Lezione 7 (13 ottobre 2014)

A
La respirazione
La respirazione (aerobica) è un processo di ossido-riduzione
Con la RESPIRAZIONE si genera un gradiente di pH e un potenziale
elettrochimico che causano l’energizzazione della membrana (in modo simile ad
una batteria) e parte di questa energia può essere conservata dalla cellula
Così come lo stato di energia di una batteria è espresso in termini di forza
elettromotrice (in volt), così lo stato energizzato della membrana viene espresso
in termini di forza proton-motrice (pure in volt)
Peter Mitchell nel 1961 propose la teoria della chemiosmosi, secondo la
quale la forza per indurre la sintesi di ATP risiede nel gradiente protonico
1
OUT
A RESPIRAZIONE:
catena di trasporto
ATP
degli elettroni
SINTASI
Al posto dell’ossigeno si
possono avere altri accettori
finali di
Mn4+,
IN
e-
Ferro-proteina
NON EME
eCoenzima Q
O2
e-
Citocromo (EME)
e-
NO3-,
SO42-, Fe3+,
CO2, S° ...
:
http://www.youtube.com/
watch?v=oyR-cMu6DfQ
Flavoproteina
e-
e-
http://www.youtube.com/w
atch?v=PjdPTY1wHdQ
http://www.youtube.com/w
atch?v=3y1dO4nNaKY
2
B La fermentazione
È un processo metabolico anaerobico in cui il donatore e l’accettore di elettroni (e-)
sono molecole organiche. Più precisamente, nel corso della fermentazione, un
composto organico funge da donatore di e-, ossidandosi e generando nel contempo
NADH (cioè NAD in forma ridotta). Il piridindinucleotide ridotto (NADH) non può
scaricare i suoi e- sulla catena di trasporto; perciò, per rigenerare il pool di NAD+
necessario alla cellula per
proseguimento del COME
processo,
avviene la riossidazione del
LAil FERMENTAZIONE
PROCESSO
NADH a spese di un composto intermedio del processo, che funge da accettore di e-.
OSSIDO-RIDUTTIVO BILANCIATO AL SUO INTERNO
La FERMENTAZIONE è quindi un processo ossido-riduttivo bilanciato al suo
interno
sostanza organica
prodotto finale
NAD+
NADH
ATP
La fermentazione è un processo metabolico anaerobico tipico di microrganismi
anaerobi obbligati (es. Bifidobacteria spp.). Inoltre, molti anaerobi facoltativi (es. E.
coli ), per la loro flessibilità metabolica, possono attuare la respirazione in aerobiosi e
la fermentazione in assenza di O2
3
B
La fermentazione
Nella fermentazione non si ha la completa demolizione del composto di partenza,
che viene solo parzialmente fermentato in uno o più prodotti finali per lo più ancora
organici, che mantengono ancora parte dell’energia del composto iniziale. Pertanto
la resa energetica della fermentazione non è paragonabile a quella dei processi
respiratori e l’ATP viene generato soltanto per trasferimento di un gruppo
fosfato legato ad un intermedio del processo con un legame ad alto contenuto
energetico all’ADP (fosforilazione a livello di substrato)
Rese teoriche in ATP per molecola di glucosio
RESPIRAZIONE: 36-38 molecole teoriche di ATP (2 da glicolisi, 2 dal ciclo di Krebs
(GTP) e 32-34 dalla catena di trasporto degli elettroni)
FERMENTAZIONE ALCOLICA e LATTICA: 2 ATP
FERMENTAZIONE dei BIFIDOBATTERI: 2,5 ATP
Il metabolismo respiratorio è circa 15 volte più efficiente del metabolismo fermentativo
4
B
La fermentazione
La glicolisi è la principale via che precede numerose fermentazioni. Per la maggior parte dei
processi fermentativi la stessa glicolisi è anche la via che frutta alle cellule l’energia, scopo del
processo metabolico (2 moli di ATP per mole di glucosio fermentato) attraverso le già citate reazioni
di fosforilazione a livello di substrato. Le tappe successive della fermentazione hanno invece lo
scopo di consentire la riossidazione delle due moli di NADH, prodotte nell’ossidazione della 3fosfo gliceraldeide ad acido 1,3-difosfoglicerico, in quanto nei microrganismi anaerobi la catena di
trasporto degli elettroni è incompleta. Pertanto l’equilibrio ossido-riduttivo si ristabilisce
mediante riossidazione del NADH a spese di un intermedio del processo a valle dell’acido
piruvico. In qualche caso, in questo tratto della fermentazione si ha ulteriore produzione di ATP,
che porta la resa energetica della fermentazione a valori comunque di ben poco superiori a 2
Quasi sempre le varie vie fermentative sono caratteristiche di ben definiti gruppi microbici,
i quali dimostrano un’elevata specificità di processo
5
La fermentazione alcolica
B1
È caratteristicaFERMENTAZIONE
dei lieviti, che sono
eumiceti unicellulari anaerobi facoltativi di cui è
ALCOOLICA
ben noto il genere Saccharomyces. L’enzima-chiave di questa fermentazione è la
