〔生化学 第８ ２巻 第６号，pp.４ ８ ４―４ ９ ３，２ ０ １ ０〕 !!! !!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 特集：ペプチド科学と生化学の接点 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! がん抑制タンパク質 p５ ３の四量体形成 鎌 田 瑠 泉，坂 口 和 靖 がん抑制タンパク質 p５ ３は遺伝毒性ストレスに応答して活性化し，細胞周期停止やアポ トーシスを誘導して細胞のがん化を抑制している．p５ ３の四量体形成は機能発現に必須で あり，細胞内タンパク質量・翻訳後修飾・タンパク質間相互作用などの様々な要因により 制御されている．p５ ３の複雑な制御機構を理解するためには，これらの要因と四量体形成 とが相互に及ぼす影響を詳細に解析していくことが必要である．本稿では，ペプチドを用 いた p５ ３の四量体形成ドメインの同定・構造安定性解析を基に，四量体形成による p５ ３機 能の調節機構について紹介する． １． は じ め 体形成が p５ ３の機能発現に必須である６∼１１）．p５ ３の四量体 に と単量体は平衡関係にあり，タンパク質量・翻訳後修飾な がん抑制タンパク質 p５ ３は，遺伝毒性ストレスに対する どにより四量体形成は影響を受ける．p５ ３は遺伝毒性スト 細胞周期調節のための多様なネットワークの最も重要な レスに応答して翻訳後修飾されることにより安定化・活性 “ハブ（hub） ”タンパク質である．p５ ３は紫外線，放射線 化され，活性型四量体 p５ ３により機能を発揮すると考えら などの遺伝毒性ストレスに応答して活性化され，細胞周期 れている．細胞内 p５ ３の制御機構を解明するためには， 停止，アポトーシスを誘導する様々な下流遺伝子の転写を p５ ３の四量体構造およびその安定性，翻訳後修飾が及ぼす 活性化する転写因子として，細胞ゲノム情報の完全性を保 影響を定量的に解析する必要がある．しかしながら，細胞 つ機構の中心的な働きをしている１∼３）．また，p５ ３は転写因 内 p５ ３の四量体構造の安定性および翻訳後修飾・タンパク 子としての機能だけでなく，直接ミトコンドリアで機能し 質レベル増加による四量体の安定化を定量的に解析するこ てアポトーシスを誘導し，さらには Drosha と相互作用す とは容易ではない．本稿では，ペプチドを用いた p５ ３四量 ることで microRNA（miRNA）のプロセシングに関与する 体形成に関わる研究を中心に，p５ ３多量体形成ドメインの ことも明らかとなっている４）．さらに最近，p５ ３―p２ １経路 同定から，その詳細な構造，安定性解析結果について紹介 が iPS 細胞樹立を抑制していることが報告されるなど ， する．さらに，ペプチドを用いて得られた精密な定量的解 p５ ３は細胞内の様々なプロセスに関与していることが分 析結果を基に，細胞内での p５ ３の四量体形成と機能調節， かっている（図１） ． および p５ ３の四量体形成ドメイン変異による不安定化とが ５） p５ ３はホモ四量体を形成するタンパク質であり，p５ ３の DNA 結合能，タンパク質間相互作用，核内・核外移行な どの様々な機能は p５ ３の多量体構造に依存しており，四量 ん化との関連について解説する． ２． p５ ３四量体形成ドメインの同定・構造 ヒト p５ ３は３ ９ ３アミノ酸残基からなり，N 末端側から五 北海道大学大学院理学研究院化学部門生物化学研究室 （〒０ ６ ０―０ ８ １ ０ 北海道札幌市北区北１ ０条西８丁目） Tetramerization of tumor suppressor protein p５ ３ Rui Kamada and Kazuyasu Sakaguchi（Laboratory of Biological Chemistry, Department of Chemistry, Faculty of Science, Hokkaido University, North １ ０, West ８, Kita-ku, Sapporo０ ６ ０―０ ８ １ ０, Japan） つの主要なドメイン（転写活性化ドメイン，プロリンリッ チドメイン，DNA 結合ドメイン，四量体形成ドメイン， 塩基性ドメイン）で構成されている（図２） ．