Valutazione del test CMV IgM BLOT nella diagnosi della infezione da Cytomegalovirus in gravidanza Gianna Mazzarelli 21/10/2014 Citomegalovirus (CMV) • Famiglia Herpesviridae – Sottofamiglia β Herpesvirinae • Tipica morfologia delle cellule infettate in vivo (citomegaliche) • Caratteristica saliente: capacità di indurre latenza Cellule citomegaliche Tipi di infezione • Infezione primaria • Infezione ricorrente (secondaria) – Riattivazione endogena – Reinfezione esogena Epidemiologia • Infezione endemica molto diffusa nella popolazione umana • Soggetti che acquisiscono infezione – 40-80% nei paesi industrializzati – la quasi totalità, nei paesi in via di sviluppo Prevalenza in Italia 70-80% Trasmissione • • • • Contatto interumano diretto con secrezioni infette Trasfusioni di sangue (o trapianti di midollo / organi) Rapporti sessuali Trasmissione verticale • Intraparto • Allattamento materno • Transplacentare Trasmissione transplacentare INFEZIONE CONGENITA CMV: principale causa di infezione congenita nei paesi sviluppati con incidenza tra lo 0.3 e il 2.3% di tutti i nati vivi In Italia incidenza di neonati infetti congenitamente: 0.57-1% Kenneson A. and Cannon M.J. 2007 Trasmissione transplacentare Infezione materna Viremia materna Infezione placenta Infezione orofaringe Eliminazione virus nel liquido amniotico Infezione endotelio fetale (Diuresi fetale) Viremia fetale Viruria fetale Replicazione virale in organi bersaglio (rene…) Donne immuni in gravidanza (40-80%) Infezione secondaria Rischio di trasmissione (1-2.2%) Sintomatici (~ 1%) Donne sieronegative in gravidanza (20-60%) Infezione primaria (1-4%) Rischio di trasmissione (~ 40%) Sintomatici Asintomatici Trasmissione più frequente (10-15%) (~ 99%) nelle ultime settimane di gravidanza Asintomatici (85-90%) (Bodèus et al. 1999, Bodèus et al. 2010, Enders et al. 2011..) In genere malattie Mortalità perinatale: 10% Danni feto-neonatali più significativi se infezione lievi e rare sequele Gravi sequele neurologiche: 70-80% primaria contratta nel I trimestre tardive (Pass et al. 2006) Stagno et al. 1986, Fowler et al. 1992, Adler 2011…. Sequele tardive (8-15%) Deficit sviluppo motorio difetti uditivi Inquadramento infezione materna Stato sierologico materno Epoca gestazionale di acquisizione della infezione Il Decreto ministeriale DPR del 1998 e le Linee guida sulla gravidanza (Linee guida: http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_pubblicazioni_1436_allegato.pdf) NON prevedono l’offerta dello screening sierologico per CMV a tutte le donne in gravidanza ma solo a quelle “in condizioni di rischio” Esiste di fatto uno “screening” spontaneo e disomogeneo nelle varie realtà regionali Diagnosi sierologica nella gestante • Esami di I livello – Screening per IgG e IgM • Esami di II livello – Test di Avidità per IgG – Test Immunoblot Test di Avidità IgG Maturazione delle IgG: 18-20 settimane Bassa <35% Moderata 35% - 45% Alta > 45% Lazzarotto et al. 1997 infezione primaria acuta o recente assenza di infezione primaria in atto o recente Bassa Avidità: Alta Avidità: L’efficacia diagnostica del test di avidità per escludere una infezione primaria nella prima parte della gravidanza è ottimale qualora il test sia effettuato entro le 12-16 S.G. Diagnosi infezione primaria acuta/recente Documentata SIEROCOVERSIONE (Gold Standard) Presenza di IgM specifiche e bassa Avidità delle IgG Diagnosi di infezione secondaria Incremento del titolo anticorpale delle IgG (in presenza o meno di IgM) e alta avidità delle IgG in soggetto precedentemente IgG positivo e IgM negativo SOGC Clinical Practice Guideline “Cytomegalovirus Infection in Pregnancy” N 240, JOGC April 2010 Infezione primaria acuta/recente Infezione secondaria IgM IgM residue / persistenti POSITIVE False positività • Interferenze / Reattività aspecifica • Cross-reazioni con altre infezioni (EBV, Toxoplasma gondii, HHV6, Parvovirus b19…) • Problemi metodologici…… Lazzarotto at