piruvato decarbossilasi glucosio
2ATP
2 gliceraldeide-3- P
2 etanolo
NAD+
NADH
2 acetaldeide
2 CO2
NAD +
NADH
2 piruvato
4ATP
Avviene anche nel già
citato batterio Zymomonas
Equazione generale:
glucosio
Resa energetica = 2 ATP
2 etanolo + 2 CO2
6
La fermentazione omolattica
B2
È operata dai batteri omolattici
od omofermentanti, anaerobi
obbligati ossigeno-tolleranti
appartenenti ai generi Gram
positivi Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus…
In questa fermentazione è lo
stesso acido piruvico di origine
glicolitica a fungere da
accettore di elettroni per la
riossidazione del NADH,
riducendosi così ad acido
lattico
lattato deidrogenasi
7
La fermentazione acido-mista
B3
Escherichia,
enterobatteri
come
Salmonella, Shigella e i generi Proteus, Vibrio
e Photobacterium sono microrganismi Gramnegativi anaerobi facoltativi che in anaerobiosi
fermentano il glucosio secondo questa via. I
diversi prodotti finali caratteristici di questo
provesso sono acidi organici a basso peso
molecolare quali acido formico, acido
acetico, acido lattico e acido succinico e
piccole quantità di etanolo (in E. coli e
Proteus l’acido formico è scisso in CO2 e H2
dalla formico idrogenoliasi, un enzima la cui
presenza assume una rilevante importanza
tassonomica e diagnostica)
FERMENTAZIONE ACIDO-MISTAGli
glucosio
2NADH
NADH
succinato
ossaloacetato
2ATP
CO2
fosfoenolpiruvato (PEP)
2ATP
NADH
piruvato
lattato
CoA
NADH
acetaldeide
NADH
acetil-CoA
formiato
etanolo
acetil- P
CO2
H2
ATP
acetato
formico
idrogenoliasi
I rapporti percentuali di questi prodotti variano nei
diversi microrganismi e a seconda delle condizioni
colturali e ambientali, sempre nel rispetto
dell’equilibrio ossido-riduttivo del processo
8
FERMENTAZIONE
2.3-BUTILENGLICOL
B4
La fermentazione 2,3-butilenglicolica
glucosio
2 NADH
NADH
lattato
2 ATP
piruvato
NADH
formiato
acetil-CoA
acetaldeide
NADH
4
etanolo
CO2
H2
Tipica di altre Enterobacteriaceae aventi come habitat
il suolo o le acque (Enterobacter aerogenes e i generi
Erwinia, e Serratia, patogeni delle piante). Il prodotto
principale è il 2,3-butilenglicol che si forma dalla
condensazione di due molecole di piruvato con la
liberazione di due molecole di CO2. In minore
quantità si producono anche gli acidi della precedente
fermentazione accanto a notevoli quantità di etanolo
per il mantenimento dell’equilibrio ossido-riduttivo. In
E. aerogenes è presente la formico idrogenoliasi
CO2
α-acetolattato
L’uso di questa via causa il decremento della
formazione di acidi (il butilenglicole è neutro) e la
formazione dell’intermedio ACETOINO. Coloro che si
occupano di analisi microbiologica dell’acqua possono
distinguere i coliformi fecali (ferm. acidomista) dai non
fecali (ferm. butileglicolica tipica dei generi come
Klebsiella) andando a svelare la presenza di acetoino
ed un pH più alto
CO2
acetoina
acetoino
NADH
2,32,3-butilenglicol
butilenglicole
o butandiolo
B5
9
La fermentazione propionica
FERMENTAZIONE PROPIONICA
VIA DEL METILMALONIL-CoA
in Propionibacterium e Veillonella
1.5 glucosio
3NADH
3ATP
ac. acetico
CO2
NADH
3 CH3 - C O - C OOH
2 HOOC - CH 2 - C O - COOH
3NADH
NA DH
3 C H3 - CHOH - C OOH
2 HOOC - CH 2 - C HOH - COOH
H2 O
2 HOOC - CH -- CH - COOH
Il glucosio viene fermentato ad
acido acetico, CO2 ed acido
propionico
dal
genere
Propionibacterium attraverso una via
complessa
detta
del
metilmalonilCoA. Veillonella, il cui
habitat è il rumine dei bovini, compie
la stessa fermentazione partendo
dall’acido lattico. Altri microrganismi
producono acido propionico da acido
lattico attraverso una via diversa
NA DH
CO 2
B iotina
Biotina
ATP
2 HOOC - CH 2 - C H2 - COOH
2 HOOC - CH 2 - C H2 - CO
2 C H3 - CH2 - COOH
S CoA
Coenzima B 12
2 C H3 - CH2 - CO
SCoA
2 HOOC - CH - CO
CH 3
S CoA
La resa energetica, tra le più
elevate, include anche una mole di
ATP prodotto per fosforilazione
ossidativa tramite una breve catena
di trasporto degli elettroni nella
riduzione del fumarato a succinato
(respirazione del fumarato)
CoA transferasi
Resa energetica = 5 ATP / 1,5 glucosio o 2 ATP / 3 ac. lattico
10
FERMENTAZIONE BUTIRRICA
B6
La fermentazione butirrica
CH3 - CH2 - CH2 - COOH
Si ritrova in Clostridium, sporigeno anaerobio
obbligato ossigeno-intollerante, in grado di
fermentare il glucosio. Caratteristica di questa
via è la produzione di CO2 e H2 nella reazione
del coenzima A (CoASH) con il piruvato. Il
principale prodotto finale è l’acido butirrico, la
cui formazione consente il mantenimento
