Scuola di Specializzazione in Genetica Medica, Università di Torino 14 gennaio 2014 La diagnosi prenatale non invasiva Maria Cristina Rosatelli Diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) DNA fetale libero isolato dal plasma materno Cellule fetali isolate dal circolo materno Cellule fetali nel circolo materno 1893 Georg Schmorl ‘‘Pathological and anatomical examinations of puerperal-eclampsia’’ Georg Schmorl documentò per primo la presenza di cellule fetali nel corpo materno ed enfatizzò l’importanza della placenta nello sviluppo dell’eclampsia. Per primo osservò la presenza di trombi contenenti cellule giganti multinucleate sinciziali nei polmoni di 17 donne morte di eclampsia e ipotizzò che fossero di origine placentare. Ipotizzò l’esistenza di un traffico cellulare materno-fetale nelle gestazioni normali, che sarebbe aumentato nelle gravidanze affette da eclampsia. Schmorl G., Pathologisch Pathologisch--anatomische Untersuchungen über Puerperal Puerperal--Eklampsie Eklampsie.. Verlag FCW Vogel, Leipzig; 1893 Diagnosi prenatale mediante cellule fetali circolanti Cellule fetali circolanti nel sangue materno Linfociti Trofoblasti Le popolazioni cellulari fetali oggetto di Eritroblasti studio sono: I linfociti fetali persistono a lungo nel circolo materno Enrichment: Ficoll/Hypaque (Pharmacia) 1.077 g/ml. Monoclonal antibody to mature B-cell antigens (CD19 or CD23) Tcell antigens (CD3, CD4, or CD5), hematopoietic stem cell antigen (CD34), or antigens expressed on committed lymphoid and myeloid progenitor cells (CD34 and CD38) Becton Dickinson FACStarPLUs Fetal NRBCNRBC-Nucleated Red Blood Cell o Emivita breve (25-35 gg nella circolazione adulta), per cui vi sono scarse probabilità che gli NRBC isolati appartengano a precedenti gravidanze o Numerosi nel circolo fetale durante il primo trimestre, presenti in bassa quantità in quello materno (1/ml) o La presenza del nucleo consente la determinazione del genotipo fetale o La linea eritroide si sviluppa più precocemente di quella linfoide per cui sarebbero più idonei per una diagnosi non invasiva precoce o Hanno caratteristiche morfologiche che le distinguono dalla controparte materna o Possiedono marcatori di superficie e citoplasmatici che le contraddistinguono dagli eritrociti maturi 1992 Diagnosi di T21 in NRBC arricchite con FACS Metodi: Metodi: Ficoll/ Ficoll /Hypaque Chr Y Fluorescein--conjugated anti Fluorescein anti--TfR Analysis and sorting BD FACS FACS--IV (Green)) FISH per Y (red (red)) e chr21 (Green Risultati:: 3 cellule 47,XY,+21 Risultati Diagnosi eseguita in 19 settimane dopo amniocentesi che potrebbe avere incrementato il numero di NRBC in circolo Chr 21 Altre pubblicazioni: 1992 Elias S et al: First trimester diagnosis of trisomy 21 in fetal cells from maternal blood 1993 Simpson JL et al: Isolating fetal cells from maternal blood. Advances in prenatal diagnosis through molecular technology MACS MicroBeads 50 nm in size Biodegradable Conjugated to monoclonal antibodies Magnetic Labeling D.Gänshirt-Ahlert, M. Burschyk, H.S.P.Garritsen, L. Helmer, P.Miny, J. Horst, H. P.G. Schneider, W. Holzgreve MACS Technology Miltenyi Trapped Labeled Cells High Gradient Magnetic Field Eluition of the unlabeled cell fraction Eluition of the labeled cell fraction MACS Column Cell of interest 1993 Gaenshirt-Ahlert D et al: Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting Metodi: • 16-18 ml sangue (8-20 w) • Gradiente ficoll-hypaque • CD71-magnetic beads MACS • Staining con anti-γ/ζ (22 cells/sample) • Recupero cellule con Micromanipolatore e capillari di vetro (cell scraping) Mutation detection • Nested PCR β globin gene (40 + 20-30 cicli) • Reverse dot-blot Risultati: • 7-22 cellule nucleate • 2 diagnosi prenatali eseguite con successo Metodi di arricchimento e isolamento delle NRBC o Density gradient centrifugation: centrifugation: consente di eliminare la maggior parte degli eritrociti materni e di arricchire la frazione fetale • Percoll Percoll,, Ficoll, Ficoll, Single or Triple Gradients o FACS: consente l’isolamento cellulare sulla