15ClSn
639639-5858-7
no value
+/- *
+/- *
Atrazine
C8H14ClN5
19121912-2424-9
Diclobutrazol
C15H19Cl2N3O
7573675736-3333-3
Vinclozolin
C12H9Cl2NO3
5047150471-4444-8
C14H18N4O3
C22H34O7
1780417804-3535-2
6657566575-2929-9
++
++
++
++
+++
Benomyl
Forskolin
KNG Induction
+/- *
+/- *
+/- *
++
++++
(3)アロマターゼ・アッセイの開発
データ収集結果（H16）
総測定数＝168
Relative Aromatase Activity (%)
0%
4, 4'-Thiobis (3-methyl-6-t-butylphenol)
2,2-Bis[[(3mercaptopropionyl)oxy]methyl]trimethylene
4-(Phenylpropyl)pyridine
4,4'-[1-[4-[1-(4-Hydroxyphenyl)-1methylethyl]phenyl]ethylidene]bis[phenol]
2,3-Dichloro-1,4-naphthoquinone
Benzyltriphenylphosphonium chloride
2-tert-Butyl-p-cresol
2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3tetramethylbutyl)phenol
2-Methylnaphthalene
Phenothiazine
1,4-Naphthoquinone
2,2'-Dibenzamidodiphenyldisulfide
1-(N-phenylamino)-naphthalene
N-Phenylmaleimide
1,3,5-Trisglycidyl-isocyanuric acid
1-Naphthoquinone-2-diazido-4-sulfonic
acid sodium salt
100%
200%
300%
400%
(3)アロマターゼ・アッセイの開発
今後の課題
データの収集
基礎的知見取得
国際機関へのはたらきかけ
本法の有用性と取得データの国際機関へ紹介
in vivo試験との相関性の検討
アロマターゼ阻害物質あるいは亢進作用物質の
有害性に関する情報収集
（4）開発途上にある試験法
(4) 開発途上にある試験法
1) TRへの受容体結合試験法
目的:
ヒト甲状腺ホルモン受容体(TR)への結合を介し
た内分泌かく乱作用を安価で簡便に検出するため
のin vitro試験系(受容体結合試験法)の開発
取組み:
ヒトTR cDNAのクローニング
大腸菌を用いたヒトTR発現系の構築
トリチウム標識した3,5,3’-Triiodo-L-thyronine
([3H]T3)を用いた結合試験系の構築
(4) 開発途上にある試験法
2) TRへのレポーター遺伝子アッセイ法
目的:
甲状腺機能に影響を及ぼす可能性のある化学物質を
簡便に検出するため、甲状腺ホルモン受容体(TR)に対
するレポーター遺伝子アッセイ法を確立する。
取組み:
13年度; 内外研究調査(TR介在シグナルの複雑性;
(TRバリアント計6種類が存在し、RXR等の核内
受容体が協調)
14/15年度; 最適スクリーニング系の選択
16年度; TR α 、TR βホモダイマー系のスクリーニング系
構築
(4) 開発途上にある試験法
3) 甲状腺ホルモン合成系への作用物質検出法
目的:
甲状腺ホルモン合成系への影響を介した内分泌
かく乱作用を評価するためのin vitro試験法の開発
取組み:
FRTL-5系培養細胞の利用
Real-Time PCR法によるサイログロブリン合成
能に対する影響評価
特異基質による甲状腺ペルオキシダーゼ活性に
対する影響評価
作用既知物質暴露による試験法の有用性評価
(4) 開発途上にある試験法
4) AhRへのアゴニスト様作用物質の検出法
目的:
AhR（アリル炭化水素受容体）アゴニスト作用
を有する物質を評価ためのin vitro試験法の開発
取組み:
既存のAhRレポーター遺伝子アッセイ法(DRCALUXRアッセイ)のスクリーニング法として
の適用性の検討・評価
(4)開発途上にある試験法
5) 性ステロイドホルモン生合成系への作用物質検出法
目的:
性ホルモン合成系への影響を介した内分泌かく
乱作用を評価するためのin vitro試験法の開発
取組み:
ヒト副腎皮質細胞（H295R）を使った試験系構築
LC/MSによる生合成代謝物量の検出法の構築
Real-Time PCR法による性ホルモン合成酵素
遺伝子発現量の検出法の確立
作用既知物質暴露による試験法の有用性評価
（5）まとめ
下記試験系を実用レベルの測定系として開発した。
受容体結合試験（ER α , AR）
レポーター遺伝子アッセイ（ER α , ER β, AR）
アロマターゼ・アッセイ
開発継続中の項目
1) TRへの受容体結合試験法
2) TRへのレポーター遺伝子アッセイ法
3) 甲状腺ホルモン合成系への作用物質検出法
4) AhRへのアゴニスト様作用物質の検出法
5) 性ステロイドホルモン生合成系への作用物質検出法

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