Lezioni Parte7_2014_15

AA 2013-2014
Metodi spettroscopici per le
Biotecnologie
Spettroscopia UV-VIS 2
Dott. Alfonso Zoleo
Riepilogo:
E
LUMO
S1
S0
HOMO
Principio di Franck-Condon: la
transizione elettronica è così veloce,
che i nuclei della molecola non si
spostano immediatamente dopo la
transizione (transizione verticale)
LUMO
HOMO
Re Re
Stato elettronico
eccitato (S1)
Stato elettronico
fondamentale (S0)
Riepilogo:
Transizioni vibroniche:
Prima della transizione elettronica:
-Le molecole si trovano nello stato elettronico
fondamentale (l’unico praticamente popolato a
temperatura ambiente)
- Le molecole si trovano nello stato vibrazionale
fondamentale (l’unico abbastanza popolato a
temperatura ambiente)
Dopo la transizione:
- Le molecole modificano sia lo stato elettronico
che vibrazionale: partono tutte da v=0 dello stato
S0, ma arrivano a stati v=0 o v>0 di S1
- -La probabilità di una transizione da v=0 di S0 a
v’ di S1 è P=S2 dove S è:
Integrale di sovrapposizione tra la funzione
d’onda vibrazionale fondamentale di S0 e la
funzione d’onda vibrazionale di numero quantico
v’ dello stato S1
S = ∫ψ v=0ψ v ' dR
“Fattore di Franck-Condon”
Riepilogo:
Le transizioni vibroniche sono responsabili delle larghe bande degli spettri UV-VIS
Re=Re’
Se la configurazione nucleare di
equilibrio per lo stato elettronico eccitato
non è diversa dallo stato fondamentale (Re
circa uguale a Re’), la banda elettronica è
suddivisa in sottobande vibrazionali di
intensità decrescente
Re>Re’
Se la configurazione nucleare di
equilibrio per lo stato elettronico eccitato
è più “rilassata” (Re > Re’), la banda
elettronica è suddivisa in sottobande
vibrazionali con un andamento a massimo
In ogni caso, la transizione 0-0 (cioè da v=0 di S0 a v’=0 di S1) è sempre la transizione a più
bassa energia (= lungh. d’onda maggiore) nello spettro di assorbimento. La distanza tra le
subbande vibroniche ci dà la frequenza di vibrazione dello stato eccitato
Esempio
Spettro di assorbimento antracene in cicloesano
Dallo spettro, si determinano i seguenti valori
per le bande vibroniche
0-0 : 376 nm
0-1: 356 nm
0-2: 339 nm
0-3: 323 nm
Calcolare il numero d’onda (in cm-1) del
modo vibrazionale eccitato nello stato S1.
Per prima cosa, converto le lunghezze d’onda delle transizioni in numeri d’onda.
Dopodiché, faccio le differenze tra la 0-0 e la 0-1, e tra la 0-1 e la 0-2.
ν~0−0,el =
1
λ0 − 0
ν~0,vib = ν~0−1,el
1
1
1
1
1
= 26596cm −1 ;ν~0−1,el =
=
= 28090cm −1 ;ν~0−2,el =
=
= 29499cm −1
376nm
λ0−1 356nm
λ0−2 339nm
− ν~
= 28090 − 26596 = 1494cm −1 ;ν~ = ν~
− ν~
= 29499 − 28090 = 1409cm −1
=
0 −0,el
1,vib
0 − 2 ,el
0 −1,el
La frequenza di vibrazione determinata dalla differenza 0-0 e 0-1 è 1494 cm-1, mentre la frequenza di vib.
determinata dalla diff. 0-1 e 0-2 è di 1409 cm-1 circa. La differenza di frequenza osservata è dovuta ad
anarmonicità. In media, il modo ha frequenza (1494+1409)/2 circa 1450.
Ιn generale, una molecola di N atomi possiede 3N-6 modi di vibrazione: qual è il
modo vibrazionale che si osserva negli spettri di assorbimento?