１ ９ ９ ４年，著 者らが p５ ３四量体形成ドメイン同定の研究を始めた当時明 らかとなっていたのは，p５ ３の C 末端側約１／４の領域が 多量体形成に関わっていることであった．四量体形成ドメ ４ ８ ５ ２ ０ １ ０年 ６月〕 図１ がん抑制タンパク質 p５ ３の機能 p５ ３は遺伝毒性ストレスに応答して活性化・安定化・四量体形成し，１．ミトコンド リアでのアポトーシス促進，２．様々な下流遺伝子の転写活性化，３．miRNA プロセ シングの促進など，様々な機能を発揮する．これらの機能により，遺伝毒性ストレス に応答したアポトーシス・細胞周期停止が誘導される． 図２ p５ ３のドメイン構造 ヒト p５ ３は３ ９ ３アミノ酸残基からなり，N 末端側から転写活性化ドメイン（TAD） ， プロリンリッチドメイン（PRD） ，DNA 結合ドメイン（DBD） ，四量体形成ドメイン （TD） ，塩基性ドメイン（BD）の五つの主要なドメインから構成されている． 図３ p５ ３四量体形成ドメインの構造（pdb:３sak） （A） 四量体形成ドメインのアミノ酸配列 四量体形成ドメインは β ストランド（３ ２ ６―３ ３ ３位） ，ターン（３ ３ ４位） ，α ヘリックス （３ ３ ５―３ ５ ６位）から構成される． （B） 四量体形成ドメインの NMR 構造 二つの逆平行 β シートと４ヘリックスバンドルにより四量体を形成する．矢印で示 した四つの N 末端は立方体の頂点に位置しているとみなすことができる． ４ ８ ６ 〔生化学 第８ ２巻 第６号 図４ p５ ３のドメイン構造と翻訳後修飾部位 p５ ３の N 末端側と C 末端側には翻訳後修飾を受ける部位が多数存在 し，遺伝毒性ストレスに応答した修飾により，p５ ３の安定性・DNA 結合能・転写活性・四量体の安定性が制御されている． 図５ p５ ３に見られるミスセンス変異の頻度 上：各アミノ酸残基の体細胞突然変異の頻度とホットスポット変異 下：各アミノ酸残基の生殖細胞系列変異の頻度 IARC TP５ ３Mutation Database, release R１ ４, November２ ０ ０ ９４３） ４ ８ ７ ２ ０ １ ０年 ６月〕 表１ ヒト悪性腫瘍に見られる四量体形成ドメインのミスセンス変異 図６ 四量体形成ドメインの変異が四量体構造に及ぼす影響 （A） 四量体形成ドメイン変異型ペプチドの熱安定性．温度上昇に伴 う２ ２ ２nm の CD 値を測定し，四量体の半分が変性して単量体となる ときの温度（Tm）を求めた． （B） 四量体構造不安定化により転写活性・がん抑制機能が低下する． 四量体構造の安定性・転写活性・がん抑制機能を定量的に解析するこ とで，四量体構造が不安定化し，転写活性やがん抑制機能を失う際の 閾値を明らかにできると考えられる． ４ ８ ８ 〔生化学 第８ ２巻 第６号 図７ 四量体形成ドメイン変異型 p５ ３タンパク質の転写活性 （A） 生細胞における p５ ３転写活性解析法．EGFP 融合 p５ ３タンパク質発現ベクターと p５ ３応答性配列を持ち，下流に DsRed の配列 を持つレポーターベクターを p５ ３null の H１ ２ ９ ９に導入する．緑色蛍光強度から p５ ３タンパク質量，赤色蛍光強度から転写活性を定量 する． （B） 変異型 p５ ３タンパク質の転写活性と変異型ペプチド安定性の相関．横軸に変異型ペプチドの安定性（Tm） ，縦軸に変異型 p５ ３タ ンパク質の転写活性（EGFP-p５ ３が発現している細胞中の DsRed を発現している細胞の割合）をプロットした．四量体構造の安定性 が減少すると，p５ ３タンパク質の転写活性も減少している． （C） K１ ０-p５ ３tet， R１ ０-p５ ３tet による p５ ３転写活性の阻害効果．ペプチドを加えていないときの転写活性を１ ０ ０％ とした．ヘテロ四量 体を形成する WT では転写活性が約６ ０％ 低下しているが，四量体を形成できない変異型 L３ ４ ４P ではその阻害効果がほとんど見られ ない． 