dell’equilibrio ossido-riduttivo
butirrato
ATP
CH3 - CH2 - CH2 - CO - O - P
butirril fosfato
glucosio
Ferredossina
CoA
Pi
2NADH
CH3 - CH2 - CH2 - CO - CoA
butirril-CoA
2H2
NADH
In altre condizioni e per la presenza di
ferredossina, parte dell’H2 liberato viene
trasportato al NAD+, che si riossida
scaricandosi sui prodotti acidi con
conseguente produzione degli alcooli
corrispondenti
2CH3 - CO - COOH
2FdOX
Ferredossina
idrogenasi
2ATP
2FdRED
2CO2
2CoA
2H+
CH3 - CH CH - CO - CoA
crotonil-CoA
2CH3 - CO - CoA
CoA
H2O
CH3 - CH - CH2 - CO - CoA
CH3 - CO - CH2 - CO - CoA
acetoacetil-CoA
OH
L (+) -β-idrossibutirril-CoA
NADH
Equazione generale: glucosio
butirrato + 2CO2 + 2H2
Alcuni Clostridi producono in particolari
condizioni butanolo e acetone, che sono di
interesse industriale
N.B.: la ferredossina è una ferro-zolfo proteina
che media il trasferimento di elettroni in diverse
reazioni metaboliche
11
Resa: 3 ATP
B7
La fermentazione omoacetica
In alcuni clostridi, il glucosio (1 mole) viene stechiometricamente fermentato a 3 moli
di acetato, una delle quali deriva dalla riduzione delle 2 moli di CO2, che
provengono dalla scissione del piruvato ad acetil-CoA
Non va confusa con la produzione di acido acetico da parte di Acetobacter
e Gluconobaceter, i quali, per produrre acido acetico, non operano una
fermentazione, ma ossidano l’etanolo ad acido acetico per recuperare
potere riducente (NADH + H+)
12
4
B8
Il metabolismo fermentativo dei bifidobatteri
Ha scarsa attività
nei bifidobatteri
È assente nei
bifidobatteri
Aldolasi
Il fruttosio 1,6 bisfosfato
funge da induttore della
lattato deidrogenasi
13
4
Fruttosio-6-P
Pi
B8
H2O
F6PPK (xfp)
Acetil-P
ADP
1
ATP
D-eritrosio-4-P
Diidrossiaceton
transferasi
Fruttosio-6-P
Acetato
D-gliceraldeide-3-P
Via fermetativa di Bifidobacterium
o
via della Fruttosio-6-P Fosfochetolasi
D-sedoeptulosio-7-P
D-xilulosio-5P
D-ribosio-5-P
D-ribulosio-5-P
D-xilulosio-5-P
Pi
2
H2O
F6PPK (xfp)
2 Acetil-P
ADP
2
ATP
Acetate
2 D-gliceraldeide-3-P
ACETATO:LATTATO = 3:2
Formiato
Etanolo
14
I BATTERI LATTICI
Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco
Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico)
prodotto finale del loro metabolismo energetico
Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di
tollerare l’ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno)
Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell’incapacità di
sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell’impossibilità di
produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la
decomposizione dell’H2O2 in H2O e O2
Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale
consente loro di crescere fino a quando il pH raggiunge valori inferiori a 5. Questa
caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la
competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro
specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti
naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive
liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in
alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati,
vino e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa
vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus)
15
Alcuni generi di batteri lattici
Streptococcus
Lactococcus
Oenococcus
Carnobacterium
Pediococcus
Leuconostoc
Enterococcus
Lactobacillus
16
Immagini al SEM
I BATTERI LATTICI
Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici
1 – OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di
utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della
loro fermentazione
2 – ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via
glicolisi in quanto non possiedono l’enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO
ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio
attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto
equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO2. Possono utilizzare anche i
pentosi, nel qual caso senza produzione di CO2. Possono produrre anche piccole
quantità di acido acetico
3 – ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano
attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò
come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l’ossidazione di tali
composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO2
L’acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela
racemica DL
18
Omofermentanti
Zuccheri
Zuccheri pentosi
esosi
X
Eterofermentanti
facoltativi
