Ⅷ ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） 1 バクテリアや真核生物の新規ゲノム配列取得 ゲノムドラフト解析 特 長 ● 次世代シーケンサーを利用した迅速なドラフト塩基配列解析／変異解析 ● 高速シーケンス解析とサンガー法を組み合わせ、ゲノム精密解析をトータルサポート ● 有用遺伝子の探索や比較解析などのバイオインフォマティクスも充実 概 要 お客様の目的に応じて各種ゲノム解析手法を組み合わせて内容をご提案します。有用遺伝子の探索、遺伝子クラスターの解 明、代謝パスウェイ解析、変異解析など様々な用途にご利用ください。充実したバイオインフォマティクス解析、扱いやすいソ フトウェアもご用意しております。 サービス内容 GS FLX+またはHiSeq/MiSeqを用いたドラフト塩基配列解析 次世代シーケンサーによる塩基配列取得を実施します。得られたデータをアセンブルしコンティグ配列を取得します。ロン グペアエンド解析によりスキャホールド配列の取得も可能です。 ● 原核生物 真核生物 使用機器 アセンブルソフトウェア 納品配列 HiSeq/MiSeq EDENA コンティグ配列 GS FLX+ GS DeNovo Assembler コンティグ配列／スキャフォールド配列 HiSeq/MiSeq ALLPATHS-LG/Velvet コンティグ配列／スキャフォールド配列 精密解析 ドラフト塩基配列解析で得られたコンティグ配列をペアエンドシーケンス結果などにより整列させた後に、 ギャップ領域およ び低精度塩基に対して、PCR増幅産物やゲノムクローンのサンガー法によるシーケンスを行い、 より精密なゲノム配列を取 得します。 また、GS FLX+データにHiSeq/MiSeqデータを加えてハイブリッドアセンブルを行うことも可能です。低精度塩基の改 善に効果的です。 ● ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） Ⅷ 29 バイオインフォマティクス解析 ドラフト塩基配列解析、精密解析または既知ゲノム変異解析で得られた塩基配列情報をもとにCDS領域の予測、 アノテー ション情報取得、 さらには近縁生物種との比較ゲノム解析、代謝パスウェイ解析など行うことが可能です。結果については、 ゲノム解析ソフトウェアIMC Genomicsやカスタムデータベースの構築など、 目的に応じた解析・閲覧形態での納品が可 能です。 ● 【オプションサービス】 ● ゲノムライブラリー作製 （13ページ参照） 納 品 物 ご依頼の内容により異なりますので、 お問い合わせください。 受入サンプル 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） ゲノムDNA 以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。 ● サンプル量 GS FLX+ フラグメント解析 3 kb ペアエンド解析 8 kb ペアエンド解析 20 kb ペアエンド解析 HiSeq/MiSeq ペアエンド解析 3 kb（2∼5 kb） メイトペア解析 8 kb（8∼10 kb） メイトペア解析 フォスミドジャンプ解析 濃度 4μg以上 15μg以上 30μg以上 100μg以上 20 100 200 200 ng/μl以上 ng/μl以上 ng/μl以上 ng/μl以上 3μg以上 30μg以上 50μg以上 50μg以上 60 200 200 100 ng/μl以上 ng/μl以上 ng/μl以上 ng/μl以上 純度 OD260/OD280 OD260/OD230 1.6 以上 ・ DNAは滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer ： 10 mM Tris-HCl、 0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。 ・ 電気泳動 （1％Gel） にて40 kbに明確なバンドが検出され、 低分子の混入及び分解がないことをご確認ください。 ・ 上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。 ＜ゲノムドラフト解析の流れ＞ ࢺࣚࣆࢹሲᇱ㒼าゆᯊ ⢥ᐠゆᯊ ࣆࣚࢡ࣒ࣤࢹ࢙࣬࣋ࣤࢺゆᯊ 㸝㧏㏷ࢨ࣭ࢢࣤࢦ࣭㸞 ࢙࣋ࣤࢺゆᯊ 㸝㧏㏷ࢨ࣭ࢢࣤࢦ࣭㸞 ࢣࢿ࣑ࣚࣇ࣭ࣚࣛష⿿ 㸝ࣈࣚࢪ࣐ࢺࠉ ࣆ࢚ࢪ࣐ࢺࠉ %$& ➴㸞 ሲᇱ㒼าゆᯊ 㸝ࢦ࣭ࣤ࢝Ἢ㸞 ࣁ࢛ࣤࣆ࢚࣏ࢷࢠࢪゆᯊ ࣬㐿ఎᏄ㡷ᇡῼ ࣬ࢿࢷ࣭ࢨࣘࣤ ࣬ࣂࢪ࢘ゆᯊ ⣙ဗࢸ࣭ࢰౚ 㸝ࣄ࣭ࣖ࣠㸞 ࢣࢿ࣑ゆᯊࢮࣆࢹ࢘ ,0&*HQRPLFV ࣬Ẓ㍉ࢣࢿ࣑ゆᯊ ゲノム解析 （ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） ሒฌ⌦ 㸝ࢬࣤࣇࣜ㸞 Ⅷ 30 Ⅷ ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） 特 長 2 安全性評価や品質確認に トランスジーンの挿入位置同定 ● 挿入位置のPCR作業から承ります ● 複数検体の同時解析も可能です 概 要 ウイルスベクターを用いて製作されたiPS細胞の安全性評価、 トランスジェニックマウスのトランスジーン導入位置同定によ る品質確認、 トランスポゾンのようなモバイルエレメントの挿入位置同定による育種研究などに有効です。 サービス内容 ● ● ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） Ⅷ TAIL-PCRを応用した方法 トランスジーンの末端配列上にPCRプライマーを設計し、 ランダムに断片化したゲノムDNAにライゲーションしたアダプ タープライマーとともにPCRを行い、その得られた増幅産物をGS FLX+を用いて高速シーケンスします。