Durante la transizione elettronica è possibile che un modo vibrazionale sia quello
principalmente influenzato dalla transizione elettronica, cioè la costante di forza di
quella particolare configurazione nucleare è quella che varia di più: in tal caso si hanno
subbande vibroniche associate a quel modo vibrazionale.
Spesso più modi di vibrazione sono influenzati, e quindi eccitati, durante la transizione
elettronica: inviluppo di Franck-Condon.
1.8
1.5
Benzene
in cicloesano
1.6
1.4
1.4
1.3
Naftalene in cicloesano
1.2
1.2
1.1
Assorbanza
Α
1.0
0.8
0.6
0.4
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.2
0.3
0.0
0.2
0.1
-0.2
220
230
240
250
260
270
280
290
300
0.0
240 250 260 270 280 290 300 310 320 330
nm
Più subbande vibroniche nello spettro del naftalene
nm
Effetto del solvente
L’interazione con le molecole di solvente causa un allargamento delle righe,
rispetto a quanto si osserverebbe se le molecole del cromoforo fossero in fase
gassosa. L’allargamento può condurre a coalescenza, cioè a perdita della struttura
vibrazionale della banda => un’unica banda di assorbimento
A
A
ν
ν
Questo spiega perché le subbande vibroniche talora si osservano e talora no
Effetto del solvente
Fattori che determinano l’allargamento delle righe vibroniche nei solventi:
- Intorno delle molecole differente da molecola a molecola: Ogni molecola è circondata da
molecole di solvente, ma la configurazione “ideale” del solvente attorno alla molecola, cioè quello che corrisponde
all’interazione soluto-solvente più favorevole, è disturbato dall’agitazione termica: in un certo istante, la
configurazione “ideale” è solo la più probabile (distribuzione di Boltzmann)
Vuoto
E
-
+ + -
S0
+
-
+ + -
“ideale”
+ -
+
Solvente
+ -
+
-
“non ideale”
Ci sono molte configurazioni “non ideali”, e quindi molti stati S0-solvente ad energia più alta
Vuoto
S0
Solvente
S0-solvente
+ -
Effetto del solvente
Fattori che determinano l’allargamento delle righe vibroniche nei solventi:
La transizione elettronica è molto più veloce (10-15 s) del riarrangiamento delle molecole del solvente: la molecola
nello stato eccitato S1 viene a trovarsi in una configurazione di molecole di solvente con cui potrebbe interagire più
favorevolemente o meno favorevolmente rispetto allo stato fondamentale. Ad ogni modo, la separazione dei livelli
di interazione S1-solvente è diversa che in S0-solvente
Questo conduce ad un allargamento
inomogeneo della riga della transizione
vibronica, dovuto ai differenti
microambienti di ogni molecola di
soluto (cromoforo)
S1-solvente
S1
E
E
1
2
3
3
2
1
S0
S0-solvente
vuoto
solvente
Maggiore è l’interazione
soluto-solvente, maggiore è
l’allargamento!
Effetto del solvente
Fattori che determinano l’allargamento delle righe vibroniche nei solventi:
- Collisioni molecolari:Ogni molecola di soluto collide con altre molecole: in fase condensata questi urti
sono frequenti e conducono ad un allargamento omogeneo dovuto al principio di indeterminazione di Heisemberg:
S1
δE
δE ≈
!
τ
Le collisioni limitano il tempo di vita dello
stato elettronicamente e vibrazionalmente
eccitato, causando allargamento
In fase gas, gli spettri sono caratterizzati da
righe strette, perché non ci sono gli effetti di
allargamento di riga omogeneo e inomogeneo
dovuti al solvente (in gas le collisioni sono
poco frequenti).
Quindi, per avere maggiore
risoluzione dobbiamo usare la fase
gas!
