IDENTIFICAZIONE di PROTEINE APPROCCIO GENERALE ALLO STUDIO PROTEOMICO 1a Tappa 9 Preparazione del campione 9 Produzione di gel 2D 2a Tappa 9 Analisi delle immagini Visualizzazione – Manipolazione dell’immagine - Identificazione e quantificazione degli spot Comparazione delle immagini - Analisi dei dati - Collegamento a banche dati 3a Tappa 9 9 9 9 9 9 9 Estrazione degli spot di interesse Eluizione della proteina (raramente) Digestione proteolitica in gel della proteina Estrazione dei peptidi Analisi MS Comparazione dei risultati con databases Identificazione della proteina 4a Tappa Studi sulla struttura e sulle modificazioni della proteina 5a Tappa Analisi della funzione ……….. Identificazione di una proteina con Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Siti di taglio della tripsina: Arg and Lys Proteina Digestione K K R R ..... m3 Peptide mass fingerprint con MALDI-TOF MS m1 m2 m4 m/z Da Ricerca in Database Identificazione della proteina m1 m2 m3 ...... mr exper. mr theor. 902.546 971.477 1234.690 ........ 902.535 Da 971.447 Da 1234.690 Da ........... Diff. Residues 0.012 0.030 0.000 ........ 124-131 188-195 136-146 ........ Peptide sequence from the database GLFIIDPK EYFEAANK HITINDLPVGR DIGESTIONE ENZIMATICA Enzimi proteolitici più usati: ENZIMA Tripsina Chimotripsina Glu-C (SP V8 proteasi)* SPECIFICITA’ DI TAGLIO /K-, /R-, \P /W-, /Y-, /F-, \P /E-, /D-, \P Lys-C /K-, \P Asp-N /D- * Il legame in cui è coinvolto l’Asp viene tagliato solo in tampone fosfato Può essere fatta anche una proteolisi chimica. Es: BROMURO DI CIANOGENO (BrCN). Sito di taglio: /M- Per aumentare l’efficienza del taglio proteolitico è importante ridurre ed alchilare i ponti disolfuro s s R s s riduzione s s s s s s s s R R R alchilazione s R R s s Digestione enzimatica R R s DIGESTIONE “IN GEL” 9 ISOLARE LO/GLI SPOT 9 ELIMINARE COLORANTE, SDS E ALTRI CONTAMINANTI presenti nel gel, che potrebbero interferire con il processo di digestione: • Lavaggio in acetonitrile 50% • Essiccamento • Reidratazione ed equilibratura nel tampone di digestione 9 RECUPERARE I PEPTIDI: • Diffusione passiva • Estrazione in ambiente acido (TFA 1%) con ultrasuoni n.b. Difficile il recupero di peptidi con p.m.>5 kDa! ANALISI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA Spettro di massa di una miscela peptidica ottenuta per digestione proteolitica di una proteina: ANALISI DEI PESI MOLECOLARI DEI PEPTIDI OTTENUTI PER DIGESTIONE SPECIFICA DI UNA PROTEINA L’identificazione di una proteina dipende dai seguenti parametri: 9Accuratezza nella determinazione della massa dei frammenti 9Numero delle masse sottomesse per l’interrogazione del database 9Distribuzione delle masse 9Numero delle masse che sono in accordo fra quelle sperimentali e quelle teoriche per la proteina del database 9Dimensione del database di sequenze proteiche 9Numero delle modificazioni della proteina considerate SPETTROMETRIA DI MASSA Tecnica utilizzata per la determinazione del peso molecolare delle molecole generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni separati SPETTRO DI MASSA : mappa dell’ abbondanza relativa degli ioni prodotti in funzione del rapporto massa/carica (m/z) Requisiti essenziali per ottenere uno spettro di massa: ¾ Produrre ioni in fase gassosa ¾ Accelerarli ad una velocità specifica ¾ Proiettarli in un adatto analizzatore di massa ¾ Rivelare le molecole cariche che giungono al detector Tecniche di ionizzazione Analizzatore • Impatto Elettronico (EI) • Settore • Ionizzazione Chimica (CI) • Quadrupolo • Bombardamento con atomi • Trappola ionica “veloci” (FAB) • Tempo di volo (TOF) • Ionizzazione/Desorbimento di • “Trasformata di Fourier” Campo (FI/FD) (FTMS) • Ionizzazione per Desorbimento Laser Assistito da Matrice (MALDI) • Ionizzazione Electrospray (ESI) Metodi di ionizzazione comunemente usati per l’analisi di proteine: EI: Electron impact Ionisation È la modalità più classica, tuttora molto utilizzata. È una ionizzazione ‘hard’. Il campione deve essere allo stato gassoso. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC, anche HPLC. Sorgente di ionizzazione ad Impatto Elettronico Filamento di rutenio o tungsteno ricoperto di ossido di torio Molecole neutre ed in movimento casuale ee- Entrata campione ee- + + + + + eee- Analizzatore ee- Lenti focalizzatrici Repulsore +20 eV + + + Trappola +70 eV -4kV La ionizzazione generalmente avviene: per espulsione di un elettrone (generazione di ioni positivi) e(( + )) ione molecolare o per cattura di un elettrone (generazione di ioni negativi) e(( )) ione molecolare Se la quantità di energia assorbita dalla molecola è elevata si avrà una decomposizione della molecola in frammenti di massa inferiore e( (( ( + + ) ) )) ione molecolare + + Ioni frammenti + IONIZZAZIONE CHIMICA 9 Si basa essenzialmente su una sorgente EI. 9 La sorgente viene riempita con metano (CH4) o ammoniaca (NH3). 9 Si formano le specie CH5+ e NH4+, potenti donatori di protoni allo stato di vapore. 9 Ionizzazione dell’analita per protonazione (dopo interruzione del fascio di elettroni). 9 Utilizzato nello studio di farmaci e dei loro metaboliti secondari. Lo ione molecolare del metano, generato per impatto elettronico, puo' reagire con l'eccesso di metano: . CH + + 2e- CH4 + eCH4 + CH4 4 .+ CH3 + CH5+ Il catione CH5+ è una specie instabile e si comporta come un acido forte. Può quindi protonare con una reazione acidobase praticamente qualsiasi molecola organica. Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione molecolare MH+ con un bassissimo eccesso di energia vibrazionale, e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti. FAB “Fast Atom Bombardment” Il campione viene prima dissolto in una matrice liquida (es. glicerolo). La superficie liquida viene bombardata da un fascio di atomi ad alta energia cinetica (xenon o argon). Le molecole di campione vengono ionizzate, per protonazione o deprotonazione, ed accelerate nell’analizzatore in fase gassosa. Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a p.m. ≈ 5000). Ionizzazione “soft’”. Quantita’ minima: ≈ 20 picomoli Solitamente abbinato ad ANALIZZATORI A SETTORE Ionizzazione FAB: Si adatta molto bene all’analisi della maggior parte delle sostanze biologiche (peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri). Le molecole vengono mescolate ad una matrice. introdotte in soluzione Le molecole vengono bombardate da atomi che possiedono una elevata energia cinetica. Si possono ottenere sia ioni positivi che ioni negativi. L’introduzione di questa tecnica nei primi anni ‘80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina.
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