取得した配列 は参照ゲノムへマッピングし、 挿入位置の情報を納品いたします。 レトロウイルスベクターによる遺伝子導入など挿入末端に欠失がない場合に有効です。 メイトペアシーケンスを用いた方法 3kb程度にランダムに断片化したゲノムDNAからメイトペ アライブラリーを調製し、イルミナ社シーケンサーを用い て網羅的にシーケンスします。取得した配列は挿入配列と 参照ゲノムへマッピングし、挿入配列と参照ゲノムの両方に マッピングされたリード情報から挿入位置を検出、挿入位置 の情報を納品いたします。アグロバクテリウムベクターによ る遺伝子導入など複雑な挿入形式の場合に有効です。 納 品 物 ● ● ● 作業報告書 シーケンスデータ一式 挿入位置候補リスト、アライメントファイル等 受入サンプル 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） 参照ゲノム配列や挿入遺伝子配列情報 ● ゲノムDNA 以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。 ● サンプル量 濃度 ゲノムDNA （TAIL-PCR） 10μg以上 100 ng/μl以上 ゲノムDNA（メイトペアシーケンス） 30μg以上 200 ng/μl以上 純度 OD260/OD280 OD260/OD230 1.6以上 ・ DNAは滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer ： 10 mM Tris-HCl、 0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。 ・ 電気泳動 （1％Gel） にて10∼20 kbに明確なバンドが検出され、 低分子の混入及び分解がないことをご確認ください。 ・ 上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。 31 3 次世代シーケンサーによるメタゲノム解析 16S rRNA PCRサンプルの解析 特 長 ● 多数のサンプルを一度にかつ大量に解析可能 ● 菌叢構造のグラフ化により視覚的な判断が容易 ● 菌叢比較解析にも対応 概 要 16S rRNA領域を増幅したPCR産物等を対象に、次世代シーケンサーを用いて大量に配列解析を行います。得られた配列 を用いて16Sデータベースに対する相同性検索および系統分類解析を実施いたします。対象とするサンプル中に、 どのよう な微生物がどれくらい存在しているのかを明らかにすることが可能です。 サービス内容 高速シーケンス解析用アダプター配列を付加した16S rRNA領域特異的プライマーをご用意いただき、PCR増幅および精 製（PCR産物を混合する場合は混合まで） を行ったPCR産物をご用意ください。ご用意いただいた精製済みPCR産物を用い て、次世代シーケンサーによる配列取得を行います。 また、 PCRプライマーに数塩基のタグ配列を付加することにより、複数検体を混合して一度に解析することが可能です。 （アダ プター配列およびタグ配列については、事前にお問い合わせください。） 得られた配列を用いて16S rRNAデータベースに対する相同性検索および系統分類解析を実施し、相同性検索と系統分類 解析結果の一覧、系統分類解析結果に基づき菌種組成を集計したグラフをお納めします。 オプション解析として、検体間の菌叢の違いを容易に解釈できる菌叢比較解析もご用意しております。 納 品 物 ● ● 作業報告書 シーケンスデータ一式 相同性検索結果等 受入サンプル 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） 精製済PCR産物 以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。 ● PCR産物 サンプル量 濃度 1μg以上 20 ng/μl以上 純度 OD260/OD280 OD260/OD230 1.6以上 ・ PCR産物は滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer ： 10 mM Tris-HCl、 0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。 ・ GS FLXを用いる場合、シーケンス解析の対象となる領域長は250∼450 bpを推奨しております。 ・ PCR増幅は、指定の配列を付加したプライマーをご利用ください。 ゲノム解析 （ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） ● Ⅷ ご留意事項 ・ GS FLX+によるピロシーケンス法はサンガー法に比べ、 ポリベース領域の解析が困難になりますので、 これらの領域で はベースコールミスを起こす場合があります。 ・ GS FLXを用いる場合、16S rRNA PCR産物の解析を含めたAmplicon Sequenceは、Sequencing Kit XLR70 を用いた解析のみの対応となります。 ・ MiSeqを用いる場合のプライマー配列は、 下記の文献に準拠したもののみ対応となります。 Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. Caporaso JG et al ., ISME J . 2012 Aug;6(8):1621-1624. 