al., 2004 Hum. Immunol. – Lazzarotto et al., 1998 Journal of Clinical Microbiology CMV IgM BLOT 3.0 (Dosaggio Western Blot) Dosaggio qualitativo immunoenzimatico per il rilevamento in vitro degli anticorpi IgM anti-CMV specifici, nel siero o nel plasma umano Anti-IgM controllo p 38 p 52 Antigeni utilizzati Nuove proteine di fusione ricombinanti costituite da polipeptidi immunogeni di 3 delle principali proteine del CMV (pp38 pp52 e pp150) Ditta produttrice: MP Diagnostics (MPD) p38 (43Kd) p52 (38kd) p150 (22Kd) P 150 pp150 (proteina fosforilata del tegumento virale) pp52 (proteina nucleare DNA-binding) pp38 (proteina del capside virale) Interpretazione raccomandata Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 Presenza della sola p52 Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 NEGATIVO Anti-IgM controllo INDETERMINATO p 38 POSITIVO p 52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica Solo p52 + p38 p52 + p150 (con o senza p38) INFEZIONE PRIMARIA p52 > p150 INFEZIONE PRIMARIA p52 < p150 INFEZIONE SECONDARIA p52 = p150 INDIFFERENZIATA Solo p52 POSSIBILE INFEZIONE PRIMARIA (Ripetere entro 10-30 giorni) p150 Scopo Valutare se il test CMV IgM BLOT è in grado, oltre che confermare le IgM specifiche, di fornire al clinico una informazione diagnostica aggiuntiva, nella interpretazione di una infezione da CMV in gravidanza, grazie alla differenziazione tra infezione primaria e secondaria, sulla base del diverso profilo anticorpale Studio: periodo giugno 2013 - settembre 2014 • Analizzati 87 campioni di siero con presenza di IgM Algoritmo diagnostico IgG assenti IgM presenti Test screening: CLIA Liaison (Diasorin) Test IgG Avidity: ELISA Chorus (Diesse) Risultati 1 Interpretazione raccomandata 87 campioni 23 4 NEGATIVI INDETERMINATI 60 POSITIVI Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 Presenza della sola p52 Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 Risultati 2 60 POSITIVI Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica 27 INFEZIONI PRIMARIE p52 + p38 p52 > p150 16 INFEZIONI SECONDARIE p52 < p150 17 INDIFFERENZIATE p52 = p150 Riferimento per confrontare i risultati (consenso) • Sierologia convenzionale: – risultati test di screening e test di avidità per IgG (inclusi quelli relativi ad esami precedenti/successivi) • (Eventuali risultati PCR Real Time per CMV DNA) • (Eventuali dati clinici) 23 NEGATIVI per CMV IgM BLOT Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 CONFRONTO con CONSENSO • 10 Falsi positivi al test di screening • 13 “Code” di infezioni primarie ?? 10 FALSI POSITIVI SCREENING K- pz K+ Anti-IgM contr. Paziente 19/07/2013: 25 S.G. IgG IgM (U/ml) (U/ml) 17/06/2013 N 23 19/07/2013 N 22 Data S.G. * : Settimane di Gestazione CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 CMV IgM BLOT p 38 interpretazione p 52 NEG p 150 10 K+ FALSI POSITIVI SCREENING pz Anti-IgM contr. Data IgG IgM (U/ml) (U/ml) 19/06/2014 N 124 26/06/2014 N >140 CMV IgM BLOT interpretazione NEG p 38 p 52 p 150 20/07/2014 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 N CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 >140 13 K+ IgM RESIDUE (“Code”) ???? pz Anti-IgM contr. Paziente 03/02/14 10 S.G. p 38 p 52 Data 03/02/2014 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM BLOT IgG IgM IgG Avidity (U/ml) (U/ml) (%) interpretazione 83 NEG 85 22 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 p 150 27 INFEZIONI PRIMARIE per CMV IgM BLOT CONFRONTO con CONSENSO •• 9 Infezioniprimarie primarieacute/recenti acute / recenti 10 Infezioni •• 10 10 •• 3 4 •• 1 3 Infezioni 18-20 weeks) Infezioni passate primarie(oltre non recenti ?? Cross-reazioni Cross-reazioni (EBV) (EBV) ?? Interpretazione Interpretazione discordante discordante p52 + p38 p52 > p150 3 K+ SIEROCOVERSIONI Anti-IgM contr. Paziente 21/02/2014: 10 S.G. Data IgG IgM (U/ml) (U/ml) 21/02/14 N 53 28/02/14 30 90 IgG Avidity (%) IgM BLOT (bande) p52 > p150 pz IgM BLOT