図８ p５ ３四量体形成による翻訳後修飾・機能の変化 四量体形成および翻訳後修飾・タンパク質安定性・タンパク質間相互作用は互い に影響しあい，p５ ３の DNA 結合能・転写活性などの機能を制御している． ４ ８ ９ ２ ０ １ ０年 ６月〕 インの位置を決定するため，p５ ３の３ ０ ３位―３ ９ ３位周辺の配 四量体構造の立体構造を基に，疎水性コアに存在する残 列を持つ９種のペプチドを通常の Fmoc 固相法，あるいは 基の中の，プライマリーダイマー間の疎水性アミノ酸を置 相本らのチオエステル法によるセグメント縮合により合成 換することにより，天然型のプライマリーダイマーと同様 した１２，１３）．合成した各ペプチドの沈降平衡法による超遠心 の構造を持つ二量体変異体 M３ ４ ０Q／L３ ４ ４R や２２），プライマ 分析を実施した結果，３ １ ９―３ ６ ０位が四量体形成のためのコ リーダイマーとは異なる構造を持つ二量体変異体 M３ ４ ０K／ アドメインを含むことが明らかとなった１４）．さらに，四量 F３ ４ １I／L３ ４ ４Y が作成されている２３）．また，著者らは，３ ４ １ 体を形成するペプチドの CD スペクトルの α ヘリックス含 位の Phe を非天然型のアミノ酸であるシクロヘキシルアラ 有率が高いこと，また，クロスリンキングの実験より逆平 ニン（Cha）に置換することで，p５ ３ペプチド四量体構造 行の４ヘリックスバンドルを形成することが予想された． が飛躍的に安定化（Tm＞１ ０ ０℃）することを見出している． Clore らとの共同研究により，p５ ３四量体形成ドメイン この超安定構造は，Phe よりも嵩高く自由度の高い Cha が の NMR による立体構造が明らかとなった．四量体形成ド 四量体構造中の空隙を埋めることによって達成されている メインは N 末端側から β ストランド（Glu３ ２ ６-Arg３ ３ ３） ， と考えられる．Cha はこのような環境における Phe の有用 ターン（Gly３ ３ ４） ，α ヘリックス（Arg３ ３ ５-Gly３ ５ ６）で構成 なアナログであり，安定な酵素やペプチド性薬剤の設計な されている ．逆平行 β シートによりプライマリーダイ １ ５， １ ６） マーが形成され，二つのプライマリーダイマーが４ヘリッ クスバンドルを介して二量体の二量体として対称な四量体 どへの応用に有用な手法となることが期待される． ３． 四量体構造の安定性と翻訳後修飾 が形成される（図３） ．この四量体構造において，４個の N p５ ３の四量体形成は，DNA 結合・転写活性化能に重要 末端と C 末端は模式的に立方体の頂点に位置しており， である２４∼２６）．p５ ３の N 末端領域と C 末端領域には様々な翻 DNA 結合ドメインと C 末端側の塩基性ドメインが互いに 訳後修飾を受ける部位が存在し，遺伝毒性ストレスに応答 三次元空間で近接した位置に配置されると考えられる．こ した翻訳後修飾により p５ ３のタンパク質安定性・四量体構 の構造は，p５ ３タンパク質四量体の４個の DNA 結合ドメ 造の安定性・転写活性化能などが制御されている２）（図 インが２個のパリンドローム配列中にある４個の結合部位 ４） ．著 者 ら は，p５ ３の C 末 端 領 域 の Ser３ １ ５，Ser３ ７ ８，Ser と相互作用する際の，DNA の折れ曲がりにも重要である ３ ９ ２のリン酸化が四量体構造に及ぼす効果を解析するた と思われる．また，X 線結晶構造解析１７，１８）による立体構造 め，３ １ ５位，３ ７ ８位，３ ９ ２位にそれぞれリン酸化セリンを も明らかになっている． 導入した p５ ３C 末端（３ １ ９―３ ９ ３位）ペプチドアナログを化 Fersht らは，３ ２ ６位―３ ５ ３位までの各残基のアラニン ス 学合成した．合成した各ペプチドを用いた超遠心分析によ キャニング法により，四量体構造安定化およびフォール り四量体―単量体間の解離定数を求めた．その結果，３ ９ ２ ディングに重要な残基を明らかにしている１９）．