32 Ⅷ ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） 特 長 4 rRNA遺伝子配列情報を用いた微生物種の推定・菌叢解析 微生物推定解析 ● サンガー法による高品質塩基配列解析による微生物種の推定 ● 毎日更新される最新のNCBIデータベースやDDBJデータベースを利用したin houseでの相同性検索 概 要 第十六改正日本薬局方収載の方法に準じて、 リボソームRNA遺伝子塩基配列を決定し、相同性検索による推定を行います。 また、 ご希望に沿ったリボソームRNA遺伝子塩基配列の決定にも対応いたします。 サービス内容 16S rRNA配列部分解析（細菌） 細菌の16S rRNA遺伝子の約500塩基の塩基配列を決定し、相同性検索結果より推定される菌種の上位リスト （50位） を納品いたします。 ● 16S rRNA配列全長解析 （細菌） 細菌の16S rRNA遺伝子の約1500塩基の塩基配列を決定し、 相同性検索結果より推定される菌種の上位リスト （50位） を納品いたします。 ● ITS1配列解析 （真菌） 真菌の18S rRNAと5.8S rRNA間のスペーサー領域 （ITS1、約300塩基）の塩基配列を決定し、 相同性検索結果より推 定される菌種の上位リスト （50位） を納品いたします。 ● リボソームRNA配列解析 （ご希望領域） 真菌または細菌のrRNA塩基配列を決定し、 相同性検索結果より推定される菌種の上位リストを納品いたします。 ● 微生物群集解析 微生物が混在する検体から、rRNA遺伝子領域をPCR増幅後、 クローニングを行います。必要数のクローンの塩基配列解 析を行い（プレート単位での解析が可能です） 、相同性検索結果で推定される菌種の上位リスト （5位） を納品いたします。 ● Ⅷ ゲノム解析（ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） ＜相同性検索結果例＞ 納 品 物 塩基配列解析結果 ● 相同性検索結果 ● 作業報告書 ※WEB納品も可能です （6ページ参照） ● 受入サンプル ● ● 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） 通常解析：単離された菌体から調製したゲノムDNA（200 ng以上） 微生物群集解析：環境サンプルなどから調製されたゲノムDNA（200 ng以上）、 DGGE解析から得られたPCR産物（500 ng以上） ご留意事項 ・ タカラバイオでは菌種同定判断までは対応しておりません。得られた相同性検索結果よりお客様にご判断していただくことに なります。 ・ 病原性が疑われるサンプルや生菌はお受けすることができません。 33 5 微生物群のゲノム／遺伝子情報を網羅的に解析 メタゲノム解析 特 長 ● 次世代シーケンサーを用いたメタゲノムのショットガンシーケンス ● 細菌集団全体を解析 ● 細菌叢がもつ生体システムの解明に！ 概 要 メタゲノム解析は、 環境サンプルから直接回収されたゲノムDNAを解析することにより、 従来の方法では困難であった難培養 菌のゲノム情報の取得を期待できるほか、 菌叢の遺伝子組成や機能の解明を期待できる新しい手法として注目されています。 タカラバイオでは、16S rRNA PCRサンプルの解析に加え、 メタゲノムのショットガンシーケンスによるサービスを行いま す。膨大な配列データは、 メタゲノムとしてアセンブルを行い、遺伝子機能の予測などを行います。 サービス内容 メタゲノム DNAを提供いただき、 ショットガンライブラリーを作製後、HiSeq/MiSeqを用いてシーケンスを取得します。取 得したリードはアセンブルを行いコンティグ作成後、遺伝子領域を予測し、COG（Clusters of Orthologous Groups） や KEGGデータベースに対する相同性検索を行います。ライブラリーに付与された識別タグを利用し、複数検体を同時に解析 することも可能です。 ・作業の流れ / Metagenomic DNA Shot-gun library Ⅷ Sequence read replication アセンブル 遺伝子予測 Transcription 機能分類 Contig, Singletons Gene Set Gene Function ・納品データ例 ウェブサイトをご覧ください。 納 品 物 ● ● ● 作業報告書 シーケンスデータ一式 相同性検索結果一式（ウェブサイトをご覧ください） 受入サンプル 送付先 （巻末の「受託サービスの流れ」をご覧ください。） ゲノム解析 （ゲノム配列決定、 メタゲノム解析） Cell Cycle ゲノムDNA 以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。 ● ゲノムDNA サンプル量 濃度 3μg以上 60 ng/μl以上 純度 OD260/OD280 OD260/OD230 1.6以上 ・ 上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。 ・ DNAは滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer ： 10 mM Tris-HCl、 0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。 ・ 電気泳動 （1％Gel）にて10∼20 kbに明確なバンドが検出され、 低分子の混入及び分解がないことをご確認ください。 34
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