A.O.R.N. “GAETANO RUMMO” – BENEVENTO U.O.C. DI GENETICA MEDICA CITOGENETICA MEDICA E GENETICA MOLECOLARE INDAGINI MOLECOLARI NELLA DIAGNOSI PRENATALE Dr. Fortunato Lonardo Diagnosi Prenatale: Definizione La diagnosi prenatale e' un complesso di indagini strumentali e di laboratorio finalizzate al monitoraggio dello stato di salute del concepito durante tutto l'arco della gravidanza e pertanto permette l'individuazione di definite patologie, siano esse su base ereditaria, infettiva, iatrogena o ambientale (ISS Linee guida 1998). La diagnosi prenatale consente di predisporre la prevenzione della nascita di feti affetti e, laddove presenti, gli interventi terapeutici ottimali per il trattamento del feto/neonato affetto sia in utero che alla nascita (SIDiP Linee guida 2006). La diagnosi prenatale The fundamental philosophy of prenatal genetic diagnosis is to provide reassurance to couples at risk that they may selectively have unaffected children even if their procreative risk for having defective offspring is unacceptably high. (The prenatal diagnosis of hereditary disorders. Aubrey Milunsky, Charles C Thomas, Springfield, Illinois, 1973.) Caratteristiche peculiari della diagnosi genetica prenatale (1): a) la diagnosi prenatale viene effettuata non sulla persona che ne fa richiesta, bensì su un soggetto, che nell'attuale legislazione, non ha riconoscimento giuridico; b) la diagnosi prenatale, in considerazione dell'epoca in cui si effettuano le indagini, non consente di correlare in tempo reale il fenotipo con il genotipo. Pertanto in alcuni casi (es. malformazioni ecografiche) non e' possibile formulare una precisa diagnosi clinica; qualora si applichino i test genetici questi consentono di identificare lo specifico difetto (es. anomalia cromosomica, mutazione genica ecc.) e hanno quindi un valore diagnostico anche se il fenotipo potra' essere verificato con certezza al momento della nascita a termine (o dopo interruzione di gravidanza). Nelle patologie ad insorgenza tardiva (es. malattia di Huntington, distrofia miotonica, ecc.) il test genetico si configura tra quelli di tipo "presintomatico"; Caratteristiche peculiari della diagnosi genetica prenatale (2): c) la diagnosi prenatale deve essere eseguita entro tempi molto piu' ristretti rispetto al periodo post-natale; d) e' possibile che la diagnosi di feto affetto si basi sul referto di un solo test genetico e su questa sola informazione la gestante/coppia puo' scegliere se continuare o interrompere la gravidanza. Non vi e' altra situazione nella vita di un uomo in cui una malattia venga diagnosticata utilizzando un solo test; questo pone la gestante/coppia ma anche il personale sanitario, in una situazione psicologica particolarmente complessa e delicata; Caratteristiche peculiari della diagnosi genetica prenatale (3): e) l'utilizzo di metodi invasivi fa di per sé prevedere rischi per l'incolumità del concepito. Queste considerazioni impongono il raggiungimento dei livelli massimi di qualità degli interventi di consulenza, prelievo fetale, analisi genetica, ed assistenza che devono essere efficacemente coordinati. La coppia deve essere informata di tali rischi e ricevere indicazioni appropriate. Principi di diagnosi prenatale Lo scopo della diagnosi prenatale è quello di offrire ai genitori e al medico le migliori informazioni possibili sui rischi di dare alla luce un bambino affetto da un‘ anomalia congenita o da una malattia genetica. Possiamo dividere le tecniche di diagnosi prenatale in due tipi: quelle invasive e quelle non invasive. Si dice non invasiva una tecnica che permette di analizzare il feto "dall'esterno", senza rischi di alterazioni o danni per la madre o per il nascituro. Le metodiche di diagnosi prenatale non invasive attualmente più in uso sono basate sull'ecografia. Principi di diagnosi prenatale (2) Si dice invasiva una tecnica di diagnosi prenatale che comporta la penetrazione nella cavità uterina. Le metodiche di diagnosi prenatale invasive più utilizzate sono l'amniocentesi (prelievo di liquido amniotico), la villocentesi (prelievo dei villi coriali) e la funicolocentesi (prelievo di sangue fetale). I termini indicati non si riferiscono a tecniche di analisi, ma a procedure di prelievo, che permettono di ottennere materiale di origine fetale: cellule, liquidi o tessuti biologici. Il campione verrà poi analizzato in laboratorio utilizzando a seconda dei casi tecniche biochimiche, citogenetiche o molecolari. L’amniocentesi L'amniocentesi consiste nel prelievo, mediante un ago sottile, di liquido amniotico, cioè del liquido che circonda il feto all'interno dell'utero. L'ago viene introdotto di solito attraverso l'addome, tutta