四量体の界 位のリン酸化により非リン酸化時と比べて１ ０倍近く四量 面に存在する Leu３ ４ ４，Leu３ ４ ８，Met３ ４ ０，疎水性コアを形 体形成が促進することが明らかとなった．３１ ５位，３ ７ ８位 成する Phe３ ２ ８，Arg３ ３ ７，Phe３ ３ ８，疎水性コアの中心に位 のリン酸化は四量体形成にほとんど影響を及ぼさなかった 置する残基 Ile３ ３ ２，Leu３ ３ ０，Phe３ ４ １の９個の疎水性アミ が，３ １ ５位のリン酸化は３ ９ ２位の安定化効果を打ち消すこ ノ酸残基の Ala 置換により，四量体構造が大きく不安定化 とが示された．p５ ３は細胞ストレスに応答して数々の翻訳 したことから，これらの残基が四量体構造形成および安定 後修飾を受けることから，ストレスに応答した C 末端領 化に重要であることが判明している．また，四量体形成ド 域の Ser３ ９ ２のリン酸化により p５ ３の四量体構造の安定化 メインは疎水性相互作用だけでなく，Arg３ ３ ７―Asp３ ５ ２間の が制御されていることが考えられる．また，p５ ３C 末端領 静電的相互作用によっても安定化している．さらには，分 域のリン酸化により１ ４-３-３ファミリータンパク質と p５ ３ 子動力学シミュレーションにより，Arg３ ３ ７，Asp３ ５ ２の静 の結合が増加するという報告もある２７）．一方，疎水性コア 電相互作用には二つの残基 Arg３ ３ ３，Glu３ ４ ９も関与してい に位置する Met３ ４ ０の酸化剤によるメチオニンスルホキシ ることが示されている ．さらに，ストップトフロー CD， ドへの酸化が，四量体構造を大きく不安定化することが示 蛍光法による四量体形成ドメインのフォールディング解析 されている２８）．Met３ ４ ０酸化型ペプチドはスルホキシド基 から，変性状態の単量体はフォールディングして，まずネ 同士の電荷の反発や立体障害により四量体構造が不安定化 イティブな構造とは異なる構造を持った遷移状態である二 していると考えられる．酸化ストレスによる Met 残基の 量体を形成することが明らかにされている２１）．続いて，ネ 酸化は p５ ３タンパク質を不活性化させる要因の一つである イティブな構造と似た構造の二量体へと構造変化し，その かもしれない． ２ ０） 二量体同士が会合して四量体を形成する．一方，四量体構 上記とは逆に，四量体形成が p５ ３タンパク質の翻訳後修 造のアンフォールディング過程では，中間体は観測され 飾において必須となる場合も知られている．例えば，ユビ ず，四量体から単量体へ変性することが示されている． キチンリガーゼ（E３）である Mdm２との結合を阻害する ４ ９ ０ 〔生化学 第８ ２巻 第６号 N 末端領域 Ser２ ０のリン酸化には四量体形成ドメインが必 る．これらの変異体は天然型と比べて四量体構造が著しく 要である２９）．また，p５ ３の DNA 結合能を増加させる C 末 不安定化しており，DNA 結合能や転写活性が低下してい 端領域 Lys３ ８ ２のアセチル化も，四量体形成できない変異 ることが明らかとなっている４０∼４３）．Kriwacki らは，家族性 型では起こらない ．これは C 末端領域 Lys３ ２ ０をアセチ 腫 瘍 症 候 群 の Li-Fraumeni 症 候 群 に 見 ら れ る p５ ３変 異 ル化する酵素 p３ ０ ０が p５ ３の四量体にしか結合できないた R３ ３ ７H の安定性を詳細に解析している４２）．天然型の四量体 めであると考えられる．さらに，p５ ３の E３ユビキチンリ 構造は pH５から９の間で安定性が変化しないのに対し， ガーゼである Pirh２は p５ ３の四量体構造を認識し，四量体 R３ ３ ７H は pH が７から８に上昇すると大きく不安定化す 形成ドメインに結合して p５ ３をユビキチン化することが明 る．この pH 依存性は His 残基のプロトン化によるもので ６， １ １） らかになっている ．このため，Pirh２は四量体を形成し あることがわかっている．