esosi
Esosi
Eterofermentanti
obbligati
Pentosi
in quantità ridotte
(
)
19
TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI
Terreno MRS a pH 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei
lattobacilli
Terreno SL: selettivo per l’isolamento dei lattobacilli (tripticase,
estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, pH
finale 5,4)
Terreno ATB: adatto per l’isolamento di Oenococcus oeni (peptone,
estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, pH finale 4,8)
Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i
migliori risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di
isolamento in giare di anaerobiosi (Gas-Pak)
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I BATTERI ACETICI
Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae
Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi,
termolabili e psicrotrofi
Sono marcatamente acidofili (crescono fino a pH 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M)
Il pH ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a pH 3 se
l’etanolo è inferiore all’8%
Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti
Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 °C; alcuni
ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 °C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 °C)
Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l’etanolo e molti ceppi
crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da
pH, temperatura e concertazione di O2
I tre generi più noti:
Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum
Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens
Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii
Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis,
Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp.
21
Le specie più importanti nella produzione industriale dell’aceto sono:
- Acetobacter aceti subsp. orleanensis
- Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell’aceto)
- Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis
- Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens
- Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus
In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di
vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali:
1. sono usati per la produzione dell’aceto (usati per convertire intenzionalmente l’etanolo del
vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico)
2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato
(entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita
attraverso la completa eliminazione dell’ossigeno durante la conservazione del vino oppure
con l’aggiunta di moderate quantità di SO2
3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre
aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per
la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale)
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Peculiarità metaboliche
I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione
aerobica)
In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con
ossidazione incompleta dei substrati organici
Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono
etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio
Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH4+
Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato
L’acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un
vero processo di fermentazione
Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad
acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO2,
tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il
COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo)
23
I BATTERI ACETICI
Glucosio
tutto il NADH generato in queste reazioni
di ossidazione è destinato alla catena di
trasporto degli elettroni, per creare il
gradiente di H+ che permette la sintesi
dell’ATP
NAD+
ACIDO LATTICO
pentosi-P
interconversione non ossidativa
triosi-P
ultime tappe della glicolisi
NADH+H+
lattato deidrogenasi
NAD+
ETANOLO
via del pentosio fosfato
NADH+H+
alcol deidrogenasi
Ac. piruvico
decarbossilazione non ossidativa
CO2
Acetaldeide
NAD+
NADH+H+
acetil-CoA ligasi
Gluconobacter
non ha un ciclo di Krebs
funzionale e non può
dunque ossidare l’acetato
per opera dell’enzima aldeide deidrogenasi
Ac. acetico
Acetil-CoA
Ciclo dei
TCA
CO2
CO2
In Acetobacter
il ciclo di Krebs è
inibito solo a
concentrazioni
elevate di etanolo
24

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