l'operazione viene guidata tramite ecografia, per evitare di procurare danni al feto o alla madre. Nel liquido amniotico si trovano alcune cellule fetali (chiamate amniociti), che vengono prelevate ed utilizzate per le analisi citogenetiche e/o molecolari. L’amniocentesi L'amniocentesi non è un procedimento doloroso (più o meno come una normale puntura), è veloce e si pratica senza anestesia. L'amniocentesi si può praticare a partire dalla 15a - 16a settimana di gravidanza. Come tutte le procedure invasive presenta un certo rischio di aborto spontaneo, calcolato intorno allo 0,5-1,0% (se praticata da personale esperto in centri ben attrezzati). Per questo motivo, oltre che per il costo, l'amniocentesi non viene offerta di routine a tutte le madri, ma solo nei casi considerati a rischio. La villocentesi La villocentesi è una procedura che consiste nel prelievo di un minuscolo frammento di tessuto dalla placenta (o meglio dal corion, la parte di placenta che "appartiene" al feto). Il prelievo avviene per via transcervicale (cioè attraverso la cervice uterina) o per via transaddominale (come l'amniocentesi), a seconda della posizione della placenta. Le cellule fetali ottenute con il prelievo vengono poi utilizzate per le indagini citogenetiche e/o molecolari. Rispetto all'amniocentesi, il prelievo dei villi coriali offe il vantaggio di poter essere effettuato più precocemente (intorno alla 10a - 12a settimana di gravidanza). Presenta però un rischio più elevato di aborto: circa il 1-2 %. Inoltre non consente di effettuare indagini biochimiche sul liquido amniotico. Generalmente, il prelievo dei villi coriali si utilizza quando il rischio di malattie genetiche è elevato. La funicolocentesi La funicolocentesi, o cordocentesi, consiste nel prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale. Si pratica per via transaddominale sotto guida ecografica a partire dalla 18a settimana. L’incidenza di aborto è calcolata intorno al 2-3% Si utilizza principalmente quando l’approccio alla diagnosi prenatale avviene in un’ epoca gestazionale avanzata, ma ancora utile per un’eventuale interruzione della gravidanza (fallimento della coltura dopo amniocentesi, mosaicismi cromosomici nelle colture di amniociti, riscontro ecografico di malformazioni fetali) Si può effettuare anche in un’epoca gestazionale ancora più avanzata nel caso in cui l’eventuale presenza di un’ anomalia cromosomica possa modificare sostanzialmente la condotta ostetrica. In passato veniva utilizzata anche la diagnosi di alcune malattie ereditarie del sangue (emoglobinopatie) o per verificare lo stato di salute del feto nel caso in cui la mamma avesse contratto alcune gravi malattie infettive durante la gravidanza. Indicazioni prenatali Età materna = o > a 35 anni alla nascita precedente figlio affetto da una anomalia cromosomica genitore eterozigote per una anomalia cromosomica strutturale bilanciata Genitore portatore di un marcatore cromosomico sovrannumerario genitore con mosaicismo cromosomico anomalie fetali e “soft markers” evidenziati ecograficamente indagini biochimiche sul siero materno suggestive di un aumento del rischio di patologia cromosomica nel feto Rischio di malattie mendeliane da instabilità cromosomica Altre condizioni, da valutare in sede di consulenza genetica La diagnosi prenatale rapida delle anepuploidie Per ridurre i tempi di risposta (poche ore/1-2 giorni) sono state proposte varie metodiche in grado di individuare rapidamente le più importanti aneuploidie (cromosomi 21, 18, 13, X e Y). Interphase Fluoresence In Situ Hybridation (FISH) Muliplex Ligation-Dependent Amplification (MLPA) Quantitative Fluorescence PCR (QF-PCR) FISH MLPA www.mlpa.com MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Un nuovo metodo economico e sensibile per individuare anomalie quantitative degli acidi nucleici A cosa serve? Con la MLPA è possibile effettuare una reazione PCR multiplex nella quale viene determinata simultaneamente la quantità di più sequenze (fino a 45). I prodotti dell’amplificazione sono separati mediante elettroforesi capillare. Dal momento che si usa una sola coppia di primers, le reazioni MLPA risultano in un pattern elettroforetico molto riproducibile, con frammenti che variano da 130 a 490 bp. La comparazione del pattern ottenuto con quello di un campione di controllo consente di individuare quale sequenza eventualmente è presente in un numero di copie anomalo. Come funziona? Nella MLPA non viene amplificato il campione di DNA, ma le sonde. Mediante ibridazione delle sonde alla sequenza bersaglio, seguita da una reazione di legame (ligation reaction) viene effettuata una copia di ciascuna sequenza