また，G３ ３ ４V のように四量体 ている p５ ３を優先的にユビキチン化することで，活性型 構造を不安定化させるだけでなく，生理的 pH でアミロイ p５ ３の代謝回転を制御していると考えられている． ドを形成する変異も報告されている４４）．３ ３ ４位 Gly は β ス ３ ０） 四量体形成と翻訳後修飾が相互に影響し合う一方で，こ トランドと α ヘリックスを繋ぐターン部位に位置する残 れらは細胞内における p５ ３タンパク質の安定性，転写活 基である．変異型ペプチド G３ ３ ４V は，低温条件下で天然 性，タンパク質間相互作用にも影響を及ぼす．p５ ３は極め 型 p５ ３四量体形成ドメインペプチドと同様の四量体構造を て半減期が短く，正常細胞では生合成後速やかにユビキチ 形成するが，生理的 pH，温度条件下では β 構造からなる ン―プロテアソームによるタンパク質分解を受ける．この 凝集前駆体へと構造変化し，アミロイド様線維を形成す ため，正常細胞において p５ ３のタンパク質レベルは非常に る．天然型および R３ ３ ７H ペプチドも pH ４． ０ではアミロイ 低い．ところが，遺伝毒性ストレスに応答して p５ ３の N ド様線維を形成することが報告されている４５）．さらに，著 末端側がリン酸化を受けると，Mdm２と p５ ３の結合が阻害 者らはシスプラチン耐性卵巣がん細胞（A２ ７ ８ ０）から，四 され，p５ ３は安定化して機能を発揮する ．また，C 末 量体形成ドメイン変異 K３ ５ １N を同定し，四量体構造が不 端領域のアセチル化が p５ ３の配列特異的 DNA 結合，転写 安定化していることを見出した４６）．さらに，K３ ５ １N は転写 活性を増加させることが明らかとなっている３３，３４）．さらに 活性が減少し，シスプラチン処理による細胞質 p５ ３の減少 は，p５ ３の四量体形成はタンパク質間相互作用にも重要で も見られた．A２ ７ ８ ０のシスプラチン誘導アポトーシスは細 ３ １， ３ ２） ある．翻訳後修飾する酵素のみならず，p５ ３の核内移行に 胞質 p５ ３に依存することが知られており，A２ ７ ８ ０は K３ ５ １N 関 わ る と 考 え ら れ て い る S１ ０ ０B や３５），Mdm２３６），HPV-１ ６ の四量体構造の不安定化による転写活性の減少および細胞 E２３７），c-Abl３８）との結合も p５ ３の多量体構造に影響を受ける 質 p５ ３の減少によりアポトーシス耐性を獲得していると考 という報告もされている．このように，細胞内における えられる． p５ ３の機能は様々な要因が関わる複雑な制御を受けている 上記の変異を含め，四量体形成ドメイン中では，現在ま ため，in vitro における精密な定量的解析が重要になると でに四量体形成ドメイン３ １残基中２ ４残基に４ ９個のミス 考えられる． ３ ９） センス変異が報告されている（表１） ．我々は，これらの ４． 四量体形成ドメインの変異と四量体構造の安定性 変異が p５ ３の四量体構造に及ぼす影響を網羅的・定量的に 解析するため，変異型 p５ ３四量体形成ドメインペプチドを p５ ３タンパク質をコードしている TP５ ３ 遺伝子の変異は 用いた構造安定性の網羅的解析を行った．まず，変異型ペ ヒト悪性腫瘍中で最も多く見られる異常である２４，３９）．欠損 プチドを化学合成し，ゲルろ過により多量体構造を同定し 型変異やナンセンス変異による不活性化が大部分を占める た．その結果，４ ９種の変異型ペプチド中５種のペプチド 他のがん抑制遺伝子とは異なり，p５ ３に見られる変異の大 （L３ ３ ０P，L３ ３ ０R，R３ ３ ７P，R３ ４ ２P，L３ ４ ４P）が四量体を形成 部分（７ ４％）はミスセンス変異である．p５ ３に見られる体 できず，単量体の位置に溶出した．一方，３種のペプチド 細胞ミスセンス変異はその９ ５％ 以上が DNA 結合ドメイ （F３ ４ ２C，L３ ４ ４R，A３ ４ ７T）は二量体を形成していることが ンに見られる（図５） ．一方，生殖細胞系列変異では，四 明らかとなった．上記以外の変異型ペプチドは低温・高濃 量体形成ドメイン中に存在する Arg３ ３ ７に最も多くの変異 度条件下において天然型と同様に四量体の位置に溶出し が報告されており，DNA 結合ドメインと四量体形成ドメ た． インには同程度の頻度で変異が存在している．