Federica Braga (Milano)

L’importanza della biologia
individuale nell’impiego clinico dei
marcatori di neoplasia ovarica
Federica Braga
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica e Cattedra di Biochimica
Clinica e Biologia Molecolare Clinica, Dipartimento di Scienze Biomediche
e Cliniche “Luigi Sacco”, Università degli Studi di Milano
Antigene
Carboidratico 125
(CA125)
Proteina 4
dell’epididimo umano
(HE4)
 glicoproteina (>200 kDa),
riconosciuta da CO125,
principalmente espressa dai tessuti
di origine Mülleriana
marcatore consolidato per la
determinazione della recidiva di
carcinoma ovarico e il monitoraggio
della risposta alla terapia
 Linee Guida NICE 2011: utilizzo in
“primary care setting” per donne
con sintomi suggestivi o ad alto
rischio per carcinoma ovarico
 glicoproteina (20-25 kDa)
appartenente alla famiglia
“four-disulfide core proteins”.
Presenta omologie con alcuni
inibitori di serinproteasi
 a parità di sensibilità, HE4 mostra
una specificità significativamente più
alta rispetto a CA125 per la diagnosi
di carcinoma ovarico
2
HE4 supera CA125 in
termini di accuratezza
diagnostica per
l’identificazione di
carcinoma ovarico in
donne con sospetta
sintomatologia
Il CA125 verrà sostituito da HE4?
possibile, ma prima bisogna meglio comprendere e definire:
 prestazioni analitiche
 strategie di interpretazione
TRAGUARDI
ANALITICI
VARIABILITA’ BIOLOGICA
INTERPRETAZIONE
Variabilità totale
Preanalitica
Analitica
Biologica
Intraindividuale
(Fraser & Harris, 1989)
Interindividuale
• Traguardi analitici (imprecisione, bias,
errore totale della misura)
• Utilità dei limiti di riferimento (indice di
individualità) & numero di campioni da
esaminare per determinare il punto
omeostatico
• Differenza critica (“reference change 4
value”)
Variabilità Biologica CA125:
Limitazioni dei dati disponibili
 raccolta campioni seriali a distanza di tempo variabile, anche durante
il periodo mestruale [1-3]
 no distinzione tra donne PreM e PostM [1-3]
 arruolamento di soggetti con condizioni potenzialmente interferenti
(es. portatori di altre neoplasie) [3]
 campioni analizzati in più sedute analitiche [1,3]
 nessuna informazione sulla distribuzione dei dati [1-3]
[1] Browning MC et al. J Nucl Med Allied Sci 1990;34 (Suppl):89s-91s
[2] Tuxen MK, et al. Gynecol Oncol 1999;74:12-22
[3] Trapé J, et al. Clin Chem 2005;51:219-22
Variabilità Biologica
HE4:
Nessun dato disponibile in
letteratura
OBIETTIVO
DELLO STUDIO
Determinare la
VARIABILITA’ BIOLOGICA di CA125 e HE4 nella
stessa coorte di donne,
suddivise in pre- e post-menopausa*, attraverso un
protocollo estremamente accurato
 Particolare attenzione alle fonti di variabilità pre-analitica e
all’analisi statistica.
*Stato menopausale definito come
amenorrea da oltre 12 mesi per cause naturali [Nurses’ Health Study]
7
MATERIALI E METODI
 28 donne apparentemente sane:
14 preM (età 25-53 anni)
14 postM (età 50-68 anni)
CRITERI DI INCLUSIONE: - nessuna storia di malattia cronica;
- ciclo mestruale regolare e no uso contraccettivi;
- no farmaci, alcol (>10 g di etanolo/g), fumo.