interpretazione POS IgM BLOT indicazione diagnostica Infezione Primaria p 38 p 52 18 p 150 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 4016 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 7 PRIMARIE RECENTI K+ pz Anti-IgM controllo Paziente 02/12/2013: 32 S.G. Data 02/12/13 IgG IgM (U/ml) (U/ml) IgG Avidity 72 81 23 IgM BLOT (bande) IgM BLOT interpretazione IgM BLOT indicazione diagnostica p52 > p150 + p38 POS Infezione Primaria (%) p 38 p 52 p 150 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 3397 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 10 K+ PRIMARIE NON RECENTI ???? pz Anti-IgM contr. Paziente 23/04/2014: 16 S.G. p 38 Data 23/04/14 IgG Avidity IgM BLOT IgM BLOT IgM BLOT (U/ml) (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica 26 72 p52 > p150 POS Infezione Primaria IgG IgM (U/ml) 84 p 52 p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 4 K+ CROSS-REAZIONI CON EBV ???? Anti-IgM contr. CMV Data IgG IgM (U/ml) (U/ml) pz IgG Avidity IgM BLOT (%) (bande) IgM BLOT interpretazione IgM BLOT indicazione diagnostica p 38 07/07/14 79 50 87 p52 > p150 POS Infezione Primaria p 52 EBV Data Monotest IgG IgM (U/ml) (D.O.) VCA IgM EBNA IgG p 150 07/07/14 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 +++ 34 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 POS POS Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 NEG EBV IgG (ELISA) Negativo <25 Dubbio 25-50 POS Deb. 50-100 Positivo >100 3 K+ CASI DISCORDANTI pz Anti-IgM contr. Data IgG IgM (U/ml) (U/ml) IgG Avidity IgM BLOT (%) (bande) IgM BLOT interpretazione IgM BLOT indicazione diagnostica p 38 10/10/13 71 NEG 26/03/14 161 51 p 52 73 p52 > p150 + p38 POS Infezione Primaria p 150 Fattore reumatoide Negativo IgM EBV Negative CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 16 INFEZIONI SECONDARIE per CMV IgM BLOT CONFRONTO con CONSENSO • 11 •5 Infezioni secondarie ??? Interpretazione discordante p52 < p150 11 K+ SECONDARIE ???? pz Anti-IgM contr. Paziente 20/03/14: 13 S.G. p 38 Data 20/03/14 IgG IgM (U/ml) (U/ml) 116 21 IgG Avidity (%) IgM BLOT (bande) IgM BLOT interpretazione IgM BLOT indicazione diagnostica 78 p52 < p150 POS Infezione Secondaria p 52 p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 11 K+ SECONDARIE ???? pz Anti-IgM contr. Paziente 31/12/13: 20 S.G. p 38 Data 31/12/13 IgG Avidity IgG IgM (U/ml) (U/ml) (%) 106 22 53 IgM BLOT (bande) IgM BLOT interpretazione IgM BLOT indicazione diagnostica p52 < p150 + p38 POS Infezione Secondaria p 52 p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 5 K+ CASI DISCORDANTI pz Anti-IgM contr. Paziente 05/08/13 18 S.G. p 38 Data 05/08/13 IgG IgM IgG Avidity IgM BLOT IgM BLOT (bande) IgM BLOT interpretaz (U/ml) (U/ml) (%) 90 48 27 p52 < p150 POS Infezione Secondaria indicazione diagnostica p 52 p 150 Stessi dati nel 07/2013 in altra sede CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 5 K+ CASI DISCORDANTI pz Anti-IgM contr. Data 01/07/14 IgG IgM (U/ml) (U/ml) IgG Avidity IgM BLOT (%) (bande) NEG 78 p52 < p150 IgM BLOT interpretazione 19 >140 NC* p52 < p150 + p38 NC * : non calcolabile per basso titolo di IgG CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 indicazione diagnostica POS Infezione secondaria POS Infezione secondaria + p38 14/07/14 IgM BLOT p 38 p 52 p 150 5 K+ CASI DISCORDANTI Paziente 08/03/14 25 S.G. Data 08/03/14 Anti-IgM contr. IgG IgM IgG Avidity IgM BLOT (U/ml) (U/ml) (%) (bande) 69 50 9 p52 < p150 IgM BLOT interpretaz IgM BLOT indicazione diagnostica POS Secondaria + p38 19/03/14 70 58 10 pz p52 < p150 p 38 p 52 POS Secondaria + p38 02/04/14 70 51 p 150 16 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: NEG CMV DNA (PCR Real Time) su urina: POS <748 gen/ml Gennaio: sintomi CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 17 INDIFFERENZIATE p52 = p150 per CMV IgM BLOT CONFRONTO con CONSENSO • 9 Infezioni primarie acute/recenti • 6 Infezioni primarie non recenti o secondarie ?? • 2 Cross-reazioni ?? SIEROCOVERSIONE K+ pz Paziente 07/04/2014: 9 S.G. Data 17/04/12 07/04/14 IgG IgM (U/ml) (U/ml) N N N IgG Avidity IgM BLOT (%) (bande) 129 11/04/04 14 122 23/04/14 35 102 IgM BLOT interpretaz. IgM BLOT p52 = p150 + p38 POS Indifferenziata p52 = p150 + p38 POS indicazione diagnostica Indifferenziata 6 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 p 38 p 52 p 150 11/04/2014: CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 4016 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 Anti-IgM contr. Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 Siero intero K+ Anti-IgM controllo IgM BLOT Interpretazione IgM BLOT p 38 Indicazione diagnostica p 52 p52 = p150 + p38 POS Indifferenziata p52 > p150 + p38 POS Infezione primaria 07/04/2014 9 S.G. IgM BLOT Siero intero Siero Dil 1:10 (bande) p 150 Siero Dil. 1:10 4 INDETERMINATI Solo p52 per CMV IgM BLOT CONFRONTO con CONSENSO • 2 Infezioni primarie non recenti o secondarie ?? • 2 Cross-reazioni ?? CROSS-REAZIONE CON Toxoplasma gondii ??? K+ pz Paziente 16/05/14 11 S.G. CMV Data IgG IgM (U/ml) (U/ml) Anti-IgM contr. IgG Avidity (%) IgM BLOT IgM BLOT interpretaz diagnostica (bande) 16/05/14 67 21 89 INDETER MINATA p52 IgM BLOT indicazione Possibile Infezione primaria p 38 p 52 TOXO Data IgG IgM (UI/ml) (UA/ml) IFA Ig Tot IFA IgM IgA IgG Avidity (%) p 150 16/05/14 31 154 1:1024 1:400 Pos 6 (600 UI) CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio 12-14 Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio 18-22 Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media 30-40 Avidity alta >40 TOXO IgG (CLIA) Negativo <7.2 Dubbio 7.2-8.8 Positivo >8.8 TOXO IgM (CLIA) Negativo <8 Dubbio 8-10 Positivo >10 Interpretazione raccomandata Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 Presenza della sola p52 Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 NEGATIVO Anti-IgM controllo INDETERMINATO p 38 POSITIVO p 52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica Solo p52 + p38 p52 + p150 (con o senza p38) INFEZIONE PRIMARIA p52 > p150 INFEZIONE PRIMARIA p52 < p150 INFEZIONE SECONDARIA p52 = p150 INDIFFERENZIATA Solo p52 POSSIBILE INFEZIONE PRIMARIA (Ripetere entro 10-30 giorni) p 150 Come interpretare??? Anti-IgM contr. p 38 p 52 Cut-off di riferimento? Lettore automatico? p 150 Scopo Valutare se il test CMV IgM BLOT è in grado, oltre che confermare le IgM specifiche, di fornire al clinico una informazione diagnostica aggiuntiva, nella interpretazione di una infezione da CMV in gravidanza, grazie alla differenziazione tra infezione primaria e secondaria, sulla base del diverso profilo anticorpale Conclusioni 1 Test CMV IgM BLOT utile per confermare le IgM specifiche Test CMV IgM BLOT non sempre in grado di fornire una informazione diagnostica aggiuntiva Limitarsi alla interpretazione raccomandata del profilo evitando di fornire l’indicazione diagnostica sulla base della interpretazione consigliata Conclusioni 2 Possibilità di datare una infezione solo grazie al valore della Avidità delle IgG Test Avidity: ritenuto il test più affidabile in commercio per idendificare una infezione primaria in gravidanza se eseguito entro le 16 S.G. Consigliato non usare solo test IgG Avidity per interpretazione IgM POS Test Avidity: limiti • Eterogeneità e mancanza di standardizzazione tra Kit commerciali •Difficoltà di interpretare valori intermedi • Problematiche su pazienti con IgG di basso titolo •Ritardo maturazione avidità in donne in gravidanza • Variabilità biologica nella maturazione della avidità Strategia diagnostica Utilizzo combinato di più test avanzati in epoca gestazionale corretta Algoritmo diagnostico consigliato Test di screening per IgG e IgM CMV IgM BLOT + CMV IgG Avidity < 30% delle donne in gravidanza con IgM pos al test di screening hanno un profilo sierologico di infezione primaria acuta/recente Grazie per l’attenzione!!!
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