このことか CD 測定により各ペプチドの四量体構造安定性を定量化 ら，DNA 結合ドメインと同様に，四量体形成ドメインは した（図６A） ．ほとんどの変異型ペプチドは四量体構造が p５ ３の機能発現にとって必須の領域であることがわかる． 不安定化しており，中には低温・高濃度条件においても四 Li-Fraumeni 症候群に見られる変異である R３ ３ ７C， R３ ３ ７H， 量体を形成できず，ランダムコイル状の単量体として存在 L３ ４ ４P や，悪性腫瘍由来の変異 L３ ３ ０H，G３ ３ ４V，R３ ４ ２P に する変異型ペプチドも存在した．また，上記の疎水性コア ついては構造安定性や転写活性などの機能が報告されてい を形成する残基の変異により，四量体構造は著しく不安定 ４ ９ １ ２ ０ １ ０年 ６月〕 化することが明らかとなった．一方，側鎖が溶媒に露出し のカリックス［４］ アレーン誘導体は，Li-Fraumeni 症候群に ている残基の変異による不安定化効果は小さい傾向にあっ 見られる点変異体 R３ ３ ７H に対してペプチドが５０％ 変性す た．興味深いことに，変異型ペプチドの安定性は天然型と るときの温度 Tm をおよそ１ ０℃ 上昇させると報告してい ほぼ同程度から非常に不安定なものまで広く分布してい る．１H-１５N-HSQC 法による NMR 測定により，この化合物 た．さらに変異型 p５ ３の内在性 p５ ３タンパク質レベルにお 中のプラス電荷を持つグアニジウム基が p５ ３四量体構造の ける四量体の割合を算出した結果，in vitro ではわずかし 表面に側鎖が露出している Glu３ ４ ６，Glu３ ３ ９と相互作用し， か不安定化が見られない変異体でも，四量体の割合は大き 疎水性のループ構造が p５ ３四量体構造の疎水性ポケットに く減少することが明らかになった．このことから，四量体 入り込むことで変異型 R３ ３ ７H 構造を安定化することが明 構造のわずかな不安定化が p５ ３の四量体構造に影響を及ぼ らかとなっている．この化合物の細胞や動物レベルでの活 し，p５ ３の機能不全へと繋がる可能性が示唆される．すな 性に興味が持たれる．また，DNA 結合ドメインの変異体 わち，p５ ３が機能不全となる際の四量体構造不安定化の閾 に対する安定化剤も報告されており，それら安定化剤によ 値は非常に小さいかもしれない（図６B） ． る変異型 p５ ３の機能修復が示されている４９∼５２）． 四量体構造の安定性と p５ ３の機能との相関を解明するた p５ ３の四量体形成については，これまでその安定化につ め，現在までに変異型 p５ ３についての様々な解析が進めら いて興味が持たれてきたが，四量体形成の阻害による不安 れている．我々は，生細胞中における p５ ３の機能を解析す 定化が重要な意味を持つ例も紹介したい．iPS 細胞は四つ るため，緑色蛍光タンパク質 EGFP 融合 p５ ３タンパク質発 の転写因子 Oct４，Sox２，Klf４，c-Myc を導入することで 現ベクターと p５ ３応答性プロモーターの下流に赤色蛍光タ 作成することができるが，作成効率は導入した細胞中５％ ンパク質 DsRed の遺伝子を組み込んだレポーターベク と非常に低い５３）．近年，この低い作成効率は，p５ ３が iPS タ ー を 作 成 し た（図７A） ．こ の ベ ク タ ー を p５ ３ null の 細胞誘導の過程を抑制していることが原因であり，p５ ３ H１ ２ ９ ９細胞に導入し，緑色蛍光量から p５ ３タンパク質量 null の細胞では iPS 作成効率が１ ０―２ ０倍に増加することが を，赤色蛍光量から p５ ３の転写活性を定量化した４７）．一般 明らかとなっている５）．このことから，p５ ３機能の一過性 に，細胞に発現ベクターをトランスフェクトすると，導入 の効果的な阻害は，iPS 細胞作成の効率を上昇させると考 するベクター量を少なくしても内在性レベルに比べて約 えられる．