 4 prelievi di sangue venoso, uno al mese (durata dello studio: 4 mesi)
PRELIEVO:
- donne PreM: 12°-14°g del ciclo (ovulazione)
- tra 09:00 e 09:30, digiuno almeno 8 h;
- no attività fisica 24 h precedenti;
- stesso prelevatore;
- provette da siero senza gel separatore;
- centrifuga, aliquotazione e conservazione a -80 °C.8
MATERIALI E METODI
 scongelamento e risospensione
di tutti i campioni
 analisi in:
- UNICA SEDUTA ANALITICA
- DUPLICATO
- ORDINE CASUALE
 utilizzo di un singolo lotto di
reagenti
Analizzatore ROCHE Modular analytics EVO
(electrochemiluminescent immunoassay)
9
ANALISI STATISTICA (I)
 TEST per OUTLIER (Cochran’s test, Reed’s criterion)
 TEST di NORMALITA’ DELLA DISTRIBUZIONE
(Shapiro-Wilk test e Kolmogorov-Smirnov test)
 ANOVA per derivare CVA%, CVI%, CVG%
Varianza
Inter-individuale
Varianza Analitica
Sogg 1
Varianza Intra-individuale
Sogg 2
Sogg n
 Mann-Whitney rank sum test (confronto mediane)
 F-test (confronto varianze intra-individuali)
10
ANALISI STATISTICA (II)
 INDICI DERIVATI:
- Differenza critica = 2,77 [CVA2 + CVI2]1/2
- Indice di individualità (II) = σ2A+I/σ2G
Se II <0,6: IR non utili
Se II >1,4: IR utili
- n = 3,842*CVA+I2/100 (stima punto omeostatico entro ±10%)
 TRAGUARDI ANALITICI:
IMPRECISIONE: ≤ 0,25 CVI (O)
≤ 0,5 CVI (D)
≤ 0,75 CVI (M)
BIAS: < 0,125 (CVI2 + CVG2)1/2 (O)
< 0,25 (CVI2 + CVG2)1/2 (D)
< 0,375 (CVI2 + CVG2)1/2 (M)
ERRORE TOTALE: = 1,65 (0,25 CVI) + 0,125 (CVI2 + CVG2)1/2 (O)
= 1,65 (0,5 CVI) + 0,25 (CVI2 + CVG2)1/2 (D)
= 1,65 (0,75 CVI) + 0,375 (CVI2 + CVG2)1/2 (M)
11
RISULTATI
 TEST OUTLIER:
Cochran’s test (duplicati)
-
Cochran’s test (σ2A+I)
1
-
Reed’s criterion
-
-
27
28
(13 PreM; 14 PostM)
(14 PreM; 14 PostM)
NORMALITA’
 SOGGETTI IDONEI PER LO STUDIO
 SHAPIRO-WILK TEST (distribuzione medie individuali)
SI (100%)
SI (89%)
 SHAPIRO-WILK TEST (tutti)
NO (P <0,001)
SI (P=0,16)
CONVERSIONE
DEI DATI IN log naturali!!
Confermato dal
Kolmogorov-Smirnov test
 SHAPIRO-WILK TEST SUI DATI convertiti in log (tutti)
 Mann-Whitney rank sum test (mediane)
 F-TEST (varianze intra-individuali)
SI (P=0,59)
PreM = PostM
PreM = PostM
PreM = PostM
PreM > PostM
1
2
2
3
3
4
4
Premenopausal women
Premenopausal women
1
5
6
7
8
9
10
6
7
8
9
10
11
11
12
12
13
13
14
1
0
2
4
6
1
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76
2
2
CA125 (U/mL)
3
3
4
4
Postmenopausal women
Postmenopausal women
5
5
6
7
8
9
10
5
6
7
8
9
10
11
11
12
12
13
13
14
14
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
HE4 (pmol/L)
28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76
CA125 (kU/L)
HE4 (pmol/L)
Mediana,
pmol/L
CVA,
%
CVI,
%
CVG,
%
II
Tot
48,6
0,98
9,7
16,4
0,35
0,04
PreM
50,6
12,1
15,7
0,01
PostM
47,8
6,5
17,4
Mediana,
kU/L
CVA,
%
CVI,
%
CVG,
%
II
DC,
%
n
Tot
12,3
1,97
9,1
10,6
0,02
25,8
3
PreM
13,2
9,1
10,5
PostM
10,8
9,1
10,8
DC,
%
n
0,59
33,5
6
0,14
13
18,3
2
RISULTATI
TRAGUARDI ANALITICI
IMPRECISIONE, %
BIAS, %
ERRORE TOTALE, %
Min
Des
Ott
Min
Des
Ott
Min
Des
Ott
≤6,8
≤4,5
≤2,3
≤5,2
≤3,5
≤1,7
≤16,5
≤11,0
≤5,5
≤9,1
≤6,0
≤3,0
≤7,4
≤5,0
≤2,5
≤22,4
≤14,9
≤7,5
≤4,9
≤3,2
≤1,6
≤7,0
≤4,7
≤2,3
≤15,1
≤10,0
≤5,0
14
CONCLUSIONI
 ALTA INDIVIDUALITA’ (II<0,6) PER
ENTRAMBI I MARCATORI:
 il monitoraggio dei cambiamenti
longitudinali nel tempo delle concentrazioni
nel siero è probabilmente una strategia di
interpretazione migliore rispetto alla
valutazione trasversale del risultato mediante
utilizzo di intervalli di riferimento/limiti
decisionali
 Dato che per HE4 la variabilità intraindividuale nelle PreM è doppia rispetto a
quella nelle PostM, l’interpretazione dei
cambiamenti di questo marcatore deve
prevedere l’impiego di specifiche DC in base
alla condizione ormonale della donna
25,8%
33,5%
18,3%
15
Centre for Metrological Traceability in
Laboratory Medicine (CIRME), University of
Milan, IT
Mauro Panteghini
Clinical Pathology Unit, ‘Luigi Sacco’ University
Hospital, Milan, IT & Chair of Clinical
Biochemistry and Clinical Molecular Biology,
University of Milan, IT
Simona Ferraro, Roberta Mozzi, Doriana Basco
Tutti coloro che hanno fornito i campioni di
sangue per lo studio
Roche Diagnostics per aver fornito
gratuitamente i reagenti CA125 ed HE4 per la
conduzione dello studio
16

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