bersaglio presente nel campione (solo le sonde legate vengono amplificate nella PCR multiplex). La MLPA consente di amplificare simultaneamente tutte le sequenze specifiche di interesse. La reazione di PCR è molto robusta in quanto viene usata una sola coppia di primer per amplificare tutti i frammenti. I frammenti amplificati hanno dimensioni comprese tra 130 e 490 bp e vengono analizzati mediante elettroforesi capillare. Per ciascuna delle sequenze che vogliamo individuare e quantizzare, aggiungiamo al campione da analizzare una sonda specifica per MLPA. Queste sonde consistono in due oligonucleotidi complementari alla sequenza bersaglio, in grado di legarsi in due siti immediatamente adiacenti l’uno all’altro. Ciascuno di questi due oligonucleotidi contiene una delle due sequenze riconosciute dai primer per la PCR. I due oligonucleotidi possono essere legati tra di loro da una specifica ligasi, ma solo quando sono entrambi ibridati, in posizione adiacente, alla sequenza target. Le sonde legate alle sequenze target vengono quindi amplificate (in maniera direttamente proporzionale alla quantità iniziale delle sequenze target). La taglia di ciascun amplificato è predeterminata e nota. Le sonde non legate ed il restante DNA del campione non vengono amplificati. Elettroforesi capillare • Ogni picco rappresenta il prodotto dell’amplificazione di una specifica sonda. • I campioni vengono comparati con un DNA normale di controllo. • Una differenza nell’altezza o nell’area relativa di un picco indica una variazione nel numero di copie della sequenza target della sonda. I risultati La PCR Quantitativa in fluorescenza La QF-PCR consiste nell’amplificazione in vitro, in maniera quantitativa, di particolari sequenze di DNA: ”Short Tandem Repeats (STR)”, specifiche per ogni cromosoma da studiare. Queste sequenze ripetute sono distribuite lungo tutto il genoma e sono altamente polimorfiche (cioè hanno numerosi alleli che differiscono nella lunghezza per la presenza di un numero di ripetizioni differente). La PCR Quantitativa in fluorescenza L’amplificazione mediante PCR produce particolari ampliconi che hanno la caratteristica di essere fluorescenti. Ciò consente di rilevarli utilizzando analizzatori genetici, che eseguono in automatico una elettroforesi capillare. La PCR Quantitativa in fluorescenza La quantità e le dimensioni degli amplificati vengono riportate in un grafico (elettroferogramma). Dal tracciato elettroforetico si può risalire al numero di STR (e quindi di cromosomi) presenti nel campione. Interpretazione Ratio Non informativo (1 Allele) Normale (2 Alleli) 1:1 Trisomia (2 Alleli, rapp. anomalo) 2:1 Trisomia (3 Alleli) 1:1:1 Risultato normale 60 bp (15 x 4bp) Allele 1 296bp 112bp 36bp (9 x 4bp) Allele 2 124bp 124bp 272bp 112bp Due alleli - eterozigote 28bp (7 x 4bp) Allele 1 264bp 112bp 28bp (7 x 4bp) Allele 2 124bp 112bp Due alleli - omozigote 124bp 264bp Risultato patologico 48 bp (12 x 4bp) Allele 1 44 bp (11 x 4bp) Allele 2 124bp 112bp 28bp (7 x 4bp) Allele 3 124bp 112bp 124bp 284bp 280bp 264bp 112bp Pattern trisomico – triallelico 60 bp (15 x 4bp) Allele 1 36bp (9 x 4bp) Allele 2 72bp 72bp 36bp (9 x 4bp) Allele 3 72bp 72bp 72bp Pattern trisomico – biallelico 72bp 204bp 180bp 180bp Devyser™ Complete Femmina normale – 7X ratio = 1:1 Maschio normale – 7X ratio = 2:1 Il test Lettura dell’Amplificato mediante Elettroforesi Capillare Dopo l’amplificazione il campione viene preparato per l’introduzione nell’analizzatore; Viene programmato l’analizzatore; I prodotti dell’amplificazione vengono osservati con un sistema che rileva i fluorocromi Fam (blu), Vic (verde), Ned (giallo), Pet (rosso); Per L’analisi dei dati vengono utilizzati i programmi GeneMapper 3.7 e DevyserTM Decision Base. Risultati Localizzazione cromosomica dei marcatori utilizzati Risultati Prenatal BoBs BACs-onBeads™ (PerkinElmer) Risultati Prenatal BoBs Fluorescent phyco-erythrin reporter tag Laser Risultati Risultati Prenatal BoBs S. delle Arterie Tortuose: identificazione di una nuova mutazione nel gene SLC2A10 in corso di gravidanza a rischio #208050 ARTERIAL TORTUOSITY SYNDROME; ATS CGH-Array CGH-Array Position statement (2012) CMA analysis can be considered a secondtier diagnostic test to be used after standard karyotyping in selected groups of pregnancies, namely those with single (apparently isolated) or multiple ultrasound fetal abnormalities, those with de novo chromosomal rearrangements, even if apparently balanced, and those with supernumerary marker chromosomes. Diagnosi prenatale non invasiva http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2012.10.013,
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