S0
vuoto
solvente
Effetto del solvente
La stabilizzazione da parte del solvente dello stato S0 e dello stato S1 è differente: il solvente può avere un
effetto destabilizzante per lo stato S1, come in A o stabilizzante, come in B
B
A
S1-solvente
S1
E
E
S0
S0-solvente
vuoto
S1
solvente
S1-solvente
E
E
S0
S0-solvente
vuoto
solvente
Come conseguenza, lo spettro di assorbimento può presentare la banda spostata a lunghezze d’onda minori
(A) o maggiori (B)
Effetto del solvente
Si osserva che le transizioni π→π* si spostano verso lunghezze d’onda maggiori
passando da solventi apolari (meno interagenti) a polari (più interagenti). Le
transizioni n→π* fanno l’opposto: vanno verso lunghezze d’onda minori
Passando da cicloesano (apolare) a
etanolo (polare), nel benzofenone la
transizione π→π* si sposta a
lunghezze d’onda maggiori, mentre
n→π* si sposta a lunghezze d’onda
minori
Questo comportamento è una conseguenza della forma degli orbitali
molecolari interessati dalla transizione!
Effetto del pH
Il pH può avere un effetto rilevante sull’assorbimento di gruppi specifici
OH
O
+ H 2O
λmax= 270 nm
εmax= 1450 M-1cm-1
+ H3O+
λmax= 287 nm
εmax= 2600 M-1cm-1
Nell’anione, aumenta la delocalizzazione degli elettroni π per effetto della
carica negativa: questo risulta in una minore separazione HOMO-LUMO
NH3+
NH2
+ H2O
+ OH-
λmax= 280 nm
εmax= 1430 M-1cm-1
λmax= 254 nm
εmax= 169 M-1cm-1
Nel catione, la delocalizzazione degli elettroni π diminuisce: questo risulta in
una maggiore separazione HOMO-LUMO
Effetto del pH
Punti isosbestici
La dipendenza dal pH degli spettri di assorbimento delle specie protiche rende
complicato applicare la relazione di Lambert-Beer.
La tirosina è un aminoacido che ha un forte assorbimento nei peptidi. Insieme al
triptofano è l’aminoacido che più determina gli assorbimenti nei peptidi
H
H
OH
-OOC
NH3
O- + H+
-OOC
NH3
Punti isosbestici
Effetto del pH
Punti isosbestici
Il punto isosbestico rappresenta il punto dove due specie in equilibrio hanno la stessa
assorbività molare. Al punto isosbestico si può misurare l’assorbanza totale delle
specie in equilibrio
A=ε1 bC1+ε2 bC2=ε b (C1+C2)
1
2
Al punto isosbestico ε1=ε2=ε
Si consideri un peptide contenente tre
tirosine e nessun triptofano: si ottiene lo
spettro in figura.
Qual è la concentrazione del peptide ?
Quale il pH?
ε(274 nm, isosbestico) ca. 1000 cm-1
Spettri UV-VIS di molecole biologiche
INTERAZIONI TRA CROMOFORI
Fino a questo momento, abbiamo considerato l’influenza del solvente su
singoli cromofori. Ma i cromofori possono interagire fra loro, cambiando lo
spettro di assorbimento.
Le proteine contengono molti gruppi amide. Se più
gruppi assorbono la radiazione, i dipoli di transizione
che si generano durante l’assorbimento nei gruppi
amide interagiscono fra loro per interazione
coloumbiana (accoppiamento eccitonico)
- 3 - 5 V = ( µ 1 µ 2 ) R 12 - 3 ( µ 1 ⋅ R 12 )( R 12 ⋅ µ 2 ) R 12 L’interazione tra i momenti di dipolo di transizione dipende
dall’orientazione relativa e dalla distanza tra i dipoli.
Spettri UV-VIS di molecole biologiche
INTERAZIONI TRA CROMOFORI
dimero
monomero
Ψ+
ϕa
2V
Ψ-
ϕ0
Ψ0
Consideriamo un dimero formato da
due cromofori identici: l’interazione
dei dipoli di transizione determina la
formazione di un sistema a tre livelli.
