Esperimen) di trasfezione rappresenta)vi dei seguen) metodi: -‐ Ele7roporazione -‐ Escort IV -‐ Chitosano Sono riporta) i risulta) dell’analisi FACS di cellule HEK293 trasfe7ate con il plasmide pMAX (gene reporter GFP). Campioni esamina): linea cellulare, cellule non tra7ate; mock, cellule tra7ate con agente trasfe7ante (senza plasmide); cellule tra7ate con plasmide+agente trafe7ante. Al FACS sono analizza) I seguen) parametri: -‐ Fluorescenza verde dovuta alla produzione di GFP (asse Y, FL1); -‐ Fluorescenza rossa, IP (ioduro di propidio, ass X, FL3) che si intercala nel DNA. Poichè solo le cellule con una membrana cellulare danneggiata sono permeabili a questo colorante, la posi)vità a IP iden)fica le cellule morte. Parametri fisici rileva) al FACS SSC (side sca7er), misura la rafrazione e riflessione FSC (forward sca7er), misura la diffrazione Esempio di una analisi FACS L’analis al FACS di campioni di cellule di qualsiasi natura prevede due fasi: 1) analisi delle cara7eris)che fisiche della popolazione cellulare (FSC, asse X; SSC, asse Y). 2) analisi dei marcatori fluorescen) che si intende seguire (IP, asse X, GFP, asseY). Si procede con l’analisi FSC ed SSC e successivamente, dopo aver selezionato la popolazione di interesse (vedi area selezionata nel grafico A) si analizzano le fluorescenze nella stessa (vedi grafico B). A B linea cellulare Mock escort Escort Legenda UL, upper le` è GFP+, IP-‐ UR, upper right è GFP+, IP+ LL, low le` è GFP-‐, IP-‐ LR, low right è GFP-‐, IP+ elettroporazione Mock Chitosano Chitosano risulta) o7enu) a 48 ore dalla trasfezione 100 90 80 %cellule 70 60 50 40 30 20 10 0 linea cellulare mock escort escort mock chitosano chitosano ele7roporazione GFP+IP-‐ 0,02 0,03 11,57 0,05 13,13 21,12 GFP+IP+ 0 0 1,37 0,04 2,08 0,62 GFP-‐IP-‐ 86,33 86,08 66,66 84,83 72,49 74,83 GFP-‐IP+ 13,64 13,89 20,4 15,08 12,3 3,42 Conclusioni. Dei tre metodi esamina), l’ele7roporazione è risultata più efficiente rispe7o a Escort e Chitosano. La mortalità cellulare dei campioni mock è paragonabile a quella della linea cellulare indicando che gli agen) trafe7an) non mostrano tossicità. Anche le cellule trasfe7ate con il DNA non mostrano incremen) significa)vi di mortalità ad eccezzione di un leggero aumento di mortalità nella popolazione tra7ata con Escrot-‐pMAX.
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