base di più parametri FACS: (markers di superficie o intracellulari, intracellulari, volume, ecc) ecc) o MACS: metodo semplice MACS: semplice,, economico, economico, consente di processare campioni con elevato numero di cellule. Utilizzato per la selezione Positiva (es CD71) o per la deplezione negativa (es CD45) degli eritrociti fetali o Isolamento di singole cellule tramite micromanipolatore e “cell scraping scraping”” o Isolamento di singole cellule tramite microdissettore “Laser capture” capture” FACS Marcatori intracellulari per l’identificazione delle fNRBC o o Catene globiniche embrionali ε e ζ • limiti: parziale espressione nel portatore α-tal Catene globiniche fetali γ • limiti: una minoranza di cellule materne esprime catene γ globiniche (es.: gravidanza, anemia e pazienti β-tal) Kleihauer’s stained fNRBCs FISH XY positive fNRBC ε-globin-FITC fNRBC Microdissezione, lisi cellulare, amplificazione (2 step) Microdissezione, step) di 1 fNRBC marcata con ε-FITC Analisi microsatelliti (identificazione cellula fetale) Digestione con Proteinasi K e MDA (Multiple displacement Amplification)) Amplification SnaPshot (Ricerca mutazione familiare) Limiti dello studio delle cellule del trofoblasto (CFTC) A causa delle grandi dimensioni vengono intrappolate nei polmoni e rapidamente eliminate dalla circolazione materna Cellule multinucleate e quindi non adatte per la diagnosi citogenetica in interfase Mosaicismo placentare confinato (circa l’1% delle cellule placentari ha cariotipo differente rispetto al feto) Assenza di anticorpi specifici NIPD mediante analisi di CFTC 63 Coppie a rischio per Fibrosi cistica o SMA a 9-12 sett 20 ml di sangue materno- 1-2 CFTC/ml entro 12 sett di gravidanza Presenti dalla 5a settimana di gravidanza Isolate per volume (ISET) con specifiche membrane filtranti e dissezionate mediante microscopio laser-capture 100% sensibilità e specificità CFTC scompaiono dopo il parto (Mouawia et al 2012) Cell-free fetal DNA La storia ha origini lontane…… 1948 Mandel and Metais descrivono per la prima volta la presenza di DNA ed RNA nel compartimento non cellulare del sangue di soggetti sani e di soggetti affetti da patologie 1977 Leon and Shapiro dimostrarono che la concentrazione del DNA circolante è maggiore nei pazienti affetti da tumore rispetto ai soggetti sani e che tale concentrazione diminuisce nei casi di successo terapeutico 1989 Stroun et al. dimostrarono che il DNA presente nel plasma di pazienti affetti da tumore presenta alcune caratteristiche del DNA tumorale (es decreased strand stability) 1994 Sorenson et al e Vasioukhin et al confermarono la presenza nel plasma del DNA di origine tumorale e delle specifiche mutazioni, in pazienti affetti da tumore pancreatico e leucemia mieloide acuta 1996 Prima segnalazione cffDNA e ipotesi di NIPD 1997 Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non--invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetonon fetomaternal relationship relationship.. L’era del DNA fetale libero (cffDNA) Principali caatteristiche del DNA libero nel plasma Il DNA libero è sempre presente nel sangue periferico con una grandezza variabile tra 145–201 bp La gravidanza determina un aumento delle dimensioni del DNA circolante di origine materna e un progressivo aumento della concentrazione del DNA fetale di dimensioni inferiori. L’origine del DNA fetale circolante nel plasma materno è placentare, dovuta a processi apoptotici delle cellule del sinciziotrofloblasto Il DNA fetale è presente sin dalla VII settimana di gravidanza e aumenta durante la gestazione. In 10 settimane di gravidanza ammonta a circa il 5-10% del DNA plasmatico La presenza del DNA fetale nel plasma materno non è più rilevabile due ore dopo il parto. Il tempo di dimezzamento medio è di 16.3 minuti (range 4–30 min) 2010 • • • • I frammenti più abbondanti, soprattutto materni, sono lunghi 166 bp Il DNA fetale mostra una riduzione del picco di 166-bp e un aumento del picco di 143-bp I frammenti fetali e materni <143 bp hanno una periodicità di 10 -bp. Questi dati suggeriscono che i frammenti