Nagoya Med. J.（ ） , ― 107 平成 年度名古屋市立大学医学会賞 受 賞 論 文 乳腺発がんに重要な遺伝子同定の試み 内 木 綾 名古屋市立大学大学院医学研究科 実験病態病理学 Development of important genes during breast carcinogenesis AYA NAIKI-ITO Department of experimental pathology and tumor biology Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences SUMMARY Carcinogen exposure induces many gene expression changes in either target or non-target organ, some of them may be important for carcinogenic process but others not. In this study, we attempt to find crucial genes which may be important for mammary carcinogenesis. For this purpose, we used human c-Ha-ras proto-oncogene transgenic rats（Hras for mammary carcinogens, N-methyl-N-nitrosourea（MNU） , , ）which are highly sensitive -dimethyl benz［a］anthracene（DMBA） and -amino- ‐methyl‐‐phenylimidazo［ ，-b］pyridine（PhIP） . We found Gpx as an up-regulated gene commonly in all mammary carcinomas induced the different three carcinogens by DNA microarray analysis, and its up-regulation was confirmed by quantitative RT-PCR. In addition, immunohistochemically highly expression of GPX was detected in not only rat mammary carcinomas but also human breast cancers. Knockdown of GPX expression by siRNA resulted in significant growth inhibition in both rat and human mammary carcinoma cell lines by p dependent manner. Thus, those data clearly demonstrated that GPX is involved in mammary carcinogenesis and cell proliferation in both rat and human, indicating that GPX may be a novel target of prevention and therapy for breast cancers. は じ め 乳腺発がんにおいては，遺伝子発現変化や食 に 乳癌は，世界で女性の中で最も多い癌であ 事などの要因が考えられるが，それらは多岐に り，肺癌に次ぎ死亡率が高く本邦においても乳 わたりすべてを網羅することは困難である．そ ） 癌の発生率は上昇している ．乳癌において こで，乳腺発がんにおいて発がんの原因によら は，病理組織学的性格やホルモンレセプターで ず発生した乳癌で共通に起こる遺伝子発現変化 あるエストロゲンレセプター，プロゲステロン を捉えることは，本質的に乳癌発生に重要な役 レセプターの発現と HER 増幅の有無に基づき 割を果たしているという仮定に基づき，乳腺発 治療法が選択されているが，いずれの治療法に がん物質暴露に高感受性で，短期間に多くの乳 も抵抗性の乳癌も多く，新たな治療ターゲット 癌を発生するラット乳腺発がんモデルのヒト正 の開発が必要であると考えられる． 常型 c-Ha-ras 遺伝子が導入されたトランスジェ 107 108 ニックラット（Hras ）― ）を用いて，以下の ような検討を行った． を抽出し，Gpx mRNA 発現変化を定量的 RTPCR で確認したところ，ラット乳癌組織では， 種類の誘発乳癌のいずれにおいても無処置の ．ラット乳癌と正常乳腺の遺伝子発現変 化の解析 Hras ラットに異なる発がん機序を持つと 正常乳腺と比較し 倍以上発現が上昇している ことが確認された（Figure ） ．また，Hras DMBA 誘発乳癌より樹立された - 種類のラッ さ れ る N-methyl-N-nitrosourea （MNU） ， ， - ト乳癌細胞株（RMC- ， ， ， ， ， ）の dimethylbenz［a］ - anthracene （DMBA）および いずれの細胞においても正常乳腺組織に比較し - amino- -methyl- -phenylimidazo［ ， -b]pyridine （PhIP）の 種類の乳腺発がん物質を投与し， 発生した乳癌を各発がん物質誘発乳癌とも ずつ，また無処置の Hras 例 ラットおよび同腹 の野生型ラット由来正常乳腺から 例ずつから RNA を抽出し， 枚（乳癌 枚，正常乳腺 て Gpx mRNA が高発現していることが確認 された（Table ） ．また，Western blotting では タンパクレベルにおいても Gpx は 種類の乳 癌で高発現を認め，免疫組織染色では Gpx タ ンパクが細胞質に強発現していることが明らか となった（Figure ） ．