著者らは p５ ３が四量体として機能することに着 １ ０∼２ ０倍量の過剰のタンパク質が発現する．p５ ３四量体形 目し，四量体形成ドメインペプチドとヘテロオリゴマーを 成は濃度に依存するため，p５ ３タンパク質が過剰に存在し 形成させることで p５ ３機能を阻害することを目指してい ている条件では四量体の割合が増加してしまうと考えられ る．四量体形成ドメインペプチドを細胞内へ導入するた る．このため，内在性レベルの p５ ３を発現している細胞の め，protein transduction domain （PTD）であるポリカチオ みを解析対象とした．その結果，四量体構造が不安定化し ン配列を p５ ３ペプチドに融合した PTD-p５ ３tet ペプチドを ている変異体では転写活性も低下し，両者の間に強い相関 化学合成した．これらのペプチドは細胞内へと移行し， が見られ，細胞内生理的条件に近い濃度において四量体形 p５ ３の転写活性を約６ ０％ 阻害することが明らかとなった 成が転写活性に必要であることが示された（図７B） ．同様 （図７C） ．この阻害効果は四量体を形成できない変異型ペ の結果が，酵母発現系を用いた転写活性の解析でも報告さ プチドでは見られなかったことから，PTD-p５ ３tet ペプチド れている ． は p５ ３タンパク質とヘテロ四量体を形成し，転写活性を阻 ４ ８） ５． p５ ３四量体構造の安定性制御を介した機能制御 今まで述べてきたように，p５ ３の四量体形成により転写 活性やタンパク質間相互作用が変化する．このため，四量 体構造を安定化あるいは不安定化させることにより，p５ ３ の機能を制御することができると考えられる． 害したものと考えられる．より強い阻害効果を示すペプチ ドを開発するため，ペプチドの導入効率，ヘテロオリゴ マーを優先的に形成するペプチドのスクリーニング等を進 める必要があるだろう． ６． お わ り に p５ ３四量体形成ドメインや DNA 結合ドメインをター p５ ３は細胞内で厳密にタンパク質量が制御され，機能し ゲットとして，がん治療薬を目指した安定化剤開発が進め ている．p５ ３の遺伝毒性ストレスに応答した翻訳後修飾， られている．四量体形成ドメインの点変異による四量体構 安定化により p５ ３の四量体と単量体間の平衡が四量体側に 造の不安定化は，細胞内転写活性能を低下させている．こ シフトし，p５ ３はより翻訳後修飾を受けやすくなる．この のため，変異型四量体構造を安定化させることで p５ ３の機 ように，p５ ３の翻訳後修飾と四量体構造の安定化は相互に 能回復が可能になると考えられる．Mendoza らは，カリッ 影響しあうことで，遺伝毒性ストレスに迅速に応答し，細 クス［４］ アレーンの上部に四つのグアニジウム基を持ち， 胞のがん化を抑制していると考えられる（図８） ． 下部に疎水性のループ構造を持つ化合物を合成した４８）．こ p５ ３の詳細な制御機構，変異によるがん化機構を解明す ４ ９ ２ 〔生化学 第８ ２巻 第６号 る上で，細胞内 p５ ３濃度における四量体構造の安定性・翻 訳後修飾・機能を定量的に解析することは極めて重要であ る．このような定量的解析には，容易に多種類・多量のサ ンプルを得ることができ，様々な測定系に応用することが できるペプチドは極めて有用であるといえる．今後は，ペ プチドを用いて得られた安定性の結果と全長タンパク質の 安定性との比較，およびタンパク質の翻訳後修飾レベル・ 転写活性などの機能を定量的に解析する必要があるだろ う．また，p５ ３の四量体形成ドメインペプチドにおいて， N 末端および C 末端は模式的にそれぞれ立方体の頂点に 位置するという非常にユニークな構造を形成しており，N 末端，C 末端に各種機能分子を立体配置制御的に付加する ことにより，このペプチドを利用した新規バイオナノマテ リアル創製への展開も期待される． 文 献 ２ ３. １）Meek, D.W.（２ ０ ０ ９）Nat. 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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