di DNA isolati dal plasma derivano dalla digestione enzimatica del DNA di cellule in apoptosi DNA materno DNA fetale DNA mitocondriale Applicazioni diagnostiche della NIPD su cffDNA Determinazione del sesso fetale nelle gravidanze a rischio per malattie genetiche X-linked Determinazione del genotipo fetale RHD (Rh blood group, D antigen) in donne Rh D–negative Malattie autosomiche dominanti (Acondroplasia, Morbo di Huntigton, ecc) di origine paterna o de novo Aneuploidie Malattie autosomiche recessive (β-talassemia, Fibrosi Cistica, ecc) Esclusione della mutazione paterna (Coppia con difetti molecolari diversi ) o analisi indiretta Determinazione del genotipo fetale (RMD) Metodologie di analisi del cfDNA Polymerase Chain Reaction ♂ ♂♀ ♀ ♂ Digital PCR e Maldi Tof COLD PCR & Sanger Sequencing x y •Determinazione del sesso fetale •Ricerca del fattore Rh Analisi del Cell free DNA cfDNA DNA)) (cf Real Time PCR Next Generation Sequencing Digital PCR e microfluidic array •Studio di marcatori epigenetici fetali Diagnosi di Trisomia 18 Quantificazione DNA fetale •Targeted MPS •Shotgun MPS Determinazione sesso fetale da DNA Fetale Libero Amplificazione del gene TSPY 1 del gene SRY C+ C+♀ ♀ C+♂ ♂ Amplificazione C+ C+♀ ♀ C+♂ ♂ Analisi di microsatelliti del cromosoma Y nel cffDNA (AmpFlSTR® Yfiler NIPD del sesso fetale in 200 casi Laboratorio Genetica molecolare Cagliari 35 30 Numero di Campioni 25 20 PLASMA xy PLASMA xx 15 falsi negativi 10 5 0 6+ 7+ 8+ 9+ 10+ 11+ 12+ 13+ Settimana di gestazione 14+ 15+ 16+ 17+ Una review promossa dal UK-NHS M Hilla, K Finning, P Martin, J Hogg, C Meaney, G Norbury, G Daniels and LS Chitty • • • • • • • • • • • Risultati NIPD 2006 -2009 in due laboratori dell’NHS del Regno Unito Test eseguiti in 672 gravidanze a rischio (malattie Xlinked, CAH, anomalie ecografiche etc) e comparati con i dati ultrasonografici, i test invasivi o il fenotipo alla nascita in 500 casi su 672 3/6 test eseguiti prima della 7° settimana di gestazione sono risultati discordanti I anno: risultati concordanti in 130/135 casi (96.3%) II-III anno: risultati concordanti in 401/403 casi (99.5%) RTPCR dei geni SRY o DYS14 41.1% delle donne a rischio per malattie X-linked (esclusa l’emofilia) e 30.5% a rischio per Adrenal Iperplasia Congenita ha deciso di eseguire il test invasivo Considerazioni: Il test eseguito in lab del NHS è molto attendibile Deve essere eseguito preferibilmente dopo la 7° settimana di gestazione Esame ultrasonografico prima del test per esclusione gravidanze multiple Poichè nel 4% dei casi l’esito è stato inconclusivo, si consiglia di informare la coppia riguardo al rischio di dover ripetere il test e alla possibilità di errore Diagnosi Prenatale Non Invasiva Fattore RH A5 EX 7 141 bp A6 A5 EX.5 D6 133 bp D7 141 bp A6 EX.5 EX.7 A7 A8 96 bp A5 141 bp A6 EX.5 Frammento di controllo 235 bp (gene beta) Frammento 133 bp (gene RHD) Frammento 141 bp (gene RHD+RHCE) Frammento 96 bp (gene RHD) Monitoraggio della presenza di DNAY durante la gravidanza-vanishing twin EPOCA GESTAZ RHD PCR TSPY1 PCR SRY PCR SRY REAL TIME PCR 14^SETT RHD+ XY XX XY 17^SETT RHD+ XY XX XY 21^SETT RDH+ XX - XX 25^SETT RDH+ XX - XX 30^SETT RDH+ XX - XX La gravidanza deve essere attentamente monitorata per escludere una gravidanza gemellare (vanishing twin) Review del SDS, laboratorio olandese di riferimento 2011 Obiettivo: Valutazione della performance diagnostica del test di genotipizzazione dal 2003 al 2010 Sede: Laboratorio nazionale di riferimento per le gravidanze con complicanza da alloimmunizzazione (Nederland) Casistica: Test di genotipizzazione eseguito in 362 donne in gravidanza alloimmunizzate (geni Rh e gene di controllo SRY o altro marker paterno) La NIPD dei genotipi rhesus D, E, c e K in donne alloimmunizzate è accurato e applicabile nella pratica clinica. L’algoritmo diagnostico ha dato risultati conclusivi in 351/362 casi. No falsi-positivi o falsi-negativi, 11 inconclusivi • • • 98% dei casi mutazione c.1138G > A nel dominio transmembrana del gene FGFR-3 Casi sporadici con mutazione de novo di origine paterna