一方，ヒト乳癌細胞株 MCF- 枚）のオリゴ DNA マイクロアレイ（CodeLink ，T D と MDA-MB- においても正常乳管 rat whole genome）により遺伝子発現プロファ 上皮細胞と比して GPX mRNA 発現が高いこ イルを確認した． とが明らかとなった（Table ） ． 種類の乳癌の遺伝子発現プ ロファイリングは，Hras ラットの正常乳腺 のプロファイルと比較し， 種類の乳癌におい てもいずれも有意差をもって発現の上昇してい る遺伝子を抽出した．その結果， 個の遺伝 子が乳癌で発現上昇する遺伝子として捉えられ た．その中には乳癌で異常が報告されている既 知の遺伝子も含まれていたが，著者らはあまり 癌との報告がされていなかった Glutathione peroxidase （Gpx ）に注目し以下の実験を行うこ ととした． ．mRNA およびタンパクレベルにおける マイクロアレイデータの確認 Hras および野生型ラットの正常乳腺 と MNU，DMBA，または PhIP 投与乳癌より RNA Table . GPX Figure . Relative Gpx expression levels in carcinogeninduced mammary cancers. The data were obtained by quantitative RT-PCR as described in the materials and methods. Gpx mRNA expression level was adjusted by cytokeratin .*, p＝ ． ,**, p＝ ． compared with control value（Student’s t test） . mRNA level of rat and human mammary carcinoma cell lines. 109 Figure . A. Western blot of normal mammary tissue and carcinoma in Hras rats. Lane to , normal mammary tissue. Lane to , carcinogen-induced mammary cancer; to , MNU, to , DMBA, and to , PhIP-induced. C. Immunohistochemical findings of Gpx in rat mammary carcinomas induced by MNU, DMBA and PhIP. Gpx was strongly positive in the cytoplasm of tumor cells. Non-tumorous mammary glands of Hras rats were completely negative. Figure . Histological appearance of human breast cancers and GPX immunohistochemical staining. （A） , （C） ,（E） : H & E, and（B） ,（D） ,（F） : immunohistochemistry. GPX staining was positive in the cytoplasm of human breast cancer cells regardless of tumor type. （A）to（F）were invasive ductal carcinoma;（A）and （B）were papillotubular carcinoma,（C）and（D）were solid-tubular carcinoma and（E）and（F）were scirrhous carcinoma. びヒト乳癌細胞株に導入し，GPX 発現を抑制 した際に乳癌細胞の増殖に与える影響を検討し ．ヒト乳癌における GPX タンパク発現 の検討 た． 年に GPX が乳癌細胞において p ラット乳癌で高発現が見られた GPX のヒト るという報告があった ）ことより，実験には 存性に酸化ストレス誘導アポトーシスを抑制す 乳癌での発現を検討するために，名古屋市立大 ラット，ヒトともに正常 p 学病院乳腺内分泌外科で 胞と変異 p 年から 年の間 依 を発現する乳癌細 を発現するものを用いた．その結 に切除された浸潤性乳管癌 症例に対し，免疫 果，ラットおよびヒト乳癌細胞いずれにおいて 組織学的検索を行った．その結果，組織型によ も正常 p らず全症例で乳癌細胞に GPX の発現が見ら 著明な細胞増殖抑制が認められたが，変異 p れ，ヒト乳癌においても GPX は重要な役割を 発現乳癌細胞は，GPX 発現抑制の影響が見ら 示していることが考えられた（Figure ） ． れなかった（Figure ） ． ．ラットおよび ヒ ト 乳 癌 細 胞 に お け る GPX の機能解析 乳癌の増殖にかかわる GPX の役割を明らか にするため，GPX 特異的 siRNA をラットおよ 発現下では GPX 発現を抑制すると ま と め ラット乳腺発がんモデルとオリゴ DNA マイ クロアレイ法を用いて，作用機序の異なる つ のラット乳癌 で 発 現 上 昇 す る 遺 伝 子 と し て 110 発現がより高いことや，ヒト乳癌組織の GPX 免 疫 染 色 の 結 果 か ら は，悪 性 度 が 高 い ほ ど GPX の発現が低い傾向があること（本稿では 詳細データは割愛した）より，GPX は早期の 乳癌増殖により関与することが考えられる．ま た，ヒト乳癌では， ∼ ％に p の変異が見 られると報告されている ）が，in vitro の GPX 発現抑制実験からは，GPX は正常 p 発現 をもつ乳癌の治療へ応用できる可能性が示唆さ れた． 謝 辞 栄誉ある賞を頂きました名古屋市立大学医学 会に心より感謝申し上げます．また，本研究を 直接指導頂きました朝元誠人先生，研究の総括 をしていただきました白井智之先生ならびに， 共同研究者の津田洋幸先生（分子毒性学） ，山 下啓子先生（腫瘍・免疫外科学）に深く感謝い たします． Figure . GPX affects p -dependent cell proliferation in both rat and human mammary cancer cells. A. Rat mammary cancer cell lines, C with wild-type p showed clear inhibition of cell proliferation by Gpx silencing but not in the C with mutant p .（*: Student’s t test, p＝ ． , **: p＝ ． ） . Lower graphs show knockdown efficiency by quantitative RT-PCR. B. Human mammary carcinoma cell line, MCF- with wild-type p , showed significant inhibition of cell proliferation by GPX suppression, while another human breast cancer cell line, T D with mutant p showed . no apparent change（**: Student’s t test, p＝ ． ） Lower graphs show knockdown efficiency by quantitative RT-PCR. Reference ）Dumitrescu RG, Cotarla I: Understanding breast cancer risk ― where do we stand in Mol Med : - ? J Cell , ）Asamoto M, Ochiya T, Toriyama-Baba H, et al.: Transgenic rats carrying human c-Ha-ras protooncogenes are highly susceptible to N-methyl-Nnitrosourea mammary carcinogenesis Carcinogenesis : - , ）Naito A, Suzuki A, Ueda S, et al.: Preferential mammary carcinogenic effects of -amino- - methyl- -phenylimidazo［ , -b］pyridine（PhIP） Gpx を同定した．GPX は，mRNA お よ び タ ンパクレベルでラット乳癌に高発現し，ヒト乳 in human c-Ha-ras proto-oncogene transgenic rats Cancer Sci : - , 癌でも発現上昇が見られた．GPX は，消化管 ）Tsuda H, Asamoto M, Ochiya T, et al.: High sus- 粘膜に発現が見られ，過酸化物を還元する作用 ceptibility of transgenic rats carrying the human c- や抗炎症作用を有すなど生体に対して防御的に Ha-ras 働く ，） ．癌と関連する報告としては，消化器 癌や肝発がんへの関与が示唆されている proto-oncogene to chemically-induced mammary carcinogenesis Mutat Res : - , ，） ． ヒト乳癌細胞株では，エストロゲン依存性の ）Yan W, Chen X: GPX , a direct target of p , in- MCF- や T D が，エストロゲン非依存性で分 hibits oxidative stress-induced apoptosis in a p - 化度の低 い MDA-MB- dependent manner J Biol Chem , よ り も GPX mRNA : - 111 ）Chu FF, Esworthy RS, Doroshow JH: Role of Sedependent glutathione peroxidases in gastrointestinal inflammation and cancer Free Radic Biol Med : - , ）Chu FF, Doroshow JH, Esworthy RS: Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI J Biol Chem : - , ）Banning A, Kipp A, Schmitmeier S, et al.: Glutathione Peroxidase Inhibits Cyclooxygenase- - Mediated Migration and Invasion of HT- Adeno- carcinoma Cells but Supports Their Growth as Tumors in Nude Mice Cancer Res : - , ）Dewa Y, Nishimura J, Muguruma M, et al.: Gene expression analyses of the liver in rats treated with oxfendazole Arch Toxicol : - ）Lacroix M, Toillon RA, Leclercq G: p , and breast cancer, an update Endocr Relat Cancer : - , 112
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