Un livello fondamentale e due livelli
eccitati, separati da un energia V di
accoppiamento eccitonico. Quindi, in
assenza di acc. eccitonico avevamo
tante due transizioni degeneri, mentre
con acc. ecc. abbiamo due transizioni a
diff. energia
Lo spe-ro eccitonico è diverso a seconda della geometria rela:va dei due monomeri che cos:tuiscono il dimero: se i dipoli di transizione sono allinea:, abbiamo che la coppia di di livelli eccita: è degenere, ma spostata ad energia più alta rispe-o al monomero: si osserva un’unica riga ad energia più alta (blue-‐shiD). Se sono testa-‐coda, la coppia è degenere ma ad energia più bassa (unica riga a en. Più bassa, red shiD). Se sono obliqui, la coppia è non degenere, e si osservano quindi due righe, una ad en. più alta ed una più bassa Spettri UV-VIS di molecole biologiche
EFFETTI STRUTTURALI SULL’INTERAZIONE FRA CROMOFORI
Nell’α-elica le due transizioni
π→π* hanno momenti dipolari di
transizione perpendicolari: l’uno
parallelo all’asse dell’elica, l’altro
perpendicolare. Le lunghezze
d’onda sono piuttosto diverse: 210
nm e 190 nm
Spettri UV-VIS di molecole biologiche
EFFETTI STRUTTURALI SULL’INTERAZIONE FRA CROMOFORI
Nel β-sheet le transizioni π2→π3*
di gruppi peptidici vicini hanno i
momenti dipolari di transizione
molto più allineati: le due
transizioni sono quasi degeneri e
ne risulta una banda unica.
Nel random coil tansizioni
π2→π3* di gruppi peptidici
vicini hanno i momenti
dipolari orientati in modo
random, e la situazione è
“intermedia”.
Questo ha una conseguenza
sugli spettri UV-VIS
Spettri UV-VIS di molecole biologiche
ACIDI NUCLEICI
I cromofori sono le basi A, G, C, U. Gli zuccheri ed i gruppi fosfato hanno
transizioni ad energia elevata (λ < 150 nm)
Le basi azotate hanno struttura planare con sistema π delocalizzato
Se l’azoto ha tre legami σ, il
doppietto elettronico non
condiviso è in un orbitale pz e
partecipa al sistema π
Se l’azoto ha due legami σ, il
doppietto elettronico non
condiviso è in un orbitale sp2 e
è di non legame (tipo n)
Spettri UV-VIS di molecole biologiche
Acidi nucleici
Le basi azotate sono orientate parallelamente le une alle altre negli acidi
nucleici
Il momento dipolare di transizione è orientato
lungo il piano molecolare
Come nelle proteine, le transizioni dominanti per intensità sono le transizioni
π→π*
Le singole basi azotate hanno spettri di assorbimento UV-VIS abbastanza
simili, caratterizzati da un’unica banda con massimo a 270 nm
Le singole basi azotate hanno
spettri di assorbimento UV-VIS
abbastanza simili, caratterizzati
da una banda con massimo a
270 nm.
Lo spettro dell’acido nucleico
risulta dalla media pesata dei
contributi dei vari nucleotidi
componenti. Ne risulta
un’intensa banda a 270 nm
Lo spettro del DNA è dominato da una
banda a 260 nm, non strutturata. La
caratteristica principale è la diminuzione
dell’intensità del DNA (mediata sul numero
dei nucleotidi) rispetto a quella dei singoli
nucleotidi. L’effetto è noto come
IPOCROMISMO del DNA
In seguito a denaturazione, l’intensità della
banda a 260 nm cresce (doppia elica ->
singola elica -> singoli nucleotidi)
L’ipocromismo deriva dall’interazione eccitonica tra le basi azotate: l’interazione tra i
momenti dipolari di transizione in basi azotate ordinate determina una diminuzione del momento
dipolare di transizione globale
Se i dipoli di transizioni sono
allineati così, si ha effetto
ipocromico (DNA strutturato)
Se i dipoli di transizione fossero allineati testa-coda, si avrebbe IPERCROMISMO
nella struttura ordinata
Assorbanza
Riscaldando il DNA si ha un
brusco aumento dell’intensità
della banda a 260 nm fra 80 °C e
90 °C, in corrispondenza della sua
denaturazione termica (fusione).
La fusione avviene ad una
temperatura abbastanza precisa,
indicata come Tm. Il processo è
irreversibile
DNA
raffreddamento
riscaldamento
T

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