Diagnosi nel III° trimestre tramite ultrasonografia Obiettivo dello studio: Definire la frequenza dei tratti sonografici fetali associati con l’acondroplasia e mettere a punto un approccio diagnostico non invasivo in epoca prenatale Risultati ultrasonografici (26 casi): lunghezza del femore nel o sotto il 3° percentile (25 wg) e sotto il 3° percentile alla 30a wg. Circonferenza cranica sopra il 50° percentile con tendenza ad aumentare oltre il 95° percentile. Arcuatura del femore, sporgenza frontale, dita corte, torace piccolo e polidramnios Risultati NIPD (6 casi): presenza della mutazione c.1138G > A in 4/6 casi NIPD e correlazione genotipo fenotipo ecografico Objective: ..improve the prenatal diagnosis of thanatophoric dysplasia by defining the change in fetal size across gestation and the frequency of sonographic features ..develop non-invasive molecular genetic diagnosis based on cellfree fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma. Conclusion: These data should improve the accuracy of the sonographic diagnosis of thanatophoric dysplasia and have implications for reliable and safe targeted molecular confirmation using cfDNA. a view of the thorax demonstrating short ribs femur length achondroplasia thanatophoric dysplasia femur demonstrating slight bowing 2012 65 samples: samples: 45 ♂ and 20 ♀ ♂ Sickle cell genotype correctly determined in 82% of male fetuses and 75% of female fetuses Genotype correctly determined (100%) in cases with fetal DNA fraction > 7% ♀ Optimization of the fractional fetal DNA is essential Increase the number of informative markers in case of a female fetus Genotype for each classification for malemale-bearing (A) and femalefemale-bearing (B) pregnancies Extend the approach to other autosomal recessive disorders Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Relative dosage haplotype analysis 2012 Clinical Chemistry 58:10 (2012) Obiettivi: • Demonstrate the feasibility of the targeted RHDO (Relative Haplotype Dosage analysis) process • Develop the algorithms for applying the RHDO process to cases in which the father and mother are both heterozygous for the analyzed SNPs in a genomic region • Achieve these goals in families in which the parental haplotype structures had been elucidated directly with parental genomic DNA via digital PCR • * due famiglie esaminate Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Feasibility Study of Semiconductor Sequencing for Noninvasive Prenatal Diagnosis of β-Thalassemia Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Sample collection and processing 1. Enrollment of couples at risk for β-thalassemia (6^6^- 11^ gestational age) age) 2. 1515-20 ml of maternal blood samples collected before chorionic villus sampling sampling,, after informed consent 3. Plasma separation (7(7-9 ml) and storage at -80 °C 4. Cell Cell--free DNA extraction by Kit Qiagen Circulating Nucleic acid 5. DNA Quantification by RealReal-time PCR 6. Ion Amplicon Amplicon--library preparation (plasma +trio) 7. Sequencing by Ion Torrent 8. Sequencing results analysis (Torrent Suite™ Software, IGV) Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Library preparation (51 amplicons) Chr 11 Cluster HBB = 48 amplicons (85(85-197 bp bp)) rs10837628 rs12364872 rs2187610 rs78928216 rs11036351 3' gene β rs7110263 rs10837631 3' gene β rs1609812 rs12788013 3' gene β 3' gene β rs7480526 rs10768683 IVSII NT666 IVS II NT16 rs7946748 IVS II NT76 IVS II NT81 No_rs rs35004220 rs76728603 IVSI 110 rs63749819 rs121909811 EX1 cod2(C/T) EX2 β 76 EX1 β 6(-A) rs139703273 EX2 β 39 5'gene beta 5'gene β -87 5'gene β rs16911905 rs11036364 rs33941377 rs16911905 rs10742583 5'gene rs3813727 rs4910736 rs2105819 rs968857 rs968856 rs10768687 rs73402614 rs10128556 rs2070972 rs113425530 rs3759071 rs3759070 (139 bp bp)) 5'gene gene pseudoβ β gene pseudoβ β rs2071348 rs12417960 rs10488676 rs6578592 rs916111 rs28379094 rs2855039 gene Gγ rs113047906 gene Gγ rs2855126 gene Gγ rs7482144 rs2255519 gene Gγ rs2011051 gene Gγ rs2855123 rs2855122 rs5010979 rs4910740 rs5010980 rs4910546 gene ε rs7481986 gene ε rs7479652 (88 bp bp)) ZFY (88 bp bp)) ZFX ZFX SRY Chr X (175 bp bp)) Chr Y TSPY BamHI Ava II HINC II HIND III HINC II β δ ψβ Gγ Aγ ε Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Amplicons Pooling rs10837628 rs2187610 rs12364872 3' gene β rs7110263 rs10837631 rs78928216 rs11036351 3' gene β rs1609812 rs12788013 3' gene β 3' gene β rs7480526 rs10768683 IVSII NT666 IVS II NT16 rs7946748 IVS II NT76 IVS II NT81 rs35004220 rs76728603 No_rs rs121909811 IVSI 110 rs63749819 EX2 β 76 EX1 cod2(C/T) rs139703273 EX2 β 39 EX1 β 6(-A) 5'gene β -87 5'gene β rs16911905 rs11036364 rs33941377 rs16911905 rs10742583 5'gene beta 5'gene rs10128556 rs73402614 rs10768687 rs968856 rs968857 rs2105819 rs4910736 rs3813727 5'gene gene pseudoβ β gene pseudoβ β rs2071348 rs12417960 rs10488676 rs6578592 rs916111 rs28379094 rs2855039 gene Gγ rs113047906 rs2070972 rs113425530 gene Gγ rs2855126 gene Gγ rs7482144 rs2255519 gene Gγ rs2011051 gene Gγ rs2855123 rs2855122 rs5010979 rs4910740 rs5010980 rs4910546 rs3759071 rs3759070 rs7481986 gene ε rs7479652 gene ε Barcoding Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Father Mother Trophoblast cfDNA DNA Emulsion PCR Sequencing Results Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Paternal IVS 11-110 mutation detection in a compound heterozygote sample β39/IVS1.110 β IVS 1.110 detection Genotypes IVS 1.110 / N Father 100% β 39 / N IVS 1.110 / β 39 Mother Fetal DNA 90% 80% PADRE MADRE DNA da PLASMA villo Total reads count 2409 5957 2382 29593 WT allele(G) 1303 5952 1331 28099 Mutant allele(A) 1054 0 1027 1475 Non evaluable 52 5 24 19 WT allele (G) 45 % WT allele (G) 100 % 70% WT allele (G) 56 % 60% WT allele (G) 95 % 50% 40% 30% % Mutant allele(A) 55 0 44 5 20% % WT allele (G) 45 100 56 95 10% Mutant Allele (A) 55 % Mutant Allele (A) 44 % Mutant Allele (A) 5 % 0% PADRE MADRE DNA da villo PLASMA Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Dosaggio quantitativo degli alleli RHDO Relative Haplotype Dosage ε Gγ Aγ ψβ δ RMD Relative Mutation Dosage β Maternally inherited haplotype ε Gγ Aγ ψβ δ β ε Gγ Aγ ψβ δ β Paternally inherited haplotype Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Genotipo fetale risultati analisi RHDO/SPRT All. pat. ereditato All. mat. ereditato Diagnosi β IVS I.110 β°39 Affetto β IVS I.110 β°39 Affetto HbS β°39 Affetto HbS β°39 Affetto β IVS I.110 β°39 Affetto β IVS I.110 β°39 Affetto β°39 β°39 Affetto β°39 β°39 Affetto β IVS II.745 WT Portatore β IVS II.745 WT Portatore WT β°39 Portatore β°39 WT Portatore WT β°39 Portatore WT β°39 Portatore WT WT Normale WT WT Normale WT WT Normale WT WT Normale WT β°39 Portatore WT No SNP aplotipo materno WT WT Normale WT No SNP aplotipo materno β°39 β°39 Affetto β°39 No SNP aplotipo materno β°39 β°6 Affetto β°39 No SNP aplotipo materno β°39 β°39 Affetto β°39 No SNP aplotipo paterno WT β°39 Portatore WT No SNP aplotipo paterno β°39 β°39 Affetto β°39 No SNP aplotipo paterno WT β°39 Portatore WT WT Normale 6° settimana gestazione WT β°39 2-3% quota fetale Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Sviluppo di algoritmi dedicati SPRT Sequential probability ratio test Valuta consistenza dell’ipotesi di trasmissione dell’aplotipo materno Curve boundary e SNP dati cumulativi 0,70 Reads of HapI alleles/total reads 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 Reads counts Maria Cristina Rosatelli Dipartimento di Sanità pubblica, Medicina clinica e molecolaremolecolare-Università di Cagliari Il dosaggio della componente fetale è fondamentale Percentuale fetale < 5% inficia il risultato Per la valutazione sono usati Real time /Digital PCR dei geni SRY nei maschi e/o di geni differenzialmente metilati come il gene maspin (SERPINB5) o RASSF1 Non invasive prenatal testing for fetal aneuploidy detection Method: Massive Parallel Sequencing Whole genome seq (shotgun) Targeted seq Targeted SNP seq Digital analysis of selected regions (DANSR) Lo sviluppo di nuovi algoritmi e analisi bioinformatiche dedicate deve progredire di pari passo con lo sviluppo tecnologico 2011 In all, 449 samples remained: 39 trisomy 21 samples were correctly classified; 1 sample was misclassified as trisomy 21. The overall classification showed 100% sensitivity (95% confidence interval, 89–100%) and 99.7% specificity (95% confidence interval, 98.5–99.9%). Our data show that a noninvasive prenatal trisomy 21 test from ccff DNA might be used in concert with other clinical assessments, such as ultrasound, and become an option to better identify those women who would, or would not, benefit from confirmatory invasive diagnostic tests. Studi di validazione Melissa 2012 Obstet Gynecol 2012;119 Studi di validazione CONCLUSION This prospective study demonstrates the efficacy of massively parallel CONCLUSION: sequencing of maternal plasma DNA to detect fetal aneuploidy for multiple chromosomes across the genome. The high sensitivity and specificity for the detection of trisomies 21, 18, 13, and monosomy X suggest that massively parallel sequencing can be incorporated into existing aneuploidy screening algorithms to reduce unnecessary invasive procedures. Targeted sequencing by multiplex PCR of 19488 SNP Results were provided for 229 (94.6%) of the 242 cases. Thirty-two cases were correctly identified as aneuploid: Trisomy 21 [n = 25; sensitivity = 100% (CI: 86.3–100%), specificity = 100% (CI: 98.2– 100%)], Trisomy 18 (n = 3), Trisomy 13 (n = 1), Turner syndrome (n = 2), Triploidy (n = 1), with no false positive or false negative results. Median accuracy was 99.9% (range: 96.0–100%). Conclusions: cfDNA testing in maternal blood using targeted sequencing of polymorphic loci at chromosomes 13, 18, 21, X, and Y holds promise for accurate detection of fetal autosomal trisomies, sex chromosome aneuploidies, and triploidy. Targeted sequencing Deep Sequencing Detection of fetal subchromosome abnormalities across the genome from a maternal blood sample. “We demostrate that in nonmosaic cases, it is possible to obtain a fetal molecular karyotype by MPS of maternal plasma cfDNA that is equivalent to a chromosome microarray and in some cases is better than a metaphase karyotype. This approach combines the advantage of enhanced fetal genomic resolution with the improved safety of a noninvasive maternal blood test.” From: “Noninvasive Detection of Fetal Subchromosome Abnormalities via Deep Sequencing of Maternal Plasma. Srinivasan A et al, AJHG 2013 (Verinata Health) Ca USA Non Invasive Prenatal Screening (NIPS) of cfDNA Screening prenatali NIPS e Marketing Headquartered in San Jose, California Sede: USA Sede: Germania •Your physician takes 20 ml blood from you, after you were informed in detail and subjected to genetic counseling by your physician and have signed the declaration of consent for the PrenaTest®. •This blood is sent to the LifeCodexx diagnostics laboratory. •The analysis generally takes two weeks . •Your physician then receives a letter with the result and will inform you about the outcome of the analysis. Laboratori in Europa Total price of laboratory DNA testing for the prenatal paternity test on blood is only $990.00 Total price of laboratory DNA testing for baby gender test determination is $320.00 Head office: TORONTO Aneuploidy screening Recommandation e Guidelines In the USA it has been recommended that amniocentesis or CVS should be available to all woman whether or not they had aneuploidy screening In most developed countries it is routine practice to provide a woman’s personal risk for fetal aneuploidy through aneuploidy screening prior to invasive testing Fetal aneuploidy risk is evaluated on the basis of a combination of: • Maternal age • Previous affected pregnancy or family history • Maternal serum biochemical tests • Fetal ultrasound markers The screening is not fully diagnostic Position Statement from the Aneuploidy Screening Committee on Behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis, April 2013 Sensibilità, specificità e DR sono molto elevate per T21 ma si riducono per T18 e T13 ISPD Statement: NIPS • Only those cfDNA analyses based on MPS with either “shotgun” counting of all free DNA or “targeted” counting of specific DNA sequences have been sufficiently validated in trials to be considered analytically sound. • Reliable non-invasive maternal cfDNA aneuploidy screening have only been reported for trisomy 21 and 18 • The tests should not be considered to be fully diagnostic and therefore are not a replacement for amniocentesis and CVS. Some affected pregnancies may not be detected and there may be false-positive results ISPD Statement: NIPS • Analytic validity trials mostly focused on patients at high risk on the basis of maternal age or other screening tests. Efficacy in low risk populations has not yet been fully demonstrated • There is insufficient information in multiple gestation pregnancies • In cases where mosaicism is present results may be inaccurate • In a proportion of cases there is insufficient fetal cfDNA in the maternal plasma specimen or there is test failure for other reasons • Specific independently developed laboratory minimum standards, quality control, proficiency testing and inspection requirements have not yet been developed ISPD Statement: NIPS Women interested in such testing should receive detailed counseling that explains the benefits and limitations of the test. They have been informed that these tests are still under clinical development Information that must be provided to the pregnant woman includes: • The testing currently available is mostly focused on the detection of fetal trisomies 21, 18, and 13. • Although detection rates are high, the test does not detect all cases of fetal trisomy 21, 18 and 13 • Although false-positive rates are low, there will be occasional falsepositive results and therefore women with positive cfDNA screening results should be offered confirmatory fetal chromosome analysis either through an amniocentesis or CVS. • For some women the cfDNA screening test may not be informative and these patients may then need to consider invasive testing. In particular, women with an increased body mass index are at high risk of test failure or an inconclusive result. • For late gestational age women, there may be insufficient time for a repeat screening test and/or invasive testing. ISPD Statement: NIPS ……Summary • Definitive diagnosis of Down syndrome and other fetal aneuploidies can only be achieved through amniocentesis or CVS • Maternal cfDNA screening is an emerging technology that can provide highly effective prenatal screening for Down syndrome, trisomy 18, and possibly trisomy 13 in high risk women. It is not a replacement for the analysis of amniotic fluid cells or CVS. Policy Statement of the American College of Medical Genetics and Genomics Statement of the American College of Obstetricians an d Gynecologist Conclusioni NIPS non è un test diagnostico, ma come test di screening presenta una alta sensibilità e specificità Rispetto allo screening tradizionale (biochimico-ecografico presenta i seguenti vantaggi - detection rate più alta - valore predittivo negativo per T21 alto (importante per chi vuole evitare DPN invasiva) - bassi falsi positivi - è meno dipendente dall'età gestazionale rispetto agli screening tradizionali (si può accedere dalla 10 settimana in poi, anche dopo la 20) Il test NIPS non è un test di routine ma può essere una scelta della coppia. Durante la consulenza genetica pre test (irrinunciabile) deve essere chiaramente sottolineato che: il test studia solo le trisomie più frequenti e non da altre informazioni genetiche sul feto una accurata storia familiare deve essere ottenuta prima della diagnosi per valutare l’appropriatezza dell’approccio diagnostico un test negativo non assicura assenza di patologia un test positivo necessita di conferma diagnostica con approccio invasivo la quantità di plasma fetale può esser insufficiente all’esecuzione del test il test NIPS non sostituisce la DPN (con amniocentesi o villocentesi) che deve rimanere una opzione percorribile in caso di anomalie ecografiche fetali resta indicata la DPN invasiva